Водная композиция инсулина аспарта и инъецируемый инсулиновый препарат Российский патент 2024 года по МПК A61K38/28 A61K31/455 A61K31/195 A61P3/10 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, а именно, к композициям быстродействующего инъецируемого инсулинового препарата для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим инсулин аспарт, которые обладают превосходной физической и химической стабильностью, в том числе при воздействии высокой температуры и/или высокой механической энергии.

Уровень техники

Стабильность лекарственного препарата (ЛП) является необходимым условием обеспечения его терапевтического эффекта или отсутствия у него новых побочных реакций, при этом она должна быть обеспечена как при хранении ЛП в течение срока годности, так и при его использовании. Стабильные композиции ЛП особенно необходимы для использования в устройствах доставки, в которых они подвергаются воздействию повышенных температур и/или механических нагрузок. Например, стабильные композиции инсулина необходимы для использования в шприц-ручках и системах непрерывной инфузии (с использованием помп). Композиции инсулина также производят, хранят и используют во флаконах, что требует их стабильности на протяжении срока хранения.

Шприц-ручки широко применяются среди пациентов, страдающих сахарным диабетом, так называемых диабетиков, поскольку они позволяют диабетикам самостоятельно эффективно управлять течением своей болезни путем осуществления своевременной инъекции лекарственного средства с требуемой дозой в целевое место инъекции на теле пациента в точности в соответствии с назначениями лечащего врача. Такие шприц-ручки достаточно просто использовать, что позволяет их пользователям не иметь каких-либо специальных медицинских навыков и/или какого-либо специального медицинского образования для того, чтобы задать подлежащую инъекции дозу инсулина и в дальнейшем осуществить инъекцию заданной дозы лекарственного средства в целевое место инъекции на теле пациента. Как правило, шприц-ручки содержат картридж, в котором находится определенное количество ЛП.  Картридж включает в себя поршень и механизм для продвижения поршня в картридже таким образом, чтобы дозировать лекарственное средство. Щприц-ручки могут быть многоразовыми или одноразовыми. В многоразовых ручках пользователь может заменить отработанный картридж и вернуть ходовой винт ручки в исходное положение. В одноразовой шприц-ручке картридж не подлежит замене, она утилизируется после того, как содержимое картриджа израсходовано. Инсулиновый препарат при его использовании в картриджах или при переносе запасных картриджей хранится вне холодильника до тех пор, пока картридж не будет использован полностью (как правило, в течение срока не менее 2 недель), либо не выйдет установленный производителем рекомендованный срок хранения используемого или переносимого картриджа - не более 1 месяца. Так как шприц-ручки для введения инсулина часто хранят в карманах одежды при температуре, близкой к температуре тела, композиции инсулина, используемые в таких шприц-ручках, подвергаются физическим и температурным нагрузкам, вследствие чего имеют ограниченную стабильность.

В случае систем непрерывной инфузии раствор инсулина, который должен быть введен с помощью инфузионного устройства, хранится в резервуаре, например, в шприце, синтетической полимерной камере, металлическом контейнере и т.п. Резервуар и функционально соединенный с ним насосный механизм прикрепляются к телу пациента или имплантируются в тело пациента.  Инсулин нагнетается насосом из резервуара через катетеры малого диаметра подкожно, внутривенно или внутрибрюшинно, вследствие чего композиция инсулина подвергается воздействию температуры тела и перемещению, а также нагнетательному движению насоса и, таким образом, высокой термомеханической нагрузке. 

Существующие композиции инсулина, в большей степени его мономерные аналоги, не обеспечивают достаточную физико-химическую стабильность в шприц-ручках и системах непрерывной инфузии. Основной проблемой, возникающей при введении инсулина с помощью шприц-ручек и инфузионных систем, является склонность растворов инсулина с течением времени к образованию агрегатов, фибрилл или преципитатов инсулина [1]. Агрегаты и преципитаты приводят к повреждению компонентов катетера или помпы, а в случае шприц-ручек к повреждению игл, что способствует прекращению поступления инсулина в организм пациента и плохому гликемическому контролю. 

На агрегацию и осаждение инсулина в растворе влияет множество факторов, основные среди них:

(а) повышенная температура, например, 25-37°С, в отличие от обычных (2-8°С) условий хранения [2];

(b) механическая энергия, вызываемая движением тела или движением насосных/поршневых механизмов [3];

(c) продолжительное взаимодействие молекул инсулина с гидрофобными поверхностями, такими как поверхности раздела с воздухом и пластиковые или металлические компоненты помпы [4,5].

Инсулин представляет собой пептидный гормон, который регулирует уровень глюкозы в крови у млекопитающих, инициируя сигнальный каскад, который ускоряет поглощение глюкозы и выработку гликогена при связывании с рецептором инсулина. При нарушении выработки инсулина в крови повышается концентрация глюкозы (хроническая гипергликемия), что и является основным диагностическим признаком диабета 1-го типа (СД1). Однако при нарушениях передачи сигнала от инсулиновых рецепторов, даже если гормон вырабатывается в достаточных количествах, развивается диабет 2-го типа (СД2), обусловленный снижением чувствительности тканей к действию инсулина (инсулинорезистентность). Эффективность инсулина в лечении сахарного диабета, обусловленная способностью этого гормона снижать уровень глюкозы в крови, была доказана в течение десятилетий его применения в медицинской практике. Тем не менее, в настоящее время сохраняется актуальность в поиске новых подходов к терапии сахарного диабета в связи с увеличением количества случаев заболевания и необходимостью учета индивидуальных особенностей и предпочтений пациентов [6].

Разработка быстродействующих и сверхбыстродействующих аналогов инсулина с более быстрым началом действия и меньшей продолжительностью действия стала значительным шагом вперед в лечении диабета 1-го и 2-го типа. В нейтральном растворе при фармацевтической концентрации инсулин и его аналоги находятся в форме стабилизированных цинксодержащих гексамеров, которые состоят из трех идентичных димерных единиц. Задержка действия инсулина в значительной степени связана со временем, которое требуется гексамерам для диссоциации на мономеры и димеры, способные к абсорбции [7,8]. Первый класс быстродействующих инсулинов (например, инсулин лизпро и аспарт) был разработан на основе аминокислотных мутаций в последовательности человеческого инсулина, что привело к ослаблению самоассоциации олигомеров инсулина.  Так, например, замещение аминокислоты пролин в положении В28 на аспарагиновую кислоту в инсулине аспарт снижает тенденцию молекул к образованию гексамеров, которая наблюдается в растворе растворимого человеческого инсулина. В связи с этим инсулин аспарт гораздо быстрее всасывается из подкожно-жировой клетчатки по сравнению с растворимым человеческим инсулином и широко применяется для постпрандиального контроля уровня глюкозы в крови у пациентов с сахарным диабетом [9].

Известно, что быстродействующие аналоги инсулина, которые находятся в мономерной или димерной форме, обладают пониженной по сравнению с гексамерами физико-химической стабильностью [10], особенно при термической и механической нагрузке, в частности образуют высокомолекулярные примеси, и повышенной склонностью к агрегации (фибрилляции), что проявляется в виде помутнений и осадка. Высокомолекулярные примеси (димеры, тримеры, полимеры) и агрегаты не только снижают введенную дозу инсулина, но и могут провоцировать раздражения или иммунные реакции у пациента. Кроме того, нерастворимые агрегаты могут закупоривать и повреждать иглы, канюли и шланги насосов. Для обеспечения качества инсулиновой композиции необходимо избегать образования полимеров и агрегатов.

На рынке существуют лекарственные препараты инсулина аспарт (например, «НовоРапид» (Ново Нордиск А/С), «РинФаст» (ООО «ГЕРОФАРМ»). Было показано, что можно улучшить общий гликемический контроль за счет введения в состав препарата вспомогательного вещества никотинамид, способного ускорять абсорбцию инсулина аспарт, в сравнении с препаратами инсулина аспарт без никотинамида. В частности, было показано, что препарат «Фиасп» (содержит никотинамид) по сравнению с препаратом «НовоРапид» (не содержит никотинамид) обеспечил улучшенный общий гликемический контроль и лучший гликемический контроль после приёма пищи без увеличения общего риска развития тяжёлых или подтверждённых гипогликемий у пациентов с СД1 и СД2. Фармакокинетические характеристики быстродействующего инсулина аспарт «Фиасп» могут лучше воспроизводить быструю эндогенную секрецию прандиального инсулина и, таким образом, улучшать постпрандиальный контроль гликемии по сравнению с инсулином аспарт [11].

Никотинамид обладает способностью ускорять абсорбцию инсулина (WO 91/09617), в том числе инсулина аспарт (WO/9610417), однако оказывает негативное влияние на химическую стабильность – увеличивает содержание примесей (RU2533217). Химическая стабильность состава лекарственного препарата (ЛП) «Фиасп» повышается за счет введения аргинина в состав, что отражается в уменьшении содержания димеров и полимеров, дезамидированных инсулинов при хранении (RU2533217). ЛП «ФИАСП» является наиболее близким аналогом настоящего изобретения.

В отчете о небольшом (n = 37) 6-недельном исследовании склонности инфузионных систем к засорению и неисправности, не было отмечено случаев закупоривания инфузионных систем ни препаратом ФИАСП (25 субъектов), ни инсулином аспарт (12 субъектов). Однако необъяснимая гипергликемия и преждевременная смена инфузионного набора чаще встречались при применении ФИАСПа по сравнению с применением инсулина аспарт [12].

В патенте RU2533217 показано (пример 2), что добавление аргинина в состав композиций, содержащих инсулина аспарт с никотинамидом, уменьшает количество образующихся примесей, особенно высокомолекулярного белка и дезамидированных форм, но при этом понижается физическая стабильность, измеряемая как время задержки в анализе с тиофлавином T, при увеличении концентрации аргинина физическая стабильность снижается еще больше.

Проведенное нами исследование склонности к образованию фибрилл в анализе с тиофлавином T также показало, что ФИАСП более склонен к фибрилляции по сравнению с ЛП «НовоРапид».

Таким образом, в настоящее время сохраняется потребность в композициях инсулина, обладающих повышенной стабильностью при использовании шприц-ручек, а также в период проведения непрерывной инфузии с использованием помп - от нескольких дней до нескольких месяцев. Улучшение стабильности композиций инсулинов при их использовании во флаконах также является полезным. Особенно актуальна вышеобозначенная техническая проблема для композиций мономерных аналогов инсулина, в том числе инсулина аспарта, отличающихся худшей стабильностью по сравнению с гексамерными формами инсулина, а также для композиций, содержащих соединения никотиновой кислоты, способные ускорять абсорбцию инсулина, но в то же время негативно влияющие на химическую стабильность инсулина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что добавление в состав композиций, содержащих инсулин аспарт и никотинамид, таких поверхностно-активных веществ, как полоксамер 188, полисорбат 20, полисорбат 80 или их комбинации в сочетании с одной или более аминокислотами, выбранными из лизина, аргинина и/или их солей улучшает как химическую, так и физическую стабильность инсулина аспарта в сравнении с аналогом.

Настоящее изобретение относится к композициям для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, содержащим инсулин аспарт (B28Asp), соединение никотиновой кислоты, одну или более аминокислоту или ее соль, выбранную из лизина, аргинина или их солей и поверхностно-активное вещество.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, содержащим инсулин аспарт, соединение никотиновой кислоты, аминокислоту, выбранную из лизина, аргинина и/или их соли и/или их комбинации и поверхностно-активное вещество, выбранное из полоксамера 188, полисорбата 20, полисорбата 80 и/или их комбинации.

Концентрация инсулина аспарта в композициях по изобретению - от примерно 0,2 мМ до 2,0 мМ (от примерно 33 Ед./мл до примерно 333 Ед./мл), предпочтительно - от примерно 0,3 мМ до 1,2 мМ (от примерно 50 Ед./мл до примерно 200 Ед./мл), еще более предпочтительно - 0,6 мМ (100 Ед./мл).

В одном из вариантов настоящего изобретения композиции имеют рН от 6,5 до 8,5, предпочтительно от 6,6 до 7,4, еще более предпочтительно рН равен 7.

Композиции по изобретению содержат соединение никотиновой кислоты, выбранное из никотинамида (ниацинамида), никотиновой кислоты (ниацина) и/или их соли и/или любой их комбинации. Концентрация никотинамида или другого соединения никотиновой кислоты в композициях по изобретению - от примерно 1 мМ и до примерно 200 мМ. Предпочтительное соединение никотиновой кислоты - никотинамид.

Концентрации лизина и/или его соли и аргинина и/или его соли или суммарная концентрация лизина и/или его соли в комбинации с аргинином и/или его солью - от примерно 1мМ до примерно 100 мМ.

В композициях, содержащих комбинацию лизина и/или его соли и аргинина и/или его соли молярное соотношение аминокислот составляет от 4000 : 1 до 1 : 4000 соответственно, указанный диапазон включает каждое целочисленное соотношение, например 100 : 1, 99 : 1, 98 : 1 и т.д. В одном из предпочтительных вариантов молярное соотношение лизина к аргинину составляет 1 : 1, 4 : 5, 5 : 4, 6 : 4; 5 : 2 или 2 : 5.

В композициях по изобретению дополнительно могут содержаться ингибитор(ы) протеазы, ионы металлов, буферные системы, регуляторы рН, консервант(ы), изотонический агент(ы), хелатирующий агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества.

В одном из воплощений изобретения композиции по изобретению являются водными композициями, т.е. композициями, содержащими воду и являются растворами или суспензиями.

Композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения или профилактики гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа.

В одном из предпочтительных вариантов композиции по изобретению применяются парентерально. Парентеральное введение может быть выполнено путем подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекции при помощи шприца, возможно шприца-ручки. Альтернативно парентеральное введение может быть выполнено с помощью инфузионного насоса.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к инъецируемым инсулиновым препаратам, содержащим композиции по настоящему изобретению.

Композиции по изобретению показали улучшение как химической, так и физической стабильности в сравнении с аналогом по изобретению, что полезно потребителям, особенно при использовании шприц-ручек или инсулиновых помп.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «человеческий инсулин», используемый в настоящем документе, обозначает человеческий гормон, структура и свойства которого хорошо известны. Инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, который разделен на 2 аминокислотные цепи: цепь А, состоящую из 21 аминокислоты, и цепь В, состоящую из 30 аминокислот. Цепи соединяются между собой с помощью 2 дисульфидных мостиков. Препараты инсулина используются для лечения сахарного диабета в течение многих лет, при этом в последнее время используют не только инсулины природного происхождения, но также производные и аналоги инсулина.

Под «аналогом инсулина», упоминаемым в настоящем документе, понимается полипептид, полученный из первичной структуры природного инсулина, например, человеческого инсулина, в результате мутации. Одну или более мутацию получают путем удаления и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, происходящей в природном инсулине, и/или путем добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка. Мутации в инсулиновой молекуле обозначаются указанием цепи (А или В), положения и трехбуквенного кода для аминокислоты, заменяющей нативную аминокислоту.

Термин «быстродействующий инсулин» или «краткодействующий инсулин» относится к аналогам инсулина и/или производным инсулина, которые начинают действовать в пределах 5-15 минут и имеют продолжительность действия 3-4 часа. Примеры быстродействующих инсулинов включают в себя, но не ограничиваются, следующими: инсулин аспарт, инсулин лизпро и инсулин глулизин.

Термины «мономерный аналог человеческого инсулина», «мономерный аналог инсулина» хорошо известны в данной области и обычно относятся к быстродействующим аналогам человеческого инсулина. К ним относятся, например, инсулин лизпро (Humalog®), инсулин аспарт (NovoRapid®) и инсулин глулизин (Apidra®). Молекулярная структура инсулина лизпро идентична структуре человеческого инсулина за исключением позиций 28 и 29 B-цепи молекулы, где лизин и пролин расположены в обратном порядке (инсулин человека: B28ProB29Lys, лизпро: B28LysB29Pro). Обратное расположение лизина и пролина позволяет молекуле лизпро диссоциировать в два раза быстрее.  В структуре инсулина аспарт (B28Asp) аминокислотный остаток Pro в положении 28 В-цепи человеческого инсулина заменен на Asp, что снижает тенденцию молекул к образованию гексамеров, наблюдаемую в растворе человеческого инсулина. В структуре инсулина глулизин (3BLys29BGlu) аминокислотный остаток аспарагин в 3-м положении В-цепи молекулы инсулина человека заменен на лизин, а лизин в 29-м положении В-цепи заменен на глутамин, что способствует стабильности данного препарата в растворе в виде мономеров и димеров.

Содержание человеческого инсулина B28Asp в растворе может находиться в диапазоне от примерно 0,2 мМ до примерно 2,0 мМ (от примерно 33 до примерно 333 международных единиц (МЕ)/мл), предпочтительно в диапазоне от примерно 0,3 мМ до примерно 1,2 мМ (от примерно 50 до примерно 200 МЕ/мл), особенно предпочтительно в концентрации 0,6 мМ (МЕ/мл), в препаратах для инъекций. Тем не менее, для других целей парентерального введения содержание инсулинового соединения может быть выше.

В данном контексте единица «ME» соответствует 6 нмоль.

Термин «композиция инсулина аспарта», используемый в настоящем документе, означает продукт, содержащий инсулин аспарт, соединение никотиновой кислоты, выбранное из никотинамида (ниацинамида), никотиновой кислоты (ниацина) и/или их соли и/или любой их комбинации, аминокислоту, выбранную из лизина, аргинина и/или их солей и/или их комбинации, поверхностно-активное вещество, выбранное из полоксамера 188, полисорбата 20, полисорбата 80 или их комбинации, который может содержать и другие эксципиенты, такие как консерванты, хелатирующие агенты, изотонические агенты, наполнители, стабилизаторы, антиоксиданты, полимеры и поверхностно-активные вещества, отличные от вышеупомянутых, ионы металлов, масляные носители и белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки), регуляторы рН, при этом композиция инсулина аспарта может быть использована для лечения, профилактики или снижения тяжести заболевания или нарушения путем ее введения человеку. Таким образом, композиция по настоящему изобретению может быть названа «фармацевтической композиций» или «фармацевтическим препаратом».

Термины «белковый препарат», «белковая композиция» и «белок» могут использоваться в рамках настоящего изобретения взаимозаменяемо и означают любое лекарственное средство, содержащее  в качестве действующего вещества молекулу, состоящую из полипептидных цепей, состоящих из остатков аминокислот, линейно связанных пептидной связью, самостоятельно или в комбинации с другими соединениями. Инсулиновая композиция или инсулин, например, являются частными случаями и охватываются указанными терминами.

Термины «аргинин» и «лизин» относятся к аминокислотам и включают D- и L-энантиомеры, а также их смеси. Термин также включает любые фармакологически приемлемые соли аргинина и лизина. Аргинин и лизин легко образуют соли, например, гидрохлориды.

Термин «поверхностно-активное вещество» (ПАВ), используемый в данном документе, относится к любым молекулам или ионам, которые состоят из растворимой в воде (гидрофильной) части, головы, и жирорастворимого (липофильного) сегмента. ПАВ концентрируются преимущественно на поверхности раздела фаз, гидрофильной частью ориентируясь по направлению к воде (гидрофильной фазе), а липофильной частью по направлению к маслу или гидрофобной фазе (т.е. стеклу, воздуху, маслу и т.д.). ПАВ снижают поверхностное натяжение жидкости. Они также известны как амфипатические соединения. Термин «детергент», как правило, является синонимом термина «поверхностно-активное вещество». Использование ПАВ в фармацевтических препаратах хорошо известно специалистам в данной области. К ним относятся, например, полисорбат 20, полисорбат 80, полоксамер 188 и др., эти вещества в качестве вспомогательных веществ описаны в действующих фармакопеях (USP, EP).

Термин «соединение никотиновой кислоты» включает никотинамид (ниацинамид), никотиновую кислоту (ниацин) и/или их соли и/или любую их комбинацию.

Буфер может быть выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия, а также трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей, но не ограниченной ими. Каждый из этих конкретных буферов или каждая из их комбинаций является альтернативным воплощением изобретения.

Композиции по настоящему изобретению может содержать и другие ингредиенты, обычно используемые в инсулиновых препаратах, например, цинковые комплексообразующие агенты.

Изотонические агенты, такие как глицерин, манит, хлорид натрия, декстроза и др. также могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению. Изотонический агент представляет собой физиологически приемлемое соединение, которое придает композиции подходящую тоничность с целью предотвращения диффузии воды через клеточные мембраны, находящиеся в контакте с фармацевтической композицией.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый консервант. Консервант, присутствующий в инсулиновом препарате по настоящему изобретению, может быть фенолом, м-крезолом, метилпарабеном и др.

Композиции по настояшему изобретению также могут содержать хелатирующий агент. Применение хелатирующих агентов в фармацевтических препаратах хорошо известно специалистам в данной области.

Композиции по настоящему изобретению также могут содержать стабилизатор. Термин «стабилизатор», используемый в настоящем документе, относится к химическим веществам, добавляемым к фармацевтическим препаратам, содержащим полипептид для его стабилизации, т.е. для увеличения срока хранения и/или времени использования таких препаратов.

Используемый здесь термин «стабильность» относится к химической и физической стабильности композиций мономерных аналогов инсулина. 

Физическая нестабильность белковой композиции (белкового препарата) и/или белка может быть вызвана агрегацией белковых молекул с образованием полимеров более высокого порядка или даже осадков.  Физическая денатурация инсулина известна как фибрилляция. В фибриллярном состоянии вытянутые пептидные цепи располагаются параллельно или антипараллельно и связаны водородной связью друг с другом, образуя так называемую β-структуру или β-складчатые листы. Фибриллы обычно представляют собой состояние белка с самой низкой энергией, регенерация белка из этого состояния в нативное состояние правильно свернутого белка возможна только в сильнощелочной среде. Фибриллы инсулина имеют вид гелей или преципитатов.  Факторами, которые способствуют повышению скорости образования фибрилл, являются воздействие термомеханического стресса и/или взаимодействие с границами раздела фаз и гидрофобными поверхностями. Считается, что образование фибрилл происходит за счет мономеризации инсулина. Мономерные аналоги инсулина, легко диссоциирующие от гексамерной единицы к мономерной форме, более склонны к образованию фибрилл по сравнению с человеческим инсулином.

Физическую стабильность можно оценить способами, хорошо известными в данной области, например, измерением мутности (оптической плотности).  Мутность возникает в результате агрегации или осаждения белков или комплексов в композициях. 

Физическую стабильность водных белковых препаратов также можно оценить с помощью спектроскопического агента или зонда конформационного состояния белка. Зонд предпочтительно представляет собой небольшую молекулу, которая преимущественно связывается с ненативными конформерами белка. Одним из примеров низкомолекулярного спектроскопического зонда белковой структуры является тиофлавин Т. Тиофлавин Т является флуоресцентным красителем, который широко используется для обнаружения амилоидных фибрилл. В присутствии фибрилл и, возможно, также других белковых конфигураций, тиофлавин Т порождает новый максимум возбуждения на примерно 445 нм и усиливает излучение на примерно 485 нм при связывании с фибриллярной формой белка. Несвязанный тиофлавин Т является по существу нефлуоресцентным при этих длинах волн.

Термин «химическая стабильность» белковой композиции (белкового препарата) и/или белка, используемый в настоящем описании изобретения, относится к изменениям в ковалентной структуре белка, приводящим к образованию продуктов химического распада с потенциально меньшей биологической активностью и/или потенциально усиленными иммуногенными свойствами по сравнению с нативной структурой белка. Различные продукты химического распада могут быть сформированы в зависимости от вида и характера нативного белка и внешних факторов, воздействию которых подвергается белок. Увеличение количества продуктов химического распада часто наблюдается при хранении и использовании белкового препарата. Большинство белков склонны к дезамидированию, другие пути распада предполагают формирование высокомолекулярных продуктов, при котором две или более белковые молекулы ковалентно связаны друг с другом через переамидирование и/или дисульфидные взаимодействия, приводящие к образованию ковалентно связанных димерных, олигомерных и полимерных продуктов распада [13]. В качестве еще одного варианта химического распада можно упомянуть окисление (например, остатков метионина). Химическую стабильность белкового препарата и/или белка можно оценить, измеряя количество продуктов химического распада в различные временные точки после воздействия различных условий окружающей среды (образование продуктов распада часто может быть ускорено, например, путем повышения температуры). Количество каждого отдельного продукта распада часто определяют путем разделения продуктов распада в зависимости от размера молекул и/или заряда с использованием различных методик хроматографии (например, эксклюзионной жидкостной хроматографии (SEC-HPLC) и/или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC)). Так как высокомолекулярные белковые продукты потенциально иммуногенны и биологически неактивны, то уровни высокомолекулярных белков должны быть низкими.

«Стабильная композиция» представляет собой композицию, в которой степень агрегации белков и содержание примесей находится в пределах нормы и не превышает ее со временем. 

В одном из воплощений композиции по изобретению являются водными композициями, т.е. композициями, содержащими воду и являются раствором или суспензией.

Термин «водная композиция» относится к композиции, содержащей воду. Термины «водный раствор» и «водная суспензия» относятся соответственно к раствору или суспензии, содержащим воду. Водные суспензии могут содержать активные соединения в смеси с эксципиентами, подходящими для изготовления водных суспензий.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Приготовление композиций 1 - 9.

В одном из вариантов фармацевтические композиции по настоящему изобретению получают в виде водных растворов. В таблице 1 приведен качественный и количественный состав некоторых приготовленных композиций, состав композиции 1 соответствует составу ближайшего аналога по изобретению. Композиции по изобретению включают в себя, но без ограничения, композиции 2, 3, 6-9, приведенные в таблице 1.

Способ получения композиций включает:

а) приготовление раствора инсулина аспарта путем его растворения в воде или буфере;

б) приготовление раствора соли цинка путем ее растворения в воде или буфере;

в) приготовление раствора консервантов (фенольных соединений) путем их растворения в воде или буфере;

г) приготовление раствора изотонического агента путем его растворения в воде или буфере;

д) приготовление раствора никотинамида и/или другого соединения никотиновой кислоты путем растворения в воде или буфере

е) приготовление раствора ПАВ путем растворения поверхностно-активного вещества в воде или буфере;

ж) приготовление раствора лизина и/или аргинина путем растворения аминокислот и/или их солей в воде или буфере;

з) смешивание раствора а) и растворов б), в), г), д), е), ж) в соответствии с составом композиций, приведенных в таблице 1;

и) доведение рН смеси з) до значения 6,6 -7,4 с последующей стерилизующей фильтрацией.

й) асептическое заполнение приготовленными композициями картриджей.

Композиции по изобретению могут быть получены любым другим способом.

Таблица 1. Качественный и количественный состав композиций по изобретению

Номер композиции Инсулин-аспарт, мМ (Ед./мл) Фенольные консерванты, сумма, мМ Глицерол (100%), % масс./об. Трометамол, мM Динатрия фосфат дигидрат, мM Никотинамид, мМ L-Лизин ·HCl, мМ L-аргинин·HCl, мМ Полоксамер 188, % масс./об. Полисорбат 20, % масс./об. Полисорбат 80, % масс./об. Zn, мМ НСl, NaOH до рН 6,6 – 7,4
(целевое значение рН 7,0) 1 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 - 2,98 170 - 20 - - - 0,3 рН 7,1 2 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 - 2,98 170 20 - 0,005 - - 0,3 рН 7,0 3 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 10 - 170 75 - 0,005 - - 0,3 рН 7,0 4 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 10 - 170 - - 0,005 - - 0,3 рН 7,0 5 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 10 - 170 75 - - - - 0,3 рН 7,0 6 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 10 - 170 - 100 - - 0,05 0,3 рН 7,0 7 0,6
(100 Ед./мл) 32 0,33 10 - 170 25 20 - 0,001 -  0,3 рН 7,0 8 2,0
(333
Ед./мл) 32 0,33 - 2,98 200  100 -  0,025 0,025 - 0,9 рН 7,0 9 0,2
(33
Ед./мл) 32 0,33 10 -  60 25 -  0,001 - - 0,1 рН 7,0

Пример 2. Анализ физической и химической стабильности композиций

Определение химической стабильности проводили для композиций 1-9, полученных по примеру 1, после термостатирования асептично заполненных ими картрижей при температуре 40ºС в течение 1 и 2 недель.

Определение родственных инсулину аспарту примесей проводили методом ВЭЖХ с УФ-детектированием совместно с показателем «Количественное определение» на колонке, заполненной октадецилсиликагелем, с размером частиц 5 мкм и размером пор 300 Å со скоростью потока подвижной фазы 1,0 мл/мин и при длине волны 214 нм.

Элюирование проводили подвижной фазой в градиентном режиме, состоящей из следующих компонентов:

Подвижная фаза А (ПФ А): 10 % (w/V) ацетонитрил, буферный раствор рН 3,4 (1,4 % (w/V) натрия сульфата безводного, 0,13 % (V/V) ортофосфорной кислоты концентрированной, 2 M гидроксид натрия до рН 3,4 ± 0,05).

Подвижная фаза Б (ПФ Б): 50 % (w/V) ацетонитрил.

Количество примеси В28IsoAsp, дезамидированных (B3iso, A21Asp, B3Asp) и других родственных примесей определяли методом внутренней нормализации по площади абсорбции соответствующих пиков, измеренной в процентах от суммы площадей пиков, элюированных после никотинамида и консервантов.

Количество высокомолекулярного белка (ВМБ) определяли методом эксклюзионной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной силикагелем гидрофильным для хроматографии с размером частиц 10 мкм и диаметром пор 125 Å. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил: уксусная кислота ледяная : 0,1 % раствор аргинина (20 : 15 : 65) (V/V/V). Элюирование проводили со скоростью потока 0,5 мл/мин при длине волны детектирования 276 нм.

Содержание ВМБ определяли методом внутренней нормализации по сумме площадей абсорбции всех пиков с временами удерживания меньшими, чем у пика мономера инсулина аспарт. Пики с временами удерживания больше, чем у пика мономера инсулина аспарт (никотинамид и консерванты), в расчете не учитывались.

Для оценки физической стабильности белковых композиций проводили анализ на склонность к образованию фибрилл с помощью Тиофлавина-Т (ThT). Выбранный метод описан в литературе, например, в патенте RU2533217. Склонность к образованию фибрилл определяли для композиций 1 - 9, приведенных в примере 1, а также для готовой формы оригинального ЛП «Фиасп». В составе композиции 1 был воспроизведен состав ЛП «Фиасп». Анализ проводили сразу после приготовления композиций.

Приготовление растворов

Стоковый раствор тиофлавина

Берут точную навеску сухого реактива Тиофлавин Т, растворяют в метаноле до концентрации тиофлавина 1 мг/мл (что соответствует 3,14 мМ). Раствор тщательно перемешивают на вортексе, хранят защищая от света при температуре + 2 – 8 °C до 6 месяцев.

Рабочий раствор тиофлавина

Готовят рабочий раствор с концентрацией тиофлавина 200 мкМ в воде очищенной. Объем стокового раствора к воде очищенной рассчитывают в пропорции 1:14,7.

Используют свежеприготовленным.

Аликвоты образцов по 100 мкл в трипликатах помещают в черный 96-луночный планшет, в качестве контрольной пробы используют воду очищенную. Во все лунки вносили по 10 мкл рабочего раствора тиофлавина. При заполнении планшета избегают крайних лунок (см. фиг.1). Планшет запечатывают прозрачной пленкой, помещают в планшетный мультимодульный ридер CLARIOstar (BMG, Германия). Детектируют флуоресцентный сигнал каждые 20 минут в течение 12 часов при длине волны 445/485 нм. Между считываниями планшет перемешивают при 700 об/мин. Перемешивание и детекцию проводят при температуре 37 °С.

По результатам измерений строят графики зависимости сигнала в относительных единицах флуоресценции от времени в часах для каждого образца. Для анализа используют 4-х параметрическую зависимость.

По графику определяют T1/2max – время, за которое агрегирует половина анализируемого образца. При получении графика в виде прямой на уровне нулевого значения, образец признается не склонным к агрегации, в остальных случаях степень склонности к агрегации оценивается по T1/2max.

Наряду с T1/2max по кривой флуоресценции ThT визуально определяют время задержки как временную точку, в которой флуоресценция Тh Т отличается от фонового уровня.

Таблица 2. Данные по физической и химической стабильности инсулиновых композиций 1-9 из Таблицы 1 (пример 1)

Номер композиции Физическая стабильность (в анализе с тиофлавином Т) Химическая стабильность, измеряемая как разница между содержанием примесей после инкубации и до инкубации в течение 1 (1w) и 2 недель (2w) при 40°С . В28IsoAsp Сумма дезамидирован-ных форм B3iso, A21Asp, B3Asp Другие родственные примеси ВМБ Т1/2,ч время задержки, ч и мин 1w 2w 1w 2w 1w 2w 1w 2w 0* 8,2 3ч 20 мин 1,0 2,3 1,1 1,7 1,7 2,6 0,2 0,4 1 8,3 3ч 40 мин 0,9 2,0 1,1 1,6 1,4 2,5 0,2 0,4 2 ND** ND 0,8 1,7 0,9 1,5 1,3 2,3 0,1 0,3 3 ND ND 0,6 1,6 0,8 1,3 1,2 2,0 0,1 0,3 4 11 ч 7ч 00 мин 0,8 1,8 1,6 2,6 3,6 6,0 1,0 1,9 5 8,6 3ч 50 мин 0,6 1,6 0,4 1,1 0,5 1,6 0,2 0,3 6 ND ND 0,7 1,7 1,0 1,5 1,3 2,0 0,1 0,3 7 ND ND 0,6 1,7 0,8 1,3 1,1 2,1 0,1 0,3 8 ND ND 0,8 1,8 0,9 1,5 1,2 2,1 0,2 0,3 9 ND ND 0,8 1,9 1,0 1,4 1,3 2,2 0,1 0,3

* Оригинальный ЛП «Фиасп»

** «not detected», отсутствие фибрилл

На основании изучения химической и физической стабильности композиций инсулина аспарта, приготовленных с использованием как фосфатного буфера, так и трис-буфера, неожиданно было обнаружено, что при добавлении аминокислот, выбранных из лизина, аргинина и/или их солей и/или их комбинации в сочетании с такими поверхностно-активными веществами, как полоксамер 188, полисорбат 20 и полисорбат 80 или их комбинации количество примесей после 2 недель хранения при 40ºС в композициях по изобретению (в композициях 2, 3, 6-9) существенно и достоверно меньше, чем в аналоге, еще одним принципиальным преимуществом композиций по изобретению является повышение физической стабильности, а именно отсутствие склонности к фибрилляции. Для композиций по изобретению появление фибрилл не отмечалось (ND), однако при увеличении концентрации аминокислот в них выше 100 мМ физическая стабильность ухудшается, появляется склонность к фибрилляции.

Композиции 1–9, приготовленные способом, описанным в примере 1, подвергают испытаниям на физическую стабильность в тесте с ускорением. В стеклянные флаконы для ВЭЖХ объемом 2 мл помещают по три тефлоновых шарика диаметром 3/16 дюйма (4,7625 мм). Полностью заполняют образцами испытуемых композиций. Закрытые флаконы непрерывно встряхивают при 40 Гц (среднее линейное ускорение 20 × g) c амплитудой 12 мм при температуре 37°С, подвергая таким образом приготовленные композиции относительно высокому уровню термической и механической нагрузки, т. е. условиям, которые благоприятствуют физической нестабильности. Флаконы помещают на вибратор так, чтобы они в своем длинном измерении (от верха ко дну) были ориентированы параллельно направлению линейного ускорения, иными словами, их укладывают на бок на поверхности вибратора. Для других инсулиновых композиций было показано, что повышенная стабильность в описанных условиях ускорения коррелирует со значительно улучшенной стабильностью композиций при использовании. Периодически спектрофотометром измеряют мутность (оптическую плотность при 450 нм) испытуемых и контрольных образцов. Контрольные образцы готовят тем же способом, что и испытуемые, но хранят их при температуре 2 – 8°С без встряхивания. Вычисляют результирующее значение оптической плотности, вычитая от величины оптической плотности испытуемого образца величину оптической плотности контрольного образца. В таблице 3 приведены средние значения результирующей оптической плотности и значения стандартного отклонения для ряда образцов.

Таблица 3. Влияние состава композиций и времени экспозиции под действием механической энергии при 37° С на мутность (оптическую плотность при 450 нм)

Номер композиции Оптическая плотность при 450 нм 24 ч 72ч 120 ч 336 ч 1 0,85±0,73
(n=5) Не определяли Не определяли Не определяли 2 0,02±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 3 0,02±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 4 0,02±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 0,04±0,01
(n=5) 5 0,02±0,01
(n=5) 0,80±0,62
(n=5) Не определяли Не определяли 6 0,03±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 7 0,02±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 8 0,03±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,04±0,01
(n=5) 0,03±0,01
(n=5) 9 0,02±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5) 0,02±0,01
(n=5)

В описанных условиях эксперимента мутность готовых композиций, не содержащих комбинацию ПАВ и аминокислоты (композиция 1) или не содержащих только ПАВ (композиция 5), достигает высоких значений, которые становятся неприемлемыми к 24 часам для композиции 1 или к 72 часам для композиции 5, соответственно. Оптическая плотность всех композиций, содержащих поверхностно-активное вещество и аминокислоту, остается практически такой же, как у контрольных образцов в течение 336 ч эксперимента. Оптическая плотность композиции 4 также остается практически такой же, как у контрольных образцов, но содержание примесей химической деградации в этой композиции значительно выше, чем в образцах содержащих комбинацию ПАВ и аминокислоты.

На основе наблюдений, сделанных с использованием готовых форм других инсулинов, можно предположить, что столь неожиданно и значительно возросшая стабильность инсулиновых композиций, содержащих комбинацию ПАВ и аминокислоту, в тесте с ускорением будет перенесена на стабильность при их практическом использовании в течение периода времени более 336 ч, поскольку в проведенном испытании с ускорением композиции подвергаются более сильному воздействию, чем при использовании композиций в шприц-ручках и инфузионных системах.

Список литературы:

1. Lougheed W. D., Woulfe-Flanagan H., Clement J. R., Albisser A. M.  Insulin aggregation in artificial delivery systems. Diabetologia. 1980, 19(1), 1–9. doi:10.1007/bf00258302 

2. Fisher H., Porter P. B. Pharmaceutical. Pharmacology. 1980, 33:203–206.

3. Irsigler K., Kritz H.  Long-Term Continuous Intravenous Insulin Therapy with a Portable Insulin Dosage-regulating Apparatus. Diabetes. 1979, 28(3): 196–203. doi:10.2337/diab.28.3.196 

4. Weisenfeld S., Podolsky S. Goldsmith, L. Ziff L.  Adsorption of Insulin to Infusion Bottles and Tubing. Diabetes. 1968, 17(12): 766–771. doi:10.2337/diab.17.12.766

5. Browe et al. European  Journal of Biochemistry. 1973, 33:233.

6. Селиванова О. М., Гришин С. Ю., Глякина А. В. и др. Анализ аналогов инсулина и стратегия их дальнейшей разработки. Успехи биологической химии. 2018, 58: 313-346.

7. Brange J., Owens D. R., Kang S., Volund A.  Monomeric Insulins and Their Experimental and Clinical Implications. Diabetes Care. 1990, 13(9), 923–954. doi:10.2337/diacare.13.9.923

8. Schlein M. Insulin Formulation Characterization - the Thioflavin T Assays. AAPS Journal. 2017, 19(2): 397 - 408.

9. Инструкция по применению лекарственного препарата для медицинского применения «Фиасп». URL: http://grls.rosminzdrav.ru (дата обращения 30.08.22).

10. Brange J. Stability of Insulin. Kluwer Academic Publisher. 1994, 18–23.

11. Paquot N., Scheen A. J. Faster aspart insulin (FIASP®). Revue Medicale de Liege. 2018; 73 (4): 211-215.

12. Muchmore D. B. Pump Users Clamor for Faster Insulin: Is Fast-Acting Insulin Aspart Ready for Them? Journal of Diabetes Science and Technology. 2018; 12(1): 152–154. doi:10.1177/1932296817750166

13. Ahem T. J., Manning M. C. Stability of Protein Pharmaceuticals. Plenum Press. New York. 1992.

Группа изобретений относится к фармацевтике и медицине. Предложены водная композиция для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, содержащая инсулин аспарт (B28Asp), соединение никотиновой кислоты, одну или более аминокислоту или ее соль, выбранную из лизина, аргинина или их солей в концентрации от 1 до 100 мМ, и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,001 до 0,05 масс./об., и инъецируемый инсулиновый препарат для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, содержащий композицию. Изобретения обеспечивают повышение как химической, так и физической стабильности инсулина аспарта. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Водная композиция для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, содержащая инсулин аспарт (B28Asp), соединение никотиновой кислоты, одну или более аминокислоту или ее соль, выбранную из лизина, аргинина или их солей в концентрации от 1 до 100 мМ, и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в концентрации от 0,001 до 0,05 масс./об.

2. Водная композиция по п. 1, которая в качестве ПАВ содержит одно или более поверхностно-активное вещество, выбранное из полоксамера 188, полисорбата 20 и полисорбата 80.

3. Водная композиция по п. 1, в которой инсулин аспарт (B28Asp) присутствует в количестве от 0,2 мМ (33 Ед./мл) до 2 мМ (333 Ед./мл).

4. Водная композиция по п. 1, в которой инсулин аспарт присутствует в количестве от 0,3 мМ (50 Ед./мл) до 1,2 мМ (200 Ед./мл).

5. Водная композиция по п. 1, в которой соединением никотиновой кислоты является никотинамид.

6. Водная композиция по п. 1, содержащая от 1 до 200 мМ никотинамида.

7. Водная композиция по п. 1, содержащая от 1 до 100 мМ комбинации аргинина или его соли с лизином или его солью.

8. Водная композиция по п. 1, содержащая одно или более поверхностно-активное вещество, выбранное из полоксамера 188, полисорбата 20 и полисорбата 80 в концентрации от примерно 0,001 до 0,05 % масс./об.

9. Водная композиция по п. 1, дополнительно содержащая ион металла, консервант(ы), изотонический агент(ы) и стабилизатор(ы), буфер(ы) и регуляторы кислотности.

10. Водная композиция по любому из пп. 1‒9 для применения в лечении или профилактике гипергликемии, сахарного диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, сахарного диабета 1 типа.

11. Инъецируемый инсулиновый препарат для снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, содержащий композицию по любому из пп. 1-9.