Применение штамма бактерий Pseudomonas citronellolis для стимуляции роста растений-фиторемедиантов ячменя и клевера в почве, загрязненной нефтью или имазетапиром Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 A01N63/27 C12R1/38 

Изобретение относится к области экологии и биотехнологии, предназначено для очистки почвы от загрязнения нефтью и гербицидами на основе имазетапира, стимуляции роста растений-фиторемедиантов и представляет собою штамм бактерий Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D).

Нефть и средства химической защиты растений входят в число основных загрязнителей окружающей среды (Robertson L.W., Hansen L.G. PCBs: Recent advances in environmental toxicology and health effects. - University рress of Kentucky, 2015. 496 р.; Sun S., Sidhu V., Rong Y., Zheng Y. Pesticide pollution in agricultural soils and sustainable remediation methods: A review // Curr. Pollution Rep. 2018. V. 4. P. 240-250). Углеводороды и гербициды, на которые приходится большая часть мирового производства пестицидов, отрицательно воздействуют на микробиоценоз почвы и ингибируют рост и развитие растений (Wołejko E., Jabłońska-Trypuć A., Wydro U., Butarewicz A., Łozowicka B. Soil biological activity as an indicator of soil pollution with pesticides - A review // Appl. Soil Ecol. 2020. V. 147. Article 103356. https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2019.09.006). Наиболее эффективным с экономической и экологической точек зрения способом очистки экосистем от нефти и гербицидов, особенно таких, которые медленно разлагаются в почве (например, гербициды на основе имазетапира) является микробная биодеструкция. Для ускорения процесса биодеструкции загрязнителей и восстановления почвы микроорганизмы применяют совместно с растениями-фиторемедиантами. Однако их биомасса может снижаться под воздействием неблагоприятных факторов среды. Поэтому при разработке технологий биоремедиации почв, загрязненных нефтью и гербицидами, следует уделять особое внимание штаммам, способным к разложению этих поллютантов и усилению роста растений-фиторемедиантов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas citronellolis 48-У, обладающий высокой скоростью утилизации нефти и дизельного топлива (Патент РФ № 2489484). Недостатком его является отсутствие способности к биодеструкции имазетапира и стимуляции роста и развития растений.

Известен штамм бактерий Рseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501Д для биодеградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в условиях загрязнения почв солями никеля (Патент РФ № 2396339). Изобретение позволяет осуществить быструю деградацию ПАУ в почвах при их загрязнении солями никеля, а также обеспечивает защиту растений от токсического воздействия ПАУ и улучшение их роста. Однако указанный штамм не способен к биодеструкции имазетапира.

Описан биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий Bacillus cereus 3 К и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis. Изобретение позволяет стимулировать развитие нефтеокисляющей микрофлоры, увеличить скорость разложения нефти, обеспечить интенсификацию микробных процессов, восстанавливающую агрохимические свойства почвы, совместить положительные свойства минеральных и органических удобрений, стимулировать развитие и рост растений, проводить очистку нефтезагрязненных почв в районах с коротким тепловым периодом (Патент РФ № 2319740). Недостатком биопрепарата является отсутствие у него способности к биодеструкции имазетапира.

Известны штаммы Рseudomonas sp. IM-4 (Huang X., Pan J., Liang B., Sun J., Zhao Y., Li S. Isolation, characterization of a strain capable of degrading imazethapyr and its use in degradation of the herbicide in soil // Curr. Microbiol. 2009. V. 59(4). P. 363-367), Acinetobacter baumannii IB5 (Liu C., Yang X., Lai Y., Lu H., Zeng W., Geng G., Yang F. Imazamox microbial degradation by common clinical bacteria: Acinetobacter baumannii IB5 isolated from black soil in China shows high potency // Journal of Integrative Agriculture. 2016. V. 15. P. 1798-1807) и Brevibacterium sp. IM9601 (Xu Z., Li B., Jia Y., Guo X., Lv F. Biodegradation of imazethapyr by bacterial strain IM9601 isolated from agricultural soil // Curr. Microbiol. 2023. V. 81. Article 33. https://doi.org/10.1007/s00284-023-03533-4), разлагающие имазетапир, но не способные к биодеструкции нефти и стимуляции роста растений.

Наиболее близким по свойствам к предлагаемому микроорганизму является штамм Rhodococcus qingshengii AC-2143, обладающий способностью к деградации гербицида имазетапира, продукции индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и стимуляции роста растений, высаженных в загрязненную имазетапиром почву (Патент РФ № 2764119). Однако сведения о наличии у указанного штамма способности к биодеструкции нефти отсутствуют.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств для очистки почвы от антропогенного загрязнения, а именно нефтью и гербицидами на основе имазетапира и ускорение ее восстановления путем стимулирования роста растений-фиторемедиантов.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в биодеструкции нефти и имазетапира и стимуляции роста растений-фиторемедиантов на почве, содержащей эти загрязнители.

Штамм выделен из образца почвы с места аварийного разлива нефти (Нефтеюганский район, ХМАО-Югра, Тюменская область) и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером B-3756D. Полученный штамм Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) характеризуется следующими признаками.

Клетки культуры имеют форму прямых коротких палочек, 2 мкм в длину и 0,5 мкм в ширину, подвижные, с одним полярным жгутиком. Аэробные. Грамотрицательные. На среде Кинг Б (Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов. - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2008. 348 с.) образуют молочные, более темные в центре, округлые выпуклые слизистые колонии с неровными краями и выделяют желто-зеленый флуоресцентный пигмент. Растут при 28-41°C, рН 5-8, 1-7% NaCl. Оксидазо- и каталазоположительные. Используемые источники углерода: глицерин, цитрат, ацетат, фумарат, глутарат, пируват, D-глюкоза, D-галактоза, ксилоза, пропионовая кислота, янтарная кислота, D-аланин, L-пролин, L-аланин, L-аспарагин. Не растут на трегалозе, L-арабинозе, мальтозе, пропионате, адипинате, инозитоле, ацетамиде.

На основании сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамм N2 был отнесен к виду Pseudomonas citronellolis (сходство с типовым штаммом вида Pseudomonas citronellolis NBRC 103043 составило 100,0%). Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК нового штамма N2 депонирована в GenBank под номером OR367428. Хранится на скошенной агаризованной среде Кинг Б и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°C.

Штамм Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) синтезирует ИУК. Максимальный уровень продукции этого фитогормона (6025 нг/мл) зафиксирован при культивировании штамма на среде Кинг Б. Штамм стимулирует рост побегов и корней растений ячменя (Hordeum vulgare L.) и клевера лугового (Trifolium prаtense L.) в лабораторных вегетационных опытах с проростками этих растений.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Биодеструкция нефти штаммом Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) при культивировании в жидкой минеральной среде

Способность штамма к биодеструкции нефти оценивали методом газовой хроматографии после экстракции гексаном (Борзенков И.А., Милехина Е.И., Готоева М.Т., Розанова Е.П., Беляев С.С. Свойства углеводородокисляющих бактерий, изолированных из нефтяных месторождений Татарстана, Западной Сибири и Вьетнама // Микробиология. 2006. Т. 75. № 1. С. 82-89). Микроорганизмы культивировали 5 суток на термостатируемом шейкере (160 об/мин, температура 28°С) в колбах с жидкой минеральной средой Раймонда (Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Development Industrial Microbiology. 1961. V. 2. No. 1. P. 23-32), содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии нефть в концентрации 40 г/л. Контролем служила среда с нефтью без бактерий. Повторность опыта троекратная.

Биодеструкция нефти штаммом Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) составила 72,6%.

Пример 2. Биодеструкция имазетапира штаммом Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) при культивировании в жидкой минеральной среде

Способность микроорганизмов к биодеструкции имазетапира изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Бактерии выращивали 7 суток на термостатируемом шейкере (160 об/мин, температура 28°С) в колбах с жидкой минеральной средой Раймонда, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии имазетапир в количестве 200 мг/л. Контролем служила среда с имазетапиром без бактерий. Повторность опыта троекратная.

Биодеструкция имазетапира штаммом Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) составила 26,9%.

Пример 3. Влияние штамма Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) на рост и развитие растений в почве, загрязненной нефтью

Наличие у штамма способности к стимуляции роста растений в условиях нефтяного загрязнения проверяли на семенах ячменя ярового (Hordeum vulgare L) сорта Челябинский 99 и клевера лугового (красного) (Trifolium prаtense L.) сорта Ранний 2. Эти растения часто используют в качестве фиторемедиантов для биологической очистки антропогенно загрязненных почв. Семена инокулировали в течение 15 минут жидкой культурой бактерий Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D), полученной после 5 суток культивирования бактерий на среде Кинг Б на термостатируемом шейкере (160 об/мин, температура 28°С) и разбавленной до титра 10⁵-10⁶ КОЕ/мл. Контрольные семена не подвергали обработке. Далее семена ячменя (15 шт.) и клевера (20 шт.) раскладывали на почве, предварительно загрязненной нефтью (20 г/кг почвы) и помещенной в чашки Петри (по 40 г в чашку) и инкубировали при 24-26°С в течение 3 и 4 суток соответственно, после чего определяли количество проросших семян, длину побегов и длину корней (у ячменя измеряли суммарную длину корней). Влажность почвы в течение опыта поддерживали на уровне 60% от полной влагоемкости. Повторность опыта троекратная.

В условиях нефтяного загрязнения инокуляция штаммом Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) практически не повлияла на количество проросших семян, но способствовала увеличению побегов (на 18,1 и 24,7% для ячменя и клевера соответственно) и корней проростков (на 15,2 и 18,2 % для ячменя и клевера соответственно) по сравнению с неинокулированными растениями (Табл. 1).

Таблица 1. Морфометрические показатели растений ячменя и клевера в почве, загрязненной нефтью

Вариант Количество проросших семян, % Длина, мм побег корень Ячмень Контроль 97 25,91±1,78 190,09±11,50 Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) 96 30,60±1,69 219,02±11,95 Клевер Контроль 88 9,56±0,67 10,81±0,64 Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) 89 11,92±0,49 12,78±0,53

Пример 4. Влияние штамма Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) на рост и развитие растений в почве, загрязненной имазетапиром

Наличие у штамма способности к стимуляции роста растений в условиях загрязнения имазетапиром проверяли на семенах ячменя ярового (Hordeum vulgare L.) сорта Челябинский 99 и клевера лугового (красного) (Trifolium prаtense L.) сорта Ранний 2. Инокуляцию семян проводили, как описано в примере 3. В чашки Петри помещали по 40 г почвы, обрабатывали ее рабочим раствором гербицида Тапир, ВК (действующее вещество имазетапир, 100 г/л), приготовленным согласно рекомендациям производителя. Далее эксперимент проводили так, как описано в примере 3.

Инокуляция штаммом Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) увеличивала на 14,7% количество проросших семян клевера в почве с имазетапиром и способствовала увеличению побегов (на 20,6 и 18,3% для ячменя и клевера соответственно) и корней проростков (на 22,8 и 25,9% для ячменя и клевера соответственно) по сравнению с неинокулированными растениями (Табл. 2).

Таблица 2. Морфометрические показатели растений ячменя и клевера в почве, загрязненной имазетапиром

Вариант Количество проросших семян, % Длина, мм побег корень Ячмень Контроль 97 25,56±1,38 167,08±10,54 Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) 96 30,83±1,65 205,17±13,14 Клевер Контроль 68 15,92±0,73 16,75±0,99 Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D) 78 18,83±1,14 21,09±1,27

Таким образом, выделен новый штамм бактерий Pseudomonas citronellolis N2 (ВКМ B-3756D), который может быть использован для биодеструкции нефти и имазетапира и стимуляции роста растений-фиторемедиантов в почве, загрязненной этими веществами, а также служить основой биопрепаратов экологического назначения.

Изобретение относится к области экологической биотехнологии. Предложено применение штамма бактерий Pseudomonas citronellolis N2 ВКМ B-3756D для стимуляции роста растений-фиторемедиантов ячменя и клевера в почве, загрязненной нефтью или имазетапиром. Изобретение обеспечивает стимуляцию роста растений-фиторемедиантов ячменя и клевера в почве, загрязненной нефтью или имазетапиром. 2 табл., 4 пр.

Применение штамма бактерий Pseudomonas citronellolis N2 ВКМ B-3756D для стимуляции роста растений-фиторемедиантов ячменя и клевера в почве, загрязненной нефтью или имазетапиром.