БИОРЕМЕДИАЦИОННЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ТЕХНОЗЕМОВ ОТ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОБНО-РАСТИТЕЛЬНОЙ АССОЦИАЦИИ Российский патент 2024 года по МПК B09C1/00 B09C1/10 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ очистки загрязненных техноземов с использованием микробно-растительной ассоциации, который может быть использован на биологическом этапе очистки почв, загрязненных тяжелыми металлами.

Тяжелые металлы являются одними из наиболее опасных элементов, загрязняющих почву в результате ряда естественных и антропогенных воздействий. Твердые промышленные отходы, внутренние стоки, побочные продукты горнодобывающей промышленности являются одними из основных источников тяжелых металлов.

Техногенное загрязнение окружающей среды при добыче угля вызвано высокой концентрацией химических элементов, которые попадают в верхние слои почвы с извлекаемыми из недр породами. Уголь обладает богатым химическим составом, в нем содержится свыше 30 химических элементов [1]. Особенно важную роль играют процессы окисления сульфидов железа и других металлов, содержащихся в отвалах вскрышных пород. В результате чего резко увеличиваются минерализация и содержание сульфатов в водах и почвах, рН почв снижается, меняются условия миграции химических элементов [2-5].

Образующиеся при добыче угля отвалы содержат уголь и минералы, в основном сульфиды (пирит и сфалерит), алюмосиликаты, карбонаты и другие богатые микроэлементами минералы [6]. Выщелачивание угольных отходов является основным путем поступления микроэлементов в окружающую среду. Например, сульфиды железа легко окисляются бактериями [7]. Интенсивное окисление пирита находит отражение в кислых шахтных дренажах угольных отходов. Когда пирит реагирует с водой и кислородом, образуются серная кислота (H₂SO₄) и свободные ионы водорода (Н⁺), подкисляющие воду. Последующее подкисление вод связано со скоростью, с которой ионы железа (II) окисляются кислородом в зависимости от рН [6].

Добыча полезных ископаемых, является причиной загрязнения почв ароматическими соединениями, тяжелыми металлами (ТМ), редкоземельными элементами, гетероциклическими соединениями (пиридином, фураном, тиофеном), галогеналканами, такими как дихлорметан и дихлорэтан, и другими вредными веществами. Многие тяжелые металлы опасны, поскольку накапливаются в почве, воздухе и воде, оказывая серьезное воздействие на окружающую среду [8].

В результате добычи угля и руд почва загрязняется такими микроэлементами как ртуть, мышьяк, свинец, селен, молибден, ванадий, бор, медь, никель, цинк, марганец, хром, кадмий, кобальт, олово и бериллий. Обычно ТМ встречаются в поверхностных почвах загрязненных добычей полезных ископаемых [9].

В этих условиях биоремедиация считается более благоприятным подходом, чем традиционные методы обработки загрязненных земель, поскольку традиционно используемые физические и химические методы ремедиации являются дорогостоящими и в то же время производят большое количество токсичных промежуточных продуктов [10].

На законодательном уровне установлено, что все нарушенные в процессе угледобычи земли должны быть подвергнуты обязательной процедуре рекультивации [11]. Наиболее перспективным методом восстановления нарушенных почв является биоремедиация с использованием растительно-микробных ассоциаций.

Область поиска направлена на известные способы и технологии получения микробных биопрепаратов для рекультивации техногенно нарушенных ландшафтов на основе микроорганизмов, устойчивых к действию тяжелых металлов. Микробная биоремедиация является экологически безопасным, рентабельным и устойчивым методом очистки загрязненных почв.

Известен метод рекультивации нарушенных земель с применение микроорганизмов (патент CN №109174935, опубл. 11.01.2019). Перед посадкой растений в почву вносят удобрение, состоящее из: древесного угля, органических веществ, лузги и гайцита в дозировке 2,0-2,5 кг/м². После внесения вышеперечисленных веществ почву вспахивают и путем многократного полива вносят микробный агент: Mortierella, Trichoderma asperellum и Mucor circinelloides (дозировка составляет 15-20 г/м²). Далее высеивают бамию, люцерну и кохию обыкновенную. Сбор урожая проводят через 2-3 месяца. Метод применялся для рекультивации территории хвостохранилищ, содержащих отходы добычи железа.

Недостатком данного метода является высокая себестоимость, обусловленная большим количеством этапов технологического процесса, а также низкая вариабельность утилизируемых металлов.

В заявке на изобретение РФ №2020117034, опубл. 25.11.2021 предложен биопрепарат для очистки водных сред и почвогрунтов от нефти и нефтепродуктов, ТМ, радионуклидов и лигниновых компонентов. Биопрепарат включает бактериально-грибной комплекс, состоящий из основы, в качестве которой выступает мицелиальная масса грибов микромицета Penicillium chrysogenum F-1373 и/или базидиомицетов Panus tigrinus F-8/18 или Schizophyllum fasciatum F-499, и биомассы бактерий Rhodococcus erytropolis AC-1226 и/или Pseudonocardia carboxydivorans AC-2046 и/или бактерии Arthrobacter globiformis AC-1232, полученных выращиванием при раздельном культивировании и смешанных в комплексы по объему из биомассы монокультур бактерий и грибов при соотношении 3-10:1-5 соответственно и взятых в эффективном качестве с титром не менее 10⁷ КОЕ/мл или с биомассой не менее 5 г/л.

Недостатком является то, что степень биодеградации нефтяных углеводородов определяется при этом только потенциалом интродуцированных в систему микроорганизмов-деструкторов. То есть потенциал аборигенной микробиоты, присутствующей в загрязненной нефтью или нефтепродуктами экосистеме, по биодеградации углеводородов остается неиспользованным, что снижает эффективность процесса биологической рекультивации. Также недостатком является высокая себестоимость биопрепарата.

Описано биоудобрение на основе угольной породы (патент CN №111011159, опубл. 17.04.20), в состав которого входят: 60 частей частиц угольной породы, 30 частей компоста из ила и 10 частей летучей золы, Acinetobacter sp. NXH1, Klebsiella sp. NXH2, Stenotrophomonas sp. NXH3 и Pseudomonas sp.XKS (данные штаммы устойчивы к действию тяжелых металлов). Вышеописанные штаммы способны проводить биодеструкцию следующих тяжелые металлов: цинка, меди, свинца, хрома, кадмия, никеля, ртути, мышьяка.

Недостатком данного биоудобрения является отсутствие в его составе ризобактерий, позволяющих растениям быстрее адаптироваться к грунту угольных отвалов.

В патенте РФ №2229203 опубл. 27.05.2004 рассмотрен фиторемедиационный способ очистки почв, включающий засев почвы семенами растений из семейств сложноцветных, бобовых и злаковых в соотношении 1:1:1 в количестве 1,50-22,90 млн. шт./га с последующим многократным скашиванием их на стадии вегетационного периода, высушиванием и удалением с поверхности почвы. Фиторемедиационный способ очистки почв является экологически чистым и позволяет существенно снизить содержание тяжелых металлов в загрязненных почвах.

Недостатком данного способа является невысокая эффективность в восстановлении плодородия почв, особенно с высокотоксичными концентрациями ТМ (отвалы горных пород, территории вокруг промышленных предприятий, полигоны), и в повышении устойчивости растений к различным стрессам, включая токсичность тяжелых металлов.

Известен способ фиторемедиации почв, загрязненных углеводородами (патент РФ №2618096 опубл. 02.05.2017). Способ включает посев растений-фиторемедиантов (люцерны посевной и пшеницы озимой) и применение суспензии штамма микроорганизма - деструктора углеводородов (Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д), стимулирующего рост растений для ускорения скорости очистки почв на сильно загрязненных участках.

Существенным недостатком настоящего изобретения является ограниченная применимость данного метода на территориях, загрязненных тяжелыми металлами, так как основное действие микробно-растительной системы направлено на утилизацию углеводородов.

Указанное изобретение принято в качестве ближайшего аналога.

Техническая проблема, решаемая с использованием разработанного технического решения, состоит в разработке эффективного способа биоремедиации техноземов угольных отвалов.

Техническим результатом, достигаемым при реализации разработанного способа, является снижение концентрации тяжелых металлов в почвах техногенно нарушенных территорий (техноземов).

Согласно изобретению настоящая задача решается за счет использования симбиотической микробно-растительной ассоциации, включающей клевер луговой и штаммы микроорганизмов, предпочтительно, выделенных из почв и проявляющих устойчивость к действию тяжелых металлов, Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519. При реализации разработанного способа производят засев техноземов симбиотической микробно-растительной ассоциацией, включающей семена клевера лугового Trifolium pratense L. и консорциум микроорганизмов, проявляющих устойчивость к действию тяжелых металлов, Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519, причем ассоциация взята из расчета 1,5 л рабочего раствора с концентрацией клеток 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ/мл на 1 кг семян, при расходе 19-20 кг семян/га.

В предпочтительном варианте реализации разработанного способа используют консорциум микроорганизмов, выделенных из почв и проявляющих устойчивость к действию тяжелых металлов, Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519, в соотношении 1:1

В некоторых вариантах реализации используют микробную биомассу для микробно-растительной ассоциации, полученную на основе консорциума Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519 в соотношении 1:3 соответственно.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В работе использованы штаммы микроорганизмов из коллекции Национального биоресурсного центра ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» - Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519. Штаммы выделены из природных источников, а именно почвенной микрофлоры, и характеризуются устойчивостью к действию тяжелых металлов.

Штаммы культивируют при температуре 30°С в течение 24-48 ч в 9 мл питательной среды следующего состава: гидрофосфат натрия 24,0 г; дигидрофосфат калия 12,0 г; хлорид натрия 2,0 г; хлорид аммония 4,0 г; дистиллированная вода до 1 л; рН 7,2±0,2 [12]. Для подбора наиболее активного микробного компонента микробно-растительной ассоциации исследуют влияние чистых культур Bacillus edaphicus В-7517, Bacillus mucilaginosus В-7519 и консорциумов на их основе на всхожесть и выживаемость семян клевера лугового Trifolium pratense L.

Далее осуществляют наработку микробной биомассы консорциума В-7517 и В-7519 в соотношении 1:1 соответственно при температуре 25°С до концентрации клеток 1-4×106 КОЕ/мл на питательной среде следующего состава: гидрофосфат натрия 24,0 г; дигидрофосфат калия 12,0 г; хлорид натрия 2,0 г; хлорид аммония 4,0 г; вода до 1 л; рН 7,2±0,2.

Для концентрирования и дальнейшего хранения микробной биомассы культуральную жидкость центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин. Далее к осадку добавляют защитную среду в соотношении микробная биомасса: защитная среда, равном 1:1,5, замораживают при температуре -50°С в и сублимационно высушивают течение 24 часов. В качестве защитной среды используют среду М.М. Файбича [13] следующего состава: сахароза -100,0 г; желатин - 15,0 г; агар-агар - 0,1 г; вода дистиллированная до 1 л.

Для приготовления рабочего раствора микробной биомассы смешивают лиофилизированную биомассу и воду в соотношении 1:9 с получением концентрата, после чего концентрат разбавляют с водой в соотношении 1:100. Концентрация клеток в полученном рабочем растворе составляет 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ/мл.

Полученным рабочим раствором микробной биомассы обрабатывают семена клевера лугового Trifolium pratense L. из расчета 1,5 л на 1 кг семян путем настаивания в течение 3-5 ч. На рекультивируемый технозем высевают в количестве 19-20 кг семян/га обработанные семена и выращивают растения по стандартным технологиям, применимым к клеверу луговому, конкретным почвенным условиям и климатическому региону.

Для исследования способности микробно-растительной ассоциации очищать почвы от тяжелых металлов осуществляют посев предварительно обработанных в рабочем растворе микробной биомассы семян клевера лугового Trifolium pratense L. в почву с добавлением солей тяжелых металлов (сернокислый магний, сернокислый марганец, сернокислая медь; сернокислый цинк; сернокислое железо) в концентрации 100 мг/кг почвы. В качестве критерия оценки используют остаточную концентрацию тяжелых металлов в почве после проведения рекультивационных работ с использованием микробно-растительной ассоциации.

Пример 2. Аналогичен примеру 1, но в данном случае микробную биомассу для микробно-растительной ассоциации получают на основе консорциума Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519 в соотношении 1:3 соответственно.

Пример 3. Аналогичен примеру 1, но рабочий раствор микробной биомассы используется для непосредственной обработки почвы, а именно орошения, в концентрации 1 л рабочего раствора на 10 м² с последующим посевом необработанных семян клевера лугового Trifolium pratense L.

Пример 4. Аналогичен примеру 3, но в данном случае микробную биомассу для микробно-растительной ассоциации получают на основе консорциума Bacillus edaphicus В-7517 и Bacillus mucilaginosus В-7519 в соотношении 3:1 соответственно.

Для контроля анализируют необработанные микроорганизмами семена. Результаты всхожести и выживаемости семян представлены в таблице 1. По результатам исследования наибольшую активность на показатели роста клевера лугового, по сравнению с контрольными образцами семян без обработки микроорганизмами, оказывают консорциумы с соотношением исходных штаммов 1:1 по примеру 1 (всхожесть 91,3%; выживаемость 86,4%) и 1:3 по примеру 2 (всхожесть 89,1%, выживаемость 84,0%).

Результаты определения концентрации тяжелых металлов в почве представлены в таблице 2. Показано, что максимальные результаты характерны для способа биоремедиации по примеру 1 как по показателям всхожести и выживаемости семян клевера лугового Trifolium pratense L. (90,1 и 85,2% соответственно), так и по убыли концентрации металлов в почве (суммарный показатель убыли для всех металлов - 641,10 мг/кг).

Таблица 2 иллюстрирует достигнутый технический результат - снижение концентрации тяжелых металлов в техноземах.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет получить эффективный способ биоремедиации техноземов угольных отвалов на основе микробно-растительной ассоциации

Список литературы

1. Li, W. Environment and reproductive health in China: challenges and opportunities Environ. / W. Li, B. Chen, X. Ding // Health Persp. - 2012. - №5. - P. 184-185.

2. Bioremediation of heavy metals from soil and aquatic environment:An overview of principles and criteria of fundamental processes. / R. Dixit [et al.] // Ecology. 2015. V. 2 (7). P. 2189-2212. https://doi.org/10.3390/su7022189.

3. Li W., Chen В., Ding X. Environment and reproductive health in China: challenges and opportunities Environ. // Health Persp. - 2012. - V. 5. - P. 184-185.

4. Avgushkevich I.V., Sidoruk E.I., Bronovets T.M. Standard methods of coal tests // Coal Classification. - 2018. - 576 p.

5. Zhuravleva, E.V., Mikhailova E.S., Zhuravleva N.V., Ismagilov Z.R. Polycyclic aromatic hydrocarbons from coal in the objects of the environment // Chemistry for Sustainable Development. - 2020. - V. 28. - P. 318-325.

6. Effect of consortium bioaugmentation and biostimulation on remediation efficiency and bacterial diversity of diesel-contaminated aged soil / D.K. Chaudhary, R. Bajagain, S.W. Jeong, J. Kim // World J Microbiol Biotechnol. - 2021. - Vol. 37. - №3. - P. 46. https://lrnk.sprmger.com/article/10.1007/s11274-021-02999-3.

7. Heavy metal- and organic-matter pollution due to self-heating coal-waste dumps in the Upper Silesian Coal Basin (Poland) / A. Nadudvari, B. Kozielska, A. Abramowicz, M. Fabiahska, J. Ciesielczuk, J. Cabala, T. Krzykawski. // J Hazard Mater. - 2021. - Vol. 412 (15). - P. 125244. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2021.125244.

8. A review of green remediation strategies for heavy metal contaminated soil / L. Wang, J. Rmklebe, F.M.G. Tack, D. Hou // Soil Use Manag. - 2021. - P. 1-28.

9. N.-.D. Dat, M.B. Chang Review on characteristics of PAHs in atmosphere, anthropogenic sources and control technologies// Sci. Total Environ. - 2017. - Vol. 609. - P. 682-693.

10. Chapter 12 - Microbial bioremediation: A promising approach to withstand heavy metal contamination in soil and its future possibilities / Romio Saha, Debjyoti Bandhu Banerjee, Sourav Manna, Saptadipa Banerjee // Synergistic Approaches for Bioremediation of Environmental Pollutants: Recent Advances and Challenges. - 2022. - P. 227-262. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-91860-2.00018-X.

11. Comparative mechanisms of PAH toxicity by benzo[a]pyrene and dibenzo[def,p]chrysene in primary human bronchial epithelial cells cultured at air-liquid interface / Y. Chang [et al.] // Toxicology and Applied Pharmacology. - 2019. - V. 379.

12. Концевая, И.И. Микробиология: культивирование и рост бактерий / И.И. Концевая. - Чернигов: «Десна Полиграф»: 2017. - 44 с.

13. Грачева, И.В. Традиционные и новые защитные среды для низкотемпературной консервации бактерий / И.В. Грачева, Т.В. Валова, Г.В. Григорьева // Микробиология. - 2011. - №4. - С. 36-40.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ очистки загрязненных техноземов с использованием микробно-растительной ассоциации, который может быть использован на биологическом этапе очистки почв, загрязненных тяжелыми металлами. При реализации способа производят засев техноземов симбиотической микробно-растительной ассоциацией, включающей семена клевера лугового Trifolium pratense L. и консорциум микроорганизмов, проявляющих устойчивость к действию тяжелых металлов, Bacillus edaphicus ВКПМ В-7517 и Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-7519, причем ассоциация взята из расчета 1,5 л рабочего раствора с концентрацией клеток 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ/мл на 1 кг семян, при расходе 19-20 кг семян/га. Техническим результатом изобретения является снижение концентрации тяжелых металлов в почвах техногенно нарушенных территорий. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Биоремедиационный способ очистки техноземов от тяжелых металлов с использованием микробно-растительной ассоциации, включающий посев растений-фиторемедиантов и применение штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что производят засев техноземов симбиотической микробно-растительной ассоциацией, включающей семена клевера лугового Trifolium pratense L. и консорциум микроорганизмов Bacillus edaphicus ВКПМ B-7517 и Bacillus mucilaginosus ВКПМ B-7519, выделенных из почвенной микрофлоры, взятой из расчета 1,5 л рабочего раствора с концентрацией клеток 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ/мл на 1 кг семян, при расходе 19-20 кг семян/га.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют консорциум микроорганизмов Bacillus edaphicus ВКПМ B-7517 и Bacillus mucilaginosus ВКПМ B-7519, выделенных из почвенной микрофлоры в соотношении 1:1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют консорциум микроорганизмов Bacillus edaphicus ВКПМ B-7517 и Bacillus mucilaginosus ВКПМ B-7519, выделенных из почвенной микрофлоры в соотношении 1:3.