ИМПЛАНТИРУЕМЫЕ ЧАСТИЦЫ И СООТВЕТСТВУЮЩИЕ СПОСОБЫ Российский патент 2025 года по МПК A61K9/50 A61K35/00 C08B37/00 

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/652 880, поданной 4 апреля 2018 года, заявки на патент США № 62/737 838, поданной 27 сентября 2018 года, а также заявки на патент США № 62/812 568, поданной 1 марта 2019 года. Раскрытие каждой из вышеупомянутых заявок включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 26 сентября 2018 года, имеет название S2225-7022WO_SL.txt, и ее размер составляет 205145 байт.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Функция имплантируемых частиц, содержащих сконструированные клетки, зависит от множества факторов, в том числе способности предоставлять продукт и пути биологического иммунного ответа у реципиента (Anderson et al., Semin Immunol (2008) 20:86-100; Langer, Adv Mater (2009) 21:3235-3236). Характеристики таких частиц после имплантации будут в значительной степени зависеть от их биосовместимости, в том числе степени, в которой они являются противофиброзными, например, их способности не допускать или ослаблять реакцию на инородное тело. В нескольких публикациях сообщалось, что реакция на инородное тело (FBR), развивающаяся в отношении имплантируемых гидрогелевых капсул у грызунов и отличных от человека приматов, может быть значительно снижена за счет применения сферических капсул, которые имеют размер по меньшей мере 1 мм в диаметре, например милликапсулы (Veiseh, O., et al, Nature Materials 14:643-652 (2015); WO2014/153126; WO2016/187225), и/или которые получают с использованием гидрогельобразующих полимеров, которые химически модифицированы с помощью определенных соединений, которые ослабляют FBR (Vegas, A., et al., Nature Medicine 22(3):306-311 (2016), Vegas, A., et al., Nature Biotechnology 34(3):345-352 (2016); WO 2012/167223; WO 2017/075631).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны частицы, содержащие первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I) (например, как описано в данном документе), а также композиции и способы их изготовления и применения. В некоторых вариантах осуществления частица содержит клетку (например клетку, описанную в данном документе). В некоторых вариантах осуществления клетка продуцирует терапевтическое средство, применимое, например, для лечения заболевания, нарушения или состояния у субъекта, например, нарушения свертываемости крови или лизосомной болезни накопления. В некоторых вариантах осуществления частица способна модулировать иммунный ответ (например, FBR) или эффект иммунного ответа (например, FBR) у субъекта.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к частице, содержащей а) первый компартмент; б) второй компартмент и c) соединение формулы (I):

(I) или его фармацевтически приемлемую соль, где переменные A, L¹, M, L², P, L³ и Z, а также соответствующие подпеременные определены в данном документе. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент окружен вторым компартментом. В некоторых вариантах осуществления второй компартмент образует барьер вокруг первого компартмента. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления второй компартмент содержит соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления каждый из первого и второго компартментов независимо содержит соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) размещено на наружной поверхности частицы.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль (например, формул (I-a), (I-b), (I-c), (I-d), (I-e), (I-f), (II), (II-a), (III), (III-a), (III-b), (III-c) или (III-d)) представляют собой соединение, описанное в данном документе. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой одно из соединений, представленных в таблице 2 в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из компартментов в частице содержит полимер. В некоторых вариантах осуществления как первый компартмент, так и второй компартмент частицы содержат полимер (например, полисахарид, например, альгинат). В некоторых вариантах осуществления первый компартмент и второй компартмент частицы содержат одинаковый полимер. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент и второй компартмент частицы содержат различающийся полимер.

В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид или другой гидрогельобразующий полимер (например, альгинат, гиалуронат или хондроитин). В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой альгинат. В некоторых вариантах осуществления частица содержит альгинат, который химически модифицирован с помощью соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления химически модифицированный альгинат имеет низкую молекулярную массу (например, примерную молекулярную массу <75 кДа). В некоторых вариантах осуществления частица содержит смесь химически модифицированного альгината и немодифицированного альгината. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой гидрогелевую капсулу. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой милликапсулу или микрокапсулу (например, гидрогелевую милликапсулу или гидрогелевую микрокапсулу).

В некоторых вариантах осуществления частица является сферической. В некоторых вариантах осуществления общий объем (как определено в данном документе) второго компартмента больше (например, > в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз), чем объем первого компартмента. В некоторых вариантах осуществления дифференциальный объем (как определено в данном документе) второго компартмента меньше (например, < в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз) объема первого компартмента. В некоторых вариантах осуществления общий объем второго компартмента на приблизительно 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% больше, чем объем первого компартмента. В некоторых вариантах осуществления дифференциальный объем первого компартмента больше (например, > в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз), чем объем второго компартмента. В некоторых вариантах осуществления общий объем первого компартмента на приблизительно 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% больше, чем объем второго компартмента.

В некоторых вариантах осуществления частица характеризуется наибольшим линейным размером (LLD), например диаметром, составляющим от приблизительно 20 нанометров до приблизительно 10 миллиметров. В некоторых вариантах осуществления наибольший линейный размер (LLD), например диаметр, частицы составляет от приблизительно 500 нанометров до приблизительно 10 миллиметров, от приблизительно 1 миллиметра до 10 миллиметров, от приблизительно 1 миллиметра до 5 миллиметров, от приблизительно 1 миллиметра до 4 миллиметров, от приблизительно 1 миллиметра до 3 миллиметров, от приблизительно 1 миллиметра до 2 миллиметров или от приблизительно 1,5 миллиметра до 2 миллиметров или приблизительно 1,5 миллиметра.

В некоторых вариантах осуществления среднее расстояние между внешней границей второго (внешнего) компартмента и границей раздела составляет от приблизительно 1 нанометра до 1 миллиметра, например, от приблизительно 100 нанометров до 1 миллиметра, от приблизительно 500 нанометров до приблизительно 1 миллиметра или от приблизительно 500 нанометров до 500 микрометров.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит клетку. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит клетку и/или второй компартмент содержит клетку. В некоторых вариантах осуществления как первый компартмент, так и второй компартмент содержат клетки одного и того же типа или клетки разных типов. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит клетку, а второй компартмент не содержит клетку. Описанная в данном документе частица может содержать совокупность клеток. Клетка или совокупность клеток могут присутствовать в частице в виде отдельных клеток, кластеров клеток (например, в виде сфероидов) или являться присоединенными к микроносителю. В некоторых вариантах осуществления частица сформирована из полимерного раствора и содержит любое количество из по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250 или 400 миллионов клеток/мл полимерного раствора или любое число между этими значениями. В некоторых вариантах осуществления частица содержит эпителиальную клетку, эндотелиальную клетку, фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку, кератиноцит, или островковую клетку, или клетку, полученную из клетки любого из вышеуказанных типов. В некоторых вариантах осуществления частица содержит клетку пигментного эпителия сетчатки (клетки RPE) или мезенхимальную стволовую клетку (MSC). В некоторых вариантах осуществления частица содержит сконструированную клетку (например, сконструированную клетку RPE или сконструированную MSC).

В некоторых вариантах осуществления частица содержит клетку, которая экспрессирует терапевтическое средство, такое как нуклеиновая кислота (например, нуклеотид, ДНК или РНК), полипептид, липид, сахар (например, моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид) или малая молекула. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой средство заместительной терапии или заместительный белок, например, применимые для лечения нарушения свертываемости крови или лизосомной болезни накопления у субъекта. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой полипептид, например, белок фактора VIII или его вариант, или белок фактора IX или его вариант.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к препарату на основе совокупности частиц, при этом одна или несколько частиц в совокупности частиц содержит: а) первый компартмент; b) второй компартмент и c) соединение формулы (I), как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления каждая частица в совокупности частиц содержит первый и второй компартменты и соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более частиц в совокупности частиц являются сферическими частицами. В некоторых вариантах осуществления препарат представляет собой фармацевтически приемлемый препарат.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления частицы, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент частицы формируется одновременно со вторым компартментом частицы. В некоторых вариантах осуществления способ включает применение электростатического генератора капель, оснащенного коаксиальной иглой, для получения множества капель из первого и второго полимерных растворов, которые содержат гидрогельобразующий полимер или смесь гидрогельобразующих полимеров. В некоторых вариантах осуществления полимер или смесь полимеров модифицированы с помощью соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой альгинат. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение капель в контакт с раствором для сшивания, содержащим многовалентные катионы, с сшиванием каждой капли в частицу (например, гидрогелевую капсулу с внутренним и внешним компартментом). В некоторых вариантах осуществления раствор для сшивания содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность. В некоторых вариантах осуществления раствор для сшивания дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу имплантации частицы, описанной в данном документе, в организм субъекта. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предоставления вещества (например, терапевтического средства, например, полипептида) субъекту, включающему введение субъекту частицы, описанной в данном документе, при этом частица содержит вещество или обладает способностью к его продуцированию. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в веществе (например, терапевтическом средстве, например, полипептиде), включающему введение субъекту частицы, описанной в данном документе, при этом частица содержит вещество или обладает способностью к его продуцированию. В некоторых вариантах осуществления стадия введения предусматривает имплантацию в организм субъекта фармацевтически приемлемого препарата, содержащего совокупность частиц, каждая из которых содержит вещество или обладает способностью к его продуцированию. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки частицы, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение частицы, описанной в данном документе, и оценку структурного или функционального параметра частицы. В некоторых вариантах осуществления способ включает оценку частицы или совокупности частиц, описанных в данном документе, в отношении одного или нескольких из: а) структурной целостности; b) жизнеспособности клеток; с) продуцирования терапевтического средства (например, полипептида); d) поглощения питательного вещества или кислорода; е) продуцирования продукта жизнедеятельности и f) фиброза. В некоторых вариантах осуществления оценку выполняют через по меньшей мере 1, 5, 10, 20, 30, 60, 90 или 120 дней после получения частицы или введения частицы субъекту. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).

Подробные сведения, касающиеся одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения, изложены в данном документе. Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания, описания фигур, примеров и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показана иллюстративная сферическая частица по настоящему изобретению, при этом линии обозначают: первый внутренний компартмент и клетки, инкапсулированные в нем; второй внешний компартмент с внешней границей и границу раздела между первым и вторым компартментами.

На фиг. 2A - 2B показаны иллюстративные аминокислотные последовательности, кодируемые иллюстративными сконструированными клетками, при этом на фиг. 2A показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) белка фактора VIII-BDD, кодируемого иллюстративной сконструированной клеткой, а на фиг. 2В показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) белка фактора IX человека дикого типа.

На фиг. 3 представлен график, на котором сравнивается качество однокомпартментных и двухкомпартментных гидрогелевых капсул как функции эквивалентной клеточной нагрузки (миллион клеток/мл альгината), при этом мл альгината представляет собой суммарное количество альгината, применяемого для получения первого (внутреннего) компартмента и второго (внешнего) компартмента двухкомпартментных капсул.

На фиг. 4A - 4B показано влияние изменения скорости потока экструдируемого альгината на толщину второго (внешнего) компартмента иллюстративной частицы по настоящему изобретению (т. е. двухкамерной гидрогелевой милликапсулы). На фиг. 4A представлен график, на котором показана средняя толщина второго (внешнего) компартмента для частиц (диаметром приблизительно 1,5 миллиметра (мм)), полученных путем варьирования скоростей потока полимерных растворов, применяемых для получения первого (внутреннего) компартмента и второго (внешнего) компартмента. На фиг. 4B представлена таблица значений процентной доли объема первого (внутреннего) компартмента и второго (внешнего) компартмента и полученной в результате толщины компартментов.

На фиг. 5 представлен график, на котором показаны показатели первоначального разрыва для иллюстративных частиц по настоящему изобретению (т. е. двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул) при варьирующихся соотношениях скоростей потоков (мл/ч) для внутреннего и внешнего компартментов. Полимер в первом компартменте (внутреннем) представляет собой немодифицированный высокомолекулярный альгинат, а полимер во втором компартменте (внешнем) представляет собой смесь химически модифицированного низкомолекулярного альгината и немодифицированного высокомолекулярного альгината с соотношением химически модифицированного и немодифицированного альгината, составляющим 70:30.

На фиг. 6A - 6D представлены полученные посредством светлопольной микроскопии изображения иллюстративных частиц (т. е. двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул) с соотношением объемов внутреннего и внешнего компартментов, составляющим 50:50. Второй (внешний) компартмент содержит низкие, средние или высокие уровни конъюгированного альгината или контрольный (немодифицированный) альгинат. Иллюстративные клетки RPE, сконструированные для экспрессии экзогенного белка, инкапсулировали в первый (внутренний) компартмент для визуализации двухкомпартментной конструкции.

На фиг. 7A - 7F проиллюстрирован эффект в отношении развития фиброза in vivo при варьировании степени химической модификации альгината, содержащегося во втором (внешнем) компартменте иллюстративных частиц (т. е. двухкомпартментых гидрогелевых милликапсул). На фиг. 7A - 7E представлены изображения частиц, полученные посредством светлопольной микроскопии от мышей C57/BL6 через 1 неделю после имплантации. Частицы, содержащие сконструированные клетки RPE в первом (внутреннем) компартменте, имеют вторые (внешние) компартменты, состоящие из: (i) низких, средних или высоких уровней альгината, конъюгированного с соединением формулы (I), (ii) немодифицированного альгината, или представляют собой (iii) пустые капсулы, состоящие из средних уровней альгината, конъюгированного с соединением формулы (I). На фиг. 7F представлен график, на котором сравниваются усредненные показатели первоначального разрыва частиц до осуществления имплантации в мышиную модель (исходный уровень, столбцы черного цвета) и после извлечения через 7 дней после имплантации мышам C57/BL6 (уровень при извлечении, столбцы серого цвета).

На фиг. 8A - 8E представлены изображения, на которых сравниваются различные гидрогелевые милликапсулы и их эффект в отношении развития фиброзного ответа. На схемах показаны милликапсулы, извлеченные из мышей C57/BL6 через 2 недели после имплантации. Фиг. 8A: пустые капсулы, не содержащие клеток. Фиг. 8B: однокомпартментные капсулы с 5000 клеток/капсула; фиг. 8C: двухкомпартментные капсулы с 5000 клеток/капсула. Фиг. 8D: двухкомпартментные капсулы с 2500 клеток/капсула; фиг. 8E: двухкомпартментные капсулы с 2500 клеток/капсула и более плотным вторым (внешним) компартментом.

На фиг. 9A - 9K представлены изображения с иммунофлуоресцентным окрашиванием, на которых сравнивается уровень адгезии макрофагов in vivo на иллюстративных частицах (например, двухкомпартментных гидрогелевых милликапсулах) с варьирующимися (низкими, средними или высокими) количествами химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте через 1, 2 и 4 недели после имплантации мышам C57/BL6. В эти эксперименты включали положительный контроль (SLG20: немодифицированный альгинат со средней MW) и отрицательный контроль (пустая капсула).

На фиг. 10A - 10E представлены полученные посредством светлопольной микроскопии изображения, на которых показан уровень фиброзного ответа на иллюстративные частицы (т. е. двухкомпартментные гидрогелевые милликапсулы) через 2 недели после имплантации мышам C57/BL6. Частицы содержали варьирующиеся (средние, умеренно высокие, высокие или двойные высокие) количества химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте. Также включали отрицательную контрольную (пустую) капсулу со средним количеством химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте.

На фиг. 11 представлен график, на котором сравниваются усредненные показатели первоначального разрыва частиц до осуществления имплантации в мышиную модель (исходный уровень, столбцы черного цвета) и после извлечения через 2 недели после имплантации мышам C57/BL6 (уровень при извлечении, столбцы серого цвета). Частицы содержали варьирующиеся (средние, умеренно высокие, высокие или двойные высокие) количества химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте. Включали отрицательную контрольную (пустую) капсулу со средним количеством химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте.

На фиг. 12A - 12C представлены полученные посредством светлопольной микроскопии изображения, на которых показан уровень фиброзного ответа in vivo на иллюстративные частицы (т. е. двухкомпартментные гидрогелевые милликапсулы) либо с варьирующимися (средними или высокими) количествами химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте, либо с неконъюгированными малыми противофиброзными молекулами (например, соединение формулы (I)) во втором (внешнем) компартменте (капсулы с "возвращенным амином") через 2 недели после имплантации мышам C57/BL6.

На фиг. 13A - 13F представлены изображения с иммунофлуоресцентным окрашиванием, на которых сравнивается уровень адгезии макрофагов in vivo на иллюстративных частицах (т. е. двухкомпартментных гидрогелевых милликапсулах) с различающимися вторыми (внешними) компартментами. Вторые (внешние) компартменты получали из смесей с соотношением химически модифицированного низкомолекулярного альгината (CM-LMW) и немодифицированного высокомолекулярного альгината (U-HMW), составляющим либо 70:30, либо 60:40, а также предусматривая варьирующиеся (средние, умеренно высокие или высокие) количества химически модифицированного альгината во втором (внешнем) компартменте.

На фиг. 14A - 14D представлены полученные посредством светлопольной микроскопии изображения инкапсулированных клеток HEK293F в одно- или двухкомпартментных гидрогелевых милликапсулах, которые культивировали в течение 1 недели после инкапсуляции. Фиг. 14A - 14B соответствуют изображениям однокомпартментных или двухкомпартментных капсул. Фиг. 14C - 14D соответствуют изображениям поверхности культуры для идентификации клеток, не содержащихся в капсулах, после 1-недельной инкубации при 37°C.

На фиг. 15A - 15C проиллюстрирована корреляция между уровнями экспрессии in vivo FIX, обеспечиваемыми двухкомпартментными гидрогелевыми милликапсулами, и концентрацией клеток ARPE-19:FIX во внутреннем компартменте капсул. На фиг. 15А показано число клеток в капсулах, полученных с использованием различной нагрузочной концентрации клеток, до имплантации в интраперитонеальное пространство мышам (исходное количество) и после извлечения через пять дней после имплантации (количество при извлечении). На фиг. 15В и 15С показаны уровни FIX в плазме крови и интраперитонеальной жидкости соответственно, обеспечиваемые имплантированными капсулами.

На фиг. 16A - 16C проиллюстрирована корреляция между уровнями экспрессии in vivo FIX, обеспечиваемыми двухкомпартментными гидрогелевыми милликапсулами, концентрацией клеток ARPE-19:FIX во внутреннем компартменте капсул и целостностью капсул. На фиг. 16А показаны уровни FIX в интраперитонеальной жидкости мышей, которым имплантировали капсулы. На фиг. 16B представлены полученные посредством светлопольной микроскопии изображения капсул, полученных с использованием 646 млн./мл клеток, в моменты времени до имплантации (начальный) и при извлечении.

На фиг. 17 в таблицах 4-8 показаны иллюстративные аминокислотные последовательности и кодирующие последовательности терапевтических полипептидов, а также нуклеотидные последовательности, содержащиеся в иллюстративном векторе экспрессии, применимом для конструирования клеток RPE.

На фиг. 18A - 18B представлены полученные посредством светлопольной микроскопии изображения иллюстративных частиц (т. е. двухкомпартментных гидрогелевых капсул диаметром приблизительно 0,75 мм (фиг. 18A) или диаметром приблизительно 1,0 мм (фиг. 18B) с соотношением объемов внутреннего и внешнего компартментов, составляющим 50:50. Каждый из первого (внутреннего) и второго (внешнего) компартментов содержит средние уровни конъюгированного альгината. Иллюстративные клетки RPE, сконструированные для экспрессии экзогенного белка, инкапсулировали в первый (внутренний) компартмент для визуализации двухкомпартментной конструкции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении описана частица, содержащая первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I) (например, как описано в данном документе), а также композиции и способы ее изготовления и применения. В некоторых вариантах осуществления частицы и композиции на их основе являются применимыми для предупреждения или лечения заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления частицы, выполненные в виде гидрогелевых милликапсул, содержащих первый гидрогелевый компартмент, второй гидрогелевый компартмент и соединение формулы (I), проявляют полезные свойства, например, они характеризуются более высоким уровнем противофиброзной активности, чем аналогичные милликапсулы, не содержащие соединения формулы (I), но состоящие из полимера того же типа и имеющие по сути такой же размер, а также они могут вмещать большее число клеток, оказывая при этом минимальный отрицательный эффект в отношении качества капсулы по сравнению с милликапсулами, содержащими один компартмент. В некоторых вариантах осуществления частицы, описанные в данном документе, содержат клетку (например, сконструированную клетку), которая продуцирует терапевтическое средство (например, полипептид), подходящее для лечения заболевания, нарушения или состояния у субъекта.

Сокращения и определения

Во всем подробном описании и примерах настоящего изобретения будут использоваться следующие сокращения.

CM-Alg химически модифицированный альгинат

CM-LMW-Alg химически модифицированный низкомолекулярный альгинат

CM-LMW-Alg-101 низкомолекулярный альгинат, химически модифицированный с помощью соединения 101, представленного в таблице 2

CM-HMW-Alg химически модифицированный высокомолекулярный альгинат

CM-HMW-Alg-101 высокомолекулярный альгинат, химически модифицированный с помощью соединения 101, представленного в таблице 2

CM-MMW-Alg химически модифицированный среднемолекулярный альгинат

CM-MMW-Alg-101 среднемолекулярный альгинат, химически модифицированный с помощью соединения 101, представленного в таблице 2

HMW-Alg высокомолекулярный альгинат

MMW-Alg среднемолекулярный альгинат

U-Alg немодифицированный альгинат

U-HMW-Alg немодифицированный высокомолекулярный альгинат

U-LMW-Alg немодифицированный низкомолекулярный альгинат

U-MMW-Alg немодифицированный среднемолекулярный альгинат

70:30 CM-Alg:U-Alg смесь 70:30 (объем:объем) химически модифицированного альгината и немодифицированного альгината

В целях обеспечения более легкого понимания настоящего изобретения определенные технические и научные термины, используемые в данном документе, конкретно определены ниже. Если явно не определено в каких-либо других частях данного документа, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Используемые в данном документе, в том числе в прилагаемой формуле изобретения, слова в форме единственного числа включают ссылки на их соответствующие формы множественного числа, если иное явно не очевидно из контекста.

Термин "приблизительно" при использовании в данном документе для модификации представленного в числовом виде параметра (например, физического описания гидрогелевой капсулы, как например диаметр, сферичность, число клеток в частице, число частиц в препарате) означает, что значение параметра может отклоняться на 15% выше или ниже указанного числового значения этого параметра. Например, гидрогелевая капсула, определенная как имеющая диаметр приблизительно 1,5 миллиметра (мм) и инкапсулирующая приблизительно 5 миллионов (млн.) клеток, может иметь диаметр от 1,275 до 1,725 мм и может инкапсулировать приблизительно 4,25-5,75 млн. клеток. В некоторых вариантах осуществления приблизительно означает, что параметр может отклоняться на целых 10% выше или ниже указанного числового значения этого параметра.

Используемые в данном документе выражения "собирать данные" или "сбор данных" относятся к получению величины, например, числового значения, или фотографии, или физического объекта (например, образца), путем "непосредственного сбора данных" или "опосредованного сбора данных" для величины или физического объекта. "Непосредственный сбор данных" означает выполнение процесса (например, осуществление аналитического метода или протокола) для получения величины или физического объекта. "Опосредованный сбор данных" относится к получению величины или физического объекта от другой стороны или источника (например, лаборатории третьей стороны, которая провела непосредственный сбор данных для физического объекта или величины). Непосредственный сбор данных для величины или физического объекта включает выполнение процесса, который включает физическое изменение физического вещества или применение прибора или устройства. Примеры непосредственного сбора данных для величины включают получение образца от субъекта-человека. Непосредственный сбор данных для величины включает выполнение процесса, в котором применяют прибор или устройство, например, флуоресцентный микроскоп, для сбора данных флуоресцентной микроскопии.

Термины "вводить", "осуществлять введение" или "введение", используемые в данном документе, относятся к имплантации, всасыванию, проглатыванию, инъекции или иному внедрению объекта, описанного в данном документе (например, частицы, содержащей первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I) (в том числе частицы, инкапсулирующие клетки, например, сконструированные клетки RPE), или композиции, содержащей указанные частицы), в организм субъекта или предоставлению вышеуказанного субъекту.

Термин "противофиброзный", используемый в данном документе, относится к соединению или материалу, которые ослабляют реакцию на инородное тело (FBR). Например, уровень FBR в биологической ткани, который индуцируется имплантацией в эту ткань частицы (например, гидрогелевой капсулы), содержащей противофиброзное соединение (например, соединение формулы (I), например, соединение, указанное в таблице 2), является более низким, чем уровень FBR, индуцированный имплантацией эталонной не обеспечивающей противофиброзной активности частицы, т. е. частицы, которая не содержит противофиброзного соединения или материала, но по сути имеет тот же состав (например, клетки того же типа(ов)) и структуру (например, размер, форму, число компартментов, одинаковые инкапсулирующие полимеры и т. д.). В одном варианте осуществления степень FBR оценивается по иммунологическому ответу в ткани, содержащей имплантированную частицу (например, гидрогелевую капсулу), который может включать, например, адсорбцию белка, макрофаги, многоядерные гигантские клетки инородных тел, фибробласты и ангиогенез, с помощью анализов, известных в данной области техники, например, как описано в WO 2017/075630, или с помощью одного или нескольких анализов/способов, описанных Vegas, A., et al., Nature Biotechnol (см. выше) (например, измерение подкожного катепсина в имплантированных капсулах, окрашивание срезов тканей трихромом по Массону (МТ), гематоксилином или эозином, количественная оценка плотности коллагена, окрашивание клеток и конфокальная микроскопия макрофагов (CD68 или F4/80), миофибробластов (альфа-мышечный актин, SMA) или общего отложения клеток, количественная оценка 79 последовательностей РНК известных факторов воспаления и маркеров иммунных клеток или анализ FACS клеток, представляющих собой макрофаги и нейтрофилы, на извлеченных частицах (например, капсулах) по истечении заданного периода времени (например, 14 дней) во внутрибрюшинном пространстве подходящего испытуемого субъекта, например, иммунокомпетентной мыши. В одном варианте осуществления FBR оценивается путем измерения уровней в ткани, содержащей имплантат, одного или нескольких биомаркеров иммунного ответа, например катепсина, TNF-α, IL-13, IL-6, G-CSF, GM-CSF, IL-4, CCL2 или CCL4. В некоторых вариантах осуществления уровень FBR, индуцированный частицей, описанной в данном документе (например, двухкомпартментной гидрогелевой капсулой, содержащей противофиброзное соединение, размещенное во внешнем компартменте и/или на его поверхности), на по меньшей мере приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99% или приблизительно 100% ниже, чем уровень FBR, индуцированный эталонной частицей, не обеспечивающей активности в отношении FBR, например частицей, которая по сути идентична заявленной частице, за исключением отсутствия наличия в ней противофиброзного соединения или материала, но в остальном по сути идентична заявленной частице. В некоторых вариантах осуществления FBR (например, уровень(и) биомаркера FBR), индуцированная имплантированной частицей, измеряется через приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 1 день, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 1 месяц, приблизительно 2 месяца, приблизительно 3 месяца, приблизительно 6 месяцев или дольше.

Термин "клетка", используемый в данном документе, относится к сконструированной клетке или клетке, которая не является сконструированной. В одном варианте осуществления клетка представляет собой иммортализованную клетку.

Используемые в данном документе "консервативно модифицированные варианты" или "консервативная замена", относятся к варианту эталонного пептида или полипептида, который идентичен эталонной молекуле, за исключением наличия одной или нескольких консервативных аминокислотных замен в его аминокислотной последовательности. В одном варианте осуществления консервативно модифицированный вариант состоит из аминокислотной последовательности, которая на по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентична эталонной аминокислотной последовательности. Консервативная аминокислотная замена относится к замене аминокислоты аминокислотой, имеющей аналогичные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию и жесткость основной цепи и т. д.) и которая оказывает минимальное влияние на биологическую активность полученного пептида или полипептида, содержащего замену. Таблицы консервативных замен функционально аналогичных аминокислот хорошо известны в данной области техники, и иллюстративные замены, сгруппированные по функциональным признакам, изложены в таблице 1 ниже.

Таблица 1. Иллюстративные группы консервативных аминокислотных замен.

Признак Группа аминокислот для консервативной замены Заряд/Полярность His, Arg, Lys Asp, Glu Cys, Thr, Ser, Gly, Asn, Gln, Tyr Ala, Pro, Met, Leu, Ile, Val, Phe, Trp Гидрофобность Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, Lys Cys, Ser, Thr, Pro, Gly, His, Tyr Ala, Met, Ile Leu, Val, Phe, Trp Структура/экспозиция на поверхности Asp, Glu, Asn, Aln, His, Arg, Lys Cys, Ser, Tyr, Pro, Ala, Gly, Trp, Tyr Met, Ile, Leu, Val, Phe Склонность к образованию вторичной структуры Ala, Glu, Aln, His, Lys, Met, Leu, Arg Cys, Thr, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp Ser, Gly, Pro, Asp, Asn Эволюционная консервативность Asp, Glu His, Lys, Arg Asn, Gln Ser, Thr Leu, Ile, Val Phe, Tyr, Trp Ala, Gly Met, Cys

"По сути состоит из" и вариации, такие как "по сути состоят из" или "по сути состоящие из", используемые на протяжении всего описания и формулы настоящего изобретения, указывают на включение любых перечисленных элементов или группы элементов и необязательное включение других элементов, по своей природе аналогичных перечисленным элементам или отличных от них, которые не изменяют существенным образом основные или новые свойства указанной молекулы, композиции, частицы или способа. В качестве неограничивающего примера, терапевтический белок, который по сути состоит из перечисленной аминокислотной последовательности, может также включать одну или несколько аминокислот, в том числе замены в перечисленной аминокислотной последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков, которые соответственно не оказывают существенного влияния на соответствующую биологическую активность терапевтического белка. В качестве другого неограничивающего примера полипептид, который по сути состоит из указанной аминокислотной последовательности, может содержать один или несколько ковалентно присоединенных фрагментов (например, радиоактивную или флуоресцентную метку), которые существенно не изменяют соответствующую биологическую активность полипептида.

Термин "полученный из", используемый в данном документе в контексте клетки или клеток, относится к клетке или клеткам, выделенным из ткани, линии клеток или других клеток, которые затем необязательно культивируются, пассируются, иммортализируются, дифференцируются и/или индуцируются с получением производной(ых) клетки(ок).

Термин "дифференциальный объем", используемый в данном документе, относится к объему одного компартмента в пределах частицы, который исключает пространство, занимаемое другим(и) компартментом(ами). Например, дифференциальный объем второго компартмента в 2-компартментной частице относится к объему внутри второго (например, внешнего) компартмента, который исключает пространство, занимаемое первым компартментом.

Используемое в данном документе выражение "эффективное количество" относится к количеству композиции на основе частиц (например, содержащей частицы композиции) или компонента частицы, например, клетки, например, сконструированной клетки, или средства, например, терапевтического средства, продуцируемого клеткой, например, сконструированной клеткой, достаточному для того, чтобы вызвать биологический ответ, например, для лечения заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления термин "эффективное количество" относится к количеству компонента частицы, например, количеству клеток в частице, концентрации или плотности противофиброзного соединения, размещенного на поверхности частицы и/или во внешнем компартменте. Как будет понятно специалистам в данной области техники, эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как требуемая биологическая конечная точка, фармакокинетика терапевтического средства, композиции или частицы, состояние, подлежащее лечению, путь введения, а также возраст и состояние здоровья субъекта. Эффективное количество охватывает терапевтическое и профилактическое лечение. Например, для ослабления FBR, индуцированной частицей, эффективное для обеспечения противофиброзной активности количество соединения формулы (I) может приводить к уменьшению фиброза или остановке роста или распространения фиброзной ткани на имплантированной частице или возле нее. Эффективное для обеспечения противофиброзной активности количество частицы, композиции или ее компонента (например, противофиброзного соединения, например, противофиброзного полимера) может быть определено посредством любой методики, известной в данной области техники или описанной в данном документе.

Используемая в данном документе "эндогенная нуклеиновая кислота" представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в норме встречается в клетке субъекта.

Используемый в данном документе "эндогенный полипептид" представляет собой полипептид, который в норме встречается в клетке субъекта.

Используемая в данном документе "сконструированная клетка" представляет собой клетку (например, клетку RPE) с не встречающимся в природе изменением, и она, как правило, содержит последовательность нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК) или полипептид, не присутствующие (или присутствующие на другом уровне) в аналогичной в остальных аспектах клетке, которая не является сконструированной (не содержит экзогенной последовательности нуклеиновой кислоты), в аналогичных условиях. В одном варианте осуществления сконструированная клетка содержит экзогенную нуклеиновую кислоту (например, вектор или измененную хромосомную последовательность). В одном варианте осуществления сконструированная клетка содержит экзогенный полипептид. В одном варианте осуществления сконструированная клетка содержит экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, например, последовательность, например, ДНК или РНК, не присутствующую в аналогичной клетке, которая не является сконструированной. В одном варианте осуществления экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой хромосому, например, экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой экзогенную последовательность, размещенную в эндогенной хромосомной последовательности. В одном варианте осуществления экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты является хромосомной или внехромосомной, например, представляет собой неинтегрированный вектор. В одном варианте осуществления экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает последовательность РНК, например, mRNA. В одном варианте осуществления экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает хромосомную или внехромосомную экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, которая экспрессируется в виде РНК, например, mRNA или регуляторной РНК. В одном варианте осуществления экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты предусматривает хромосомную или внехромосомную последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность, которая кодирует полипептид или которая экспрессируется в виде полипептида. В одном варианте осуществления экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит первую хромосомную или внехромосомную экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая модулирует конформацию или экспрессию второй последовательности нуклеиновой кислоты, где вторая аминокислотная последовательность может быть экзогенной или эндогенной. Например, сконструированная клетка может содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, которая контролирует экспрессию эндогенной последовательности. В одном варианте осуществления сконструированная клетка содержит полипептид, присутствующий на уровне или при распределении, которые отличаются от уровня, обнаруженного в аналогичной клетке, которая не была подвергнута конструированию. В одном варианте осуществления сконструированная клетка предусматривает клетку RPE, сконструированную для обеспечения РНК или полипептида. Например, сконструированная клетка может содержать экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, предусматривающую хромосомную или внехромосомную экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, которая экспрессируется в виде РНК, например, mRNA или регуляторной РНК. В одном варианте осуществления сконструированная клетка (например, клетка RPE) содержит экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая предусматривает хромосомную или внехромосомную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, которая кодирует полипептид или которая экспрессируется в виде полипептида. В одном варианте осуществления сконструированная клетка (например, клетка RPE) содержит экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая модулирует конформацию или экспрессию эндогенной последовательности.

Используемая в данном документе "экзогенная нуклеиновая кислота" представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в норме не встречается в клетке субъекта.

Используемый в данном документе "экзогенный полипептид" представляет собой полипептид, который в норме не встречается в клетке субъекта.

Используемые в данном документе "белок фактора VII" или "белок FVII" означают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность встречающегося в природе белка фактора VII или его варианта, который обладает биологической активностью FVII, например, содействует свертыванию крови, согласно определению посредством анализа, общепризнанного в данной области техники, если не указано иное. Встречающийся в природе FVII существует в виде одноцепочечного зимогена, зимогеноподобного двухцепочечного полипептида и полностью активированной двухцепочечной формы (FVIIa). В некоторых вариантах осуществления ссылка на FVII включает его одноцепочечные и двухцепочечные формы, в том числе зимогеноподобную и FVIIa. Белки FVII, продуцирование которых может обеспечиваться частицей, описанной в данном документе (например, двухкомпартментной гидрогелевой капсулой, содержащей сконструированные клетки RPE), включают белки приматов (например, человека), свиньи, собаки и мыши дикого типа, а также варианты таких белков дикого типа, в том числе фрагменты, мутанты, варианты с одной или несколькими аминокислотными заменами и/или делециями. В некоторых вариантах осуществления вариантный белок FVII может быть активирован в полностью активированную двухцепочечную форму (фактор VIIa), которая характеризуется по меньшей мере 50%, 75%, 90% или более высоким уровнем (в том числе >100%) активности фактора VIIa дикого типа. Известны варианты FVII и FVIIa, например, марзептаког-альфа (активированный) (MarzAA) и варианты, описанные в европейском патенте № 1373493, патенте США № 7771996, патенте США № 9476037 и опубликованной заявке на патент США № US20080058255.

Биологическую активность FVII можно оценивать количественно посредством анализа, общепризнанного в данной области техники, если не указано иное. Например, биологическую активность FVII в образце биологической жидкости, например, плазмы крови, можно оценивать количественно за счет (i) измерения количества фактора Xa, продуцируемого в системе, содержащей TF, встроенный в липидную мембрану, и фактор X (Persson et al. J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) измерения гидролиза фактора Х в водной системе; (iii) измерения его физического связывания с тканевым фактором (TF) с применением прибора, основанного на поверхностном плазмонном резонансе (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); или (iv) измерения гидролиза синтетического субстрата; и/или (v) измерения образования тромбина в TF-независимой системе in vitro. В одном варианте осуществления активность FVII оценивают с помощью коммерчески доступного хромогенного анализа (BIOPHEN FVII, HYPHEN BioMed, Невиль-сюр-Уаз, Франция), в котором биологический образец, содержащий FVII, смешивают с тромбопластином кальция, фактором X и SXa-11 (хромогенным субстратом, специфичным для фактора Ха).

Используемые в данном документе "белок фактора VIII" или "белок FVIII" означают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность встречающегося в природе полипептида фактора VIII или его варианта, который обладает биологической активностью FVIII, например, коагуляционной активностью, согласно определению посредством анализа, общепризнанного в данной области техники, если не указано иное. Белки FVIII, которые могут экспрессироваться частицей, описанной в данном документе, например, двухкомпартментной гидрогелевой капсулой, содержащей сконструированные клетки RPE, включают белки приматов (например, человека), свиньи, собаки и мыши дикого типа, а также варианты таких белков дикого типа, в том числе фрагменты, мутанты, варианты с одной или несколькими аминокислотными заменами и/или делециями, варианты с делецией B-домена (BDD), одноцепочечные варианты и продукты слияния любого из вышеупомянутых белков дикого типа или вариантов с полипептидом, увеличивающим время полужизни. В одном варианте осуществления клетки сконструированы с обеспечением кодирования полипептида предшественника фактора VIII (например, содержащего сигнальную последовательность) с полной или частичной делецией B-домена. В одном варианте осуществления клетки сконструированы с обеспечением кодирования одноцепочечного полипептида фактора VIII. Вариантный белок FVIII предпочтительно характеризуется по меньшей мере 50%, 75%, 90% или более высоким уровнем (в том числе >100%) коагуляционной активности соответствующего фактора VIII дикого типа. Анализы для измерения коагуляционной активности белков FVIII включают одностадийный или двухстадийный анализ коагуляции (Rizza et al., 1982, Coagulation assay of FVIII:C and FIXa в Bloom ed. The Hemophelias. NY Churchill Livingston 1992) или анализ FVIII:C с применением хромогенного субстрата (Rosen, S. 1984. Scand J Haematol 33:139-145, suppl.)

Известен целый ряд вариантов FVIII-BDD, и они включают, например, варианты с полными или частичными делециями B-домена, раскрытые в любом из следующих патентов США №№: 4868112 (например, от столбца 2 строки 2 до столбца 19 строки 21 и таблица 2); 5112950 (например, столбец 2, строки 55-68, ФИГ. 2 и пример 1); 5171844 (например, от столбца 4 строки 1 22 до столбца 5 строки 36); 5543502 (например, столбец 2, строки 17-46); 5595886; 5610278; 5789203 (например, столбец 2, строки 26-51 и примеры 5-8); 5972885 (например, от столбца 1 строки 25 до столбца 2 строки 40); 6048720 (например, столбец 6, строки 1-22 и пример 1); 6060447; 6228620; 6316226 (например, от столбца 4 строки 4 до столбца 5 строки 28 и примеры 1-5); 6346513; 6458563 (например, столбец 4, строки 25-53) и 7041635 (например, от столбца 2 строки 1 до столбца 3 строки 19, от столбца 3 строки 40 до столбца 4 строки 67, от столбца 7 строки 43 до столбца 8 строки 26 и от столбца 11 строки 5 до столбца 13 строки 39).

В некоторых вариантах осуществления белок FVIII-BDD, продуцирование которого обеспечивается частицей, описанной в данном документе (например, экспрессируемый сконструированными клетками, содержащимися в частице), имеет одну или несколько из следующих делеций аминокислот в B-домене: (i) большая часть B-домена, за исключением аминоконцевых последовательностей B-домена, необходимых для внутриклеточного процессинга первичного продукта трансляции в две полипептидные цепи (WO 91/09122); (ii) делеция аминокислот 747-1638 (Hoeben R. C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)); аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 (Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4):301-6 (1988); аминокислот 982-1562 или 760-1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:5939-5942 (1986)); аминокислот 797-1562 (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)); 741-1646 (Kaufman, WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver et al., DNA 6:553-564 (1987)); аминокислот 741-1648 (Pasek, WO 88/00831)), аминокислот 816-1598 или 741-1689 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597); делеция, которая содержит один или несколько остатков из последовательности распознавания фуринпротеазы, например, LKRHQR, при аминокислотах 1643-1648, в том числе любая из специфических делеций, перечисленных в патенте США № 9956269 от столбца 10 строки 65 до столбца 11 строки 36.

В других вариантах осуществления белок FVIII-BDD сохраняет любую из следующих аминокислот или аминокислотных последовательностей B-домена: (i) один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования в B-домене, например, остатки 757, 784, 828, 900, 963 или необязательно 943, первые 226 аминокислот или первые 163 аминокислоты (Miao, H. Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A., et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), и Pipe, S. W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011).

В некоторых вариантах осуществления белок FVIII-BDD представляет собой одноцепочечный вариант, полученный путем замены одной или нескольких аминокислот в последовательности распознавания фуринпротеазы (LKRHQR при аминокислотах 1643-1648), что предотвращает протеолитическое расщепление в данном сайте, включая любую из замен в положениях R1645 и/или R1648, описанных в патентах США №№ 10023628, 9394353 и 9670267.

В некоторых вариантах осуществления любой из вышеуказанных белков FVIII-BDD может дополнительно предусматривать один или несколько из следующих вариантов: замену F309S для улучшения экспрессии белка FVIII-BDD (Miao, H. Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004); продукты слияния с альбумином (WO 2011/020866) и продукты слияния с Fc-областью (WO 04/101740).

Все аминокислотные положения FVIII-BDD, упомянутые в данном документе, относятся к положениям в полноразмерном FVIII человека, если не указано иное.

Используемые в данном документе "белок фактора IX" или "белок FIX" означают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность встречающегося в природе белка фактора IX или его варианта, который обладает биологической активностью FIX, например, коагуляционной активностью, согласно определению посредством анализа, общепризнанного в данной области техники, если не указано иное. FIX продуцируется в виде неактивного зимогена, который превращается в активную форму за счет разрезания под действием фактора XIa пептида активации с образованием тяжелой цепи и легкой цепи, удерживаемых вместе одной или несколькими дисульфидными связями. Белки FIX, продуцирование которых может обеспечиваться частицей, описанной в данном документе (например, экспрессия сконструированными клетками RPE, содержащимися в частице), включают белки приматов (например, человека), свиньи, собаки и мыши дикого типа, а также варианты таких белков дикого типа, в том числе фрагменты, мутанты, варианты с одной или несколькими аминокислотными заменами и/или делециями, и продукты слияния любого из вышеупомянутых белков дикого типа или вариантов белков с полипептидом, увеличивающим время полужизни. В одном варианте осуществления клетки сконструированы с обеспечением кодирования полноразмерного полипептида фактора IX человека дикого типа (например, с сигнальной последовательностью) или его функционального варианта. Вариантный белок FIX предпочтительно характеризуется по меньшей мере 50%, 75%, 90% или более высоким уровнем (в том числе >100%) коагуляционной активности фактора FIX дикого типа. Анализы для измерения коагуляционной активности белков FIX включают анализ фактора IX Biophen (Hyphen BioMed) и одностадийный анализ свертывания (активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT), например, как описано в ЕР 2032607 В2, анализ времени образования тромбина (TGA) и ротационную тромбоэластометрию, например, как описано в WO 2012/006624.

Известен целый ряд функциональных вариантов FIX, и они могут экспрессироваться сконструированными клетками, инкапсулированными в частицу, описанную в данном документе, в том числе любой из функциональных вариантов FIX, описанных в следующих международных патентных публикациях: WO 02/040544 A3 на странице 4 строках 9-30 и на странице 15 строках 6-31; WO 03/020764 A2 в таблицах 2 и 3 на страницах 14-24 и на странице 12 строках 1-27; WO 2007/149406 A2 от страницы 4 строки 1 до страницы 19 строки 11; WO 2007/149406 A2 от страницы 19 строки 12 до страницы 20 строки 9; WO 08/118507 A2 от страницы 5 строки 14 до страницы 6 строки 5; WO 09/051717 А2 от страницы 9 строки 11 до страницы 20 строки 2; WO 09/137254 А2 от страницы 2 абзаца [006] до страницы 5 абзаца [011] и от страницы 16 абзаца [044] до страницы 24 абзаца [057]; WO 09/130198 А2 от страницы 4 строки 26 до страницы 12 строки 6; WO 09/140015 А2 от страницы 11 абзаца [0043] до страницы 13 абзаца [0053]; WO 2012/006624; WO 2015/086406.

В определенных вариантах осуществления полипептид FIX содержит последовательность дикого типа или вариантную последовательность, слитую с гетерологичным полипептидным или отличным от полипептидного фрагментом, увеличивающим время полужизни белка FIX. Иллюстративные фрагменты, увеличивающие время полужизни, включают Fc-область, альбумин, последовательность PAS, трансферрин, CTP (С-концевой пептид (CTP) из 28 аминокислот хорионического гонадотропина человека (hCG) с его 4 O-гликанами), полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтилкрахмал (HES), альбумин-связывающий полипептид, альбумин-связывающие малые молекулы или любую их комбинацию. Иллюстративным полипептидом FIX является белок rFIXFc, описанный в WO 2012/006624, который представляет собой одноцепочечный FIXFc (FIXF c-sc) и одноцепочечную Fc-область (Fc-sc), связанные вместе посредством двух дисульфидных связей в шарнирном участке Fc-области.

Варианты FIX также включают варианты приобретения и потери функции. Примером варианта с приобретением функции является вариант "Padua" FIX человека, который содержит L (лейцин) в положении 338 зрелого белка вместо R (аргинина) (что соответствует аминокислотному положению 384 в SEQ ID NO:2) и характеризуется большей каталитической и коагуляционной активностью по сравнению с FIX человека дикого типа (Chang et al., J. Biol. Chem., 273:12089-94 (1998)). Примером варианта с потерей функции является замена лизина на аланин в положении пятой аминокислоты от начала зрелого белка, что дает белок со сниженным связыванием с коллагеном IV (например, потере функции).

Используемые в данном документе "белок интерлейкина 2" или "белок IL-2" означают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность встречающегося в природе белка IL-2 или его варианта, который обладает биологической активностью IL-2, например, активирует передачу сигналов от рецептора IL-2 в клетках Treg, согласно определению посредством анализа, общепризнанного в данной области техники, если не указано иное. Белки IL-2, продуцирование которых может обеспечиваться частицей, описанной в данном документе, например, частицей, содержащей сконструированные клетки RPE, включают белки приматов (например, человека), свиньи, собаки и мыши дикого типа, а также варианты таких белков дикого типа. Вариантный белок IL-2 предпочтительно характеризуется по меньшей мере 50%, 75%, 90% или более высоким уровнем (в том числе >100%) биологической активности соответствующего IL-2 дикого типа. Анализы биологической активности белков IL-2 описаны в патенте США № 10035836 и включают, например, измерение уровней фосфорилированного белка STAT5 в клетках Treg по сравнению с CD4+CD25-/низкий уровень T-клетками или NK-клетками. Вариантные белки IL-2, продуцирование которых может обеспечиваться частицей по настоящему изобретению (например, частицей, содержащей сконструированные клетки RPE), включают белки с одной или несколькими из следующих аминокислотных замен: N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L, Q126F, а также C125S или C125A.

"Островковая клетка", как используется в данном документе, означает клетку, которая предусматривает любую встречающуюся в природе или любую искусственно созданную или модифицированную клетку, которая предназначена для того, чтобы повторять, имитировать, или иным образом проявлять, частично или полностью, функции, частично или полностью, клеток панкреатических островков Лангерганса. Термин "островковые клетки" включает чувствительные к глюкозе продуцирующие инсулин клетки, полученные из стволовых клеток, например, из линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Термин "маннит", используемый в данном документе, относится к D-манниту, если явно не указано иное.

Термины "мезенхимальная стволовая функциональная клетка" или "MSFC", при их использовании в данном документе, относятся к клетке, полученной из мезодермальной линии или имеющей по меньшей мере одну характеристику, специфическую для клетки мезодермальной линии, и при этом MSFC i) не находится на конечной стадии дифференцировки и ii) может окончательно дифференцироваться в один или несколько типов клеток. MSFC не включает клетку эндодермального происхождения, например клетку кишечника, или эктодермального происхождения, например клетку, полученную из клетки кожи, ЦНС или нейрональной клетки. В одном варианте осуществления MSFC является мультипотентной. В одном варианте осуществления MSFC не является тотипотентной. В одном варианте осуществления MSFC характеризуется одной или несколькими из следующих характеристик:

а) она предусматривает мезенхимальную стволовую клетку (MSC) или полученную из нее клетку, в том числе клетку, полученную из первичной клеточной культуры MSC, клетку, выделенную непосредственно (без длительного культивирования, например, менее 5 или 10 пассажей или циклов деления клеток с момента выделения) из встречающихся в природе MSC, например, от человека или другого млекопитающего, клетку, полученную из трансформированной, плюрипотентной, иммортализованной или долговременной (например, более 5 или 10 пассажей или циклов деления клеток) культуры MSC. В одном варианте осуществления MSFC получена из относящегося к организму человека источника, например крови (например, периферической крови), костного мозга (например, гребня подвздошной кости, бедренных костей, большеберцовой кости, позвоночника, ребра или колена), синовиальной ткани, жировой ткани, кожи, ткани плода, пуповины или плаценты;

b) она включает клетку, которая была получена из менее дифференцированной клетки, например, клетки, сконструированной, запрограммированной или перепрограммированной (например, in vitro) в MSC, или клетки, которая, за исключением любой полученной путем генной инженерии, по сути аналогична одной или нескольким из встречающихся в природе MSC, или клетки из первичной или долговременной культуры MSC, или клетки, описанной в а) выше. Примеры менее дифференцированных клеток, из которых может быть получена MSFC, включают клетки IPS, эмбриональные стволовые клетки или другие тотипотентные или плюрипотентные клетки; см., например, Chen, Y.S. et al (2012) Stem Cells Transl Med 1(83-95); Frobel, J et al (2014) Stem Cell Reports 3(3):414-422; Zou, L et al (2013) Sci Rep 3:2243;

c) она является мультипотентной, например, как измерено с помощью любого анализа, способного предоставить информацию относительно мультипотентности клеток, например, микроскопии;

d) она имеет характерную мононуклеарную яйцевидную, звездчатую или веретеновидную форму с округлым или овальным ядром. Овальное удлиненное ядро может иметь выраженные ядрышки и смесь гетерохроматина и эухроматина. MSFC (например, MSC) может иметь небольшое количество цитоплазмы, но много тонких отростков, которые, как представляется, отходят от ядра;

e) она способна к клеточному делению, например, как измерено с помощью любого анализа, способного предоставить информацию относительно клеточного деления, например, микроскопии. В одном варианте осуществления MSFC способна к клеточному делению в культуре (например, перед инкапсулированием или включением в частицу, описанную в данном документе). В одном варианте осуществления она способна к клеточному делению после инкапсуляции, например инкапсуляции, описанной в данном документе, или включения в частицу (например, 2-компартментную капсулу, описанную в данном документе). В одном варианте осуществления она неспособна к клеточному делению после достижения конфлюэнтности;

f) она способна дифференцироваться в клетки мезенхимальной линии, например, в остеобласт, хрондобласт, адипоцит или фибробласт;

g) она экспрессирует маркер мезенхимальных клеток, например один, два, три, четыре, пять или все из CD105, CD106, CD73, CD90, Stro-1, CD49a, CD29, CD44, CD146, CD166, TNAP+, THY-1+, Stro-2, Stro-4 и щелочной фосфатазы;

h) она не экспрессирует значительные уровни одного, двух, трех или любого из CD34, CD31, VE-кадгерина, CD45, HLA-DR, CD11b и гликофорина или антигена дифференцировки лейкоцитов, например, CD14, CD33, CD3 и CD19;

i) она экспрессирует один, два или все из CD75, CD90 и CD105 и не экспрессирует один, два или любой из CD45, CD34 и CD14;

j) она оказывает противовоспалительное или подавляющее иммунный ответ действие, например, как измерено с помощью любого способа, способного предоставить информацию относительно воспаления, например, подавления Т-клеточной пролиферации in vivo;

k) она характеризуется способностью к адгезии, например, адгезии к пластмассе, например, как определено, например, путем визуальной оцеки; или

l) может осуществлять рост в трех измерениях, например, как определено, например, путем визуального осмотра.

Используемые в данном документе термины "паратиреоидный гормон" или "PTH" означают полипептид или пептид, который содержит аминокислотную последовательность полипептида или пептида встречающегося в природе паратиреоидного гормона или его варианта, который обладает биологической активностью PTH, например, согласно определению посредством анализа, общепризнанного в данной области техники. Полипептиды и пептиды PTH, которые могут экспрессироваться инкапсулированными клетками, описанными в данном документе, включают белки дикого типа приматов (например, человека), свиньи, собаки и мыши, а также варианты таких белков дикого типа. Такие полипептиды и пептиды PTH могут по сути состоять из происходящей от человека последовательности дикого типа в случае полипептида пре-про-PTH (115 аминокислот), полипептида про-PTH (90 аминокислот), зрелого пептида из 84 аминокислот (PTH (1-84)) и их биологически активных вариантов, таких как укороченный вариантный пептид PTH (1-34). Варианты пептидов PTH с одной или несколькими аминокислотными заменами в происходящей от человека последовательности дикого типа были описаны, например, в патентах США №№ 7410948 и 8563513 и в опубликованной заявке на патент США US20130217630. Вариант PTH предпочтительно характеризуется по меньшей мере 50%, 75%, 90% или более высоким уровнем (в том числе >100%) биологической активности соответствующего PTH дикого типа. Анализ для обнаружения определенных вариантов PTH посредством тандемной масс-спектрометрии описан в патенте США № 8383417. Анализом биологической активности вариантов пептида PTH является анализ стимуляции аденилатциклазы, определяемой посредством измерения уровней cAMP, описанный в патенте США № 7410948.

Термин "полоксамер", используемый в данном документе, относится к стандартному общему термину для класса неионных трехблочных линейных сополимеров, состоящих из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилен(поли(пропиленоксида)), фланкированной двумя фрагментами полиоксиэтилен(поли(этиленоксида)).

Термин "полоксамер 188" или "Р 188", используемый в данном документе, относится к полоксамеру с примерной молекулярной массой 1800 г/моль для полиоксипропиленового ядра и содержанием оксиэтилена, составляющим приблизительно 80% весовых процентов, например, от 79,0 до 83,7%. В одном варианте осуществления полоксамер 188 имеет среднюю молекулярную массу 8350 г/моль. В одном варианте осуществления полоксамер 188 имеет среднюю молекулярную массу от 7680 г/моль до 9510 г/моль, например, как определено с помощью эксклюзионной хроматографии, и содержание оксиэтилена 81,8 ± 1,9% весовых процента. В одном варианте осуществления каждая цепь полиоксиэтилена в полоксамере 188 содержит 75-85 (например, 80) мономеров этиленоксида, и полиоксипропиленовое ядро содержит 25-30 (например, 27) мономеров пропиленоксида. В одном варианте осуществления полоксамер 188, применяемый в способе, описанном в данном документе, по сути соответствует спецификациям, изложенным в фармакопейной статье на полоксамер, опубликованной в Фармакопее США и Национальном формуляре (USP-NF) или Европейской фармакопее (Ph. Eur.), которая является официальным на момент осуществления способа.

Термин "полоксамер 407" или "Р 407", используемый в данном документе, означает полоксамер с примерной молекулярной массой 4000 г/моль для полипропиленового ядра и содержанием оксиэтилена, составляющим приблизительно 70% по весу. В одном варианте осуществления полоксамер 407 имеет среднюю молекулярную массу от 9840 г/моль до 14600 г/моль и содержание оксиэтилена 73,2 ± 1,7% по весу. В одном варианте осуществления каждая цепь полиоксиэтилена в полоксамере 407 содержит 95-105 (например, 101) мономеров этиленоксида, и полиоксипропиленовое ядро содержит 54-60 (например, 56) мономеров пропиленоксида.

Термин "полипептид", используемый в данном документе, относится к полимеру, содержащему аминокислотные остатки, связанные посредством пептидных связей, и имеющему по меньшей мере два, а в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10, 50, 75, 100, 150 или 200 аминокислотных остатков.

Используемые в данном документе термины "предупреждение", "предупреждать" и "осуществление предупреждения" относятся к лечению, которое предусматривает введение или применение средства терапии, например, введение композиции на основе частиц, инкапсулирующих клетки (например, описанной в данном документе), перед манифестацией заболевания, нарушения или состояния, чтобы предупредить физическое проявление указанного заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления в случае "предупреждения", "предупреждать" и "осуществления предупреждения" требуется, чтобы признаки или симптомы заболевания, нарушения или состояния еще не развились или еще не наблюдались. В некоторых вариантах осуществления лечение предусматривает предупреждение, а в других вариантах не предусматривает.

"Средство заместительной терапии" или "заместительный белок" представляют собой терапевтический белок или его функциональный фрагмент, который заменяет или усиливает белок, который снижен, присутствует в недостаточном количестве, изменен (например, мутирован) или отсутствует у субъекта, у которого имеется заболевание или состояние, связанные со сниженным, измененным или отсутствующим белком. Примеры представляют собой определенные факторы свертывания крови в случае определенных нарушений свертывания крови или определенные лизосомальные ферменты в случае определенных лизосомных болезней накопления. В одном варианте осуществления средство заместительной терапии или заместительный белок обеспечивает функцию эндогенного белка. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность средства заместительной терапии или заместительного белка является такой же, как у встречающегося в природе варианта замещаемого белка, например аллеля дикого типа или аллеля, не ассоциированного с нарушением. В одном варианте осуществления либо аминокислотная последовательность средства заместительной терапии, либо заместительный белок отличаются от встречающегося в природе варианта, например аллеля дикого типа или аллеля, не ассоциированного с нарушением, например аллеля, содержащегося у субъекта, не более чем на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 или 20% аминокислотных остатков.

Используемая в данном документе "клетка RPE" относится к клетке, имеющей одну или несколько из следующих характеристик: а) она предусматривает клетку пигментного эпителия сетчатки (RPE) (например, культивируемую с использованием клеточной линии ARPE-19 (ATCC^® CRL-2302™)) или клетку, полученную из нее, в том числе клетку, полученную из первичной клеточной культуры клеток RPE, клетку выделенную непосредственно (без длительного культивирования, например, менее 5 или 10 пассажей или циклов деления клеток с момента выделения) из встречающихся в природе клеток RPE, например, от человека или другого млекопитающего, клетку, полученную из трансформированной, иммортализованной или долгосрочной (например, более 5 или 10 пассажей или циклов деления клеток) культуры клеток RPE; b) клетка, которая была получена из менее дифференцированной клетки, например, клетки, разработанной, запрограммированной или перепрограммированной (например, in vitro) в клетку RPE, или клетка, которая, за исключением любого генноинженерного вмешательства, по сути аналогична одной или нескольким встречающимся в природе клеткам RPE, или клетка из первичной или долгосрочной культуры клеток RPE (например, клетка может быть получена из клетки IPS); или c) клетка, которая характеризуется одним или несколькими из следующих свойств: i) она экспрессирует один или несколько биомаркеров CRALBP, RPE-65, RLBP, BEST1 или αB-кристаллин; ii) она не экспрессирует один или несколько биомаркеров CRALBP, RPE-65, RLBP, BEST1 или αB-кристаллин; iii) в норме она обнаруживается в сетчатке и образует монослой над хориоидальными кровеносными сосудами в мембране Бруха; iv) она отвечает за эпителиальный транспорт, поглощение света, секрецию и иммунную модуляцию в сетчатке; или v) она была создана синтетически или получена в результате модифицирования встречающейся в природе клетки таким образом, чтобы иметь одинаковое или по сути одинаковое генетическое содержание и необязательно одинаковое или по сути одинаковое эпигенетическое содержание, что и иммортализированная линия клеток RPE (например, линии клеток ARPE-19 (ATCC^® CRL-2302™)). В одном варианте осуществления клетка RPE, описанная в данном документе, является сконструированной, например, для того, чтобы иметь новое свойство, например, клетка сконструирована для того, чтобы экспрессировать терапевтический белок. В других вариантах осуществления клетка RPE не является сконструированной.

"Идентичность последовательности" или "процентная идентичность", когда используются в данном документе при упоминании двух нуклеотидных последовательностей или двух аминокислотных последовательностей, означают, что две последовательности являются одинаковыми в пределах указанного участка или имеют одинаковые нуклеотиды или аминокислоты в указанном проценте нуклеотидных или аминокислотных положений в пределах указанного участка, когда две последовательности сравнивают и выравнивают для максимального соответствия по ширине окна сравнения или обозначенного участка. Идентичность последовательности может быть определена с применением стандартных методик, известных в данной области техники, в том числе без ограничения любого из алгоритмов, описанных в патентной публикации № US 2017/02334455. В одном варианте осуществления указанный процент идентичных нуклеотидных или аминокислотных положений составляет по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более.

Термин "сферический", используемый в данном документе, относится к частице, имеющей изогнутую поверхность, которая образует сферу (например, полностью круглый шар) или сферическую форму. Сферы и сферические объекты могут быть математически определены с помощью вращения окружностей, эллипсов или их комбинации вокруг каждой из трех перпендикулярных осей a, b и c. Для сферы три оси a, b и c имеют одинаковую длину. Как правило, сферическая форма представляет собой эллипсоид (применительно к его усредненной поверхности) с полуглавными осями a, b и c, длины которых находятся в пределах 10%, 5% или 2,5% друг от друга. Диаметр сферы или сферической формы представляет собой средний диаметр, такой как среднее значение полуглавных осей.

Используемый в данном документе "субъект" относится к человеку или животному, отличному от человека. В одном варианте осуществления субъект представляет собой человека (т. е. мужчину или женщину, например, любой возрастной группы, субъекта детского возраста (например, младенца, ребенка, подростка) или взрослого субъекта (например, взрослого молодого возраста, взрослого среднего возраста или взрослого пожилого возраста)). В одном варианте осуществления субъект представляет собой животное, отличное от человека, например, млекопитающее (например, примата (например, яванского макака или макака-резуса)). В одном варианте осуществления субъект представляет собой коммерчески значимое млекопитающее (например, крупный рогатый скот, свинья, лошадь, овца, коза, кошка или собака) или птицу (например, коммерчески значимая птица, такая как курица, утка, гусь или индейка). В определенных вариантах осуществления животное является млекопитающим. Животное может быть самцом или самкой и находиться на любой стадии развития. Животное, отличное от человека, может представлять собой трансгенное животное.

Термин "общий объем", используемый в данном документе, относится к объему в пределах одного компартмента частицы, который включает пространство, занимаемое другим компартментом. Например, общий объем второго (например, внешнего) компартмента двухкомпартментной частицы относится к объему внутри второго компартмента, который включает пространство, занимаемое первым компартментом.

Используемые в данном документе "лечение", "лечить" и "осуществление лечения" относятся к одному или нескольким из уменьшения, обращения, облегчения, отсрочки манифестации или подавления прогрессирования одного или нескольких симптомов, проявлений или первопричины заболевания, нарушения или состояния. В одном варианте осуществления лечение предусматривает уменьшение, обращение, облегчение, отсрочку манифестации или подавление прогрессирования симптома заболевания, нарушения или состояния. В одном варианте осуществления лечение предусматривает уменьшение, обращение, облегчение, отсрочку манифестации или подавление прогрессирования проявления заболевания, нарушения или состояния. В одном варианте осуществления лечение предусматривает уменьшение, обращение, облегчение, уменьшение или отсрочку манифестации первопричины заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления в случае "лечения", "лечить" и "осуществления лечения" требуется, чтобы признаки или симптомы заболевания, нарушения или состояния развились или наблюдались. В других вариантах осуществления лечение можно вводить при отсутствии признаков или симптомов заболевания или состояния, например, при профилактическом лечении. Например, лечение можно вводить восприимчивому индивидууму до манифестации симптомов (например, с учетом симптомов в анамнезе и/или с учетом генетических или других факторов восприимчивости). Лечение также может быть продолжено после устранения симптомов, например, для отсрочки или предупреждения рецидива. В некоторых вариантах осуществления лечение предусматривает предупреждение, а в других вариантах не предусматривает.

Используемые в данном документе "белок фактора фон Виллебранда" или "белок VWF" означают полипептид, который содержит аминокислотную последовательность встречающегося в природе полипептида фактора VWF или его варианта, который обладает биологической активностью VWF, например, связывающей активностью VWF, согласно определению посредством анализа, общепризнанного в данной области техники, если не указано иное. Белки VWF, продуцирование которых может обеспечиваться частицей, описанной в данном документе (например, экспрессия сконструированными клетками, содержащимися в частице), включают белки приматов (например, человека), свиньи, собаки и мыши дикого типа, а также варианты таких белков дикого типа. Инкапсулированные клетки можно конструировать таким образом, чтобы они кодировали любой из следующих полипептидов VWF: предшественник VWF из 2813 аминокислот, VWF без сигнального пептида из 22 аминокислот и необязательно препропептид из 741 аминокислоты, зрелый белок VWF из 2050 аминокислот и его усеченные варианты, такие как фрагмент VWF, достаточный для стабилизации уровней эндогенного FVIII у мышей с дефицитом VWF, например усеченный вариант, содержащий D´D3-участок (аминокислоты 764-1247) или D1D2D´D3-участок; и варианты VWF с одной или несколькими аминокислотными заменами, например, в D´-участке, описанные в патенте США № 9458223. Вариантный белок VWF предпочтительно характеризуется по меньшей мере 50%, 75%, 90% или более высоким уровнем (в том числе >100%) биологической активности соответствующего белка VWF дикого типа. Анализы, общепризнанные в данной области техники для определения биологической активности VWF, включают определение ристоцетин-кофакторной активности (Federici A B et al. 2004. Haematologica 89:77-85), связывания VWF с GP Ibα из гликопротеинового комплекса тромбоцитов Ib-V-IX (Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310), а также связывания коллагена (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471).

В некоторых вариантах осуществления белок VWF, продуцирование которого обеспечивается частицей по настоящему изобретению, содержит встречающуюся в природе или вариантную аминокислотную последовательность VWF, слитую с гетерологичным полипептидным или неполипептидным фрагментом, увеличивающим время полужизни белка VWF. Иллюстративные фрагменты, увеличивающие время полужизни, включают Fc-область, альбумин, последовательность PAS, трансферрин, CTP (С-концевой пептид (CTP) из 28 аминокислот хорионического гонадотропина человека (hCG) с его 4 O-гликанами), полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтилкрахмал (HES), альбумин-связывающий полипептид, альбумин-связывающие малые молекулы или любую их комбинацию.

Определения выбранных химических терминов

Определения для конкретных функциональных групп и химических терминов описаны более подробно ниже. Химические элементы идентифицированы в соответствии с периодической таблицей элементов, версия CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75^th Ed., форзац, и конкретные функциональные группы в целом определены, как описано в указанном документе. Кроме того, общие принципы органической химии, а также конкретные функциональные группы и реакционная способность, описаны в Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5^th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; и Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3^rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.

Сокращения, используемые в данном документе, имеют свое традиционное значение в рамках области химии и биологии. Химические структуры и формулы, изложенные в данном документе, составлены в соответствии со стандартными правилами химической валентности, известными в области химии.

Когда перечислен диапазон значений, подразумевается, что он охватывает каждое значение и поддиапазон в пределах диапазона. Например, подразумевается, что "C₁-C₆алкил" охватывает C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₁-C₆, C₁-C₅, C₁-C₄, C₁-C₃, C₁-C₂, C₂-C₆, C₂-C₅, C₂-C₄, C₂-C₃, C₃-C₆, C₃-C₅, C₃-C₄, C₄-C₆, C₄-C₅ и C₅-C₆алкил.

Используемый в данном документе "алкил" относится к радикалу насыщенной углеводородной группы с прямой или разветвленной цепью, имеющей от 1 до 24 атомов углерода ("C₁-C₂₄алкил"). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа имеет от 1 до 12 атомов углерода ("C₁-C₁₂алкил"), от 1 до 10 атомов углерода ("C₁-C₁₂алкил"), от 1 до 8 атомов углерода ("C₁-C₈алкил"), от 1 до 6 атомов углерода ("C₁-C₆алкил"), от 1 до 5 атомов углерода ("C₁-C₅алкил"), от 1 до 4 атомов углерода ("C₁-C₄алкил"), от 1 до 3 атомов углерода ("C₁-C₃алкил"), от 1 до 2 атомов углерода ("C₁-C₂алкил") или 1 атом углерода ("C₁алкил"). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа имеет от 2 до 6 атомов углерода ("C₂-C₆алкил"). Примеры C₁-C₆алкильных групп включают метил (C₁), этил (C₂), н-пропил (C₃), изопропил (C₃), н-бутил (C₄), трет-бутил (C₄), втор-бутил (C₄), изобутил (C₄), н-пентил (C₅), 3-пентанил (C₅), амил (C₅), неопентил (C₅), 3-метил-2-бутанил (C₅), третичный амил (C₅) и н-гексил (С₆). Дополнительные примеры алкильных групп включают н-гептил (C₇), н-октил (C₈) и т. п. Каждая отдельная алкильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный алкил") или замещенной ("замещенный алкил") одним или несколькими заместителями; например, 1-5 заместителями, 1-3 заместителями или 1 заместителем.

Используемый в данном документе "алкенил" относится к радикалу углеводородной группы с прямой или разветвленной цепью, имеющей от 2 до 24 атомов углерода, одну или несколько двойных углерод-углеродных связей и не имеющей тройных связей ("C₂-C₂₄алкенил"). В некоторых вариантах осуществления алкенильная группа имеет от 2 до 12 атомов углерода ("C₂-C₁₂алкенил"), от 2 до 10 атомов углерода ("C₂-C₁₀алкенил"), от 2 до 8 атомов углерода ("C₂-C₈алкенил"), от 2 до 6 атомов углерода ("C₂-C₆алкенил"), от 2 до 5 атомов углерода ("C₂-C₅алкенил"), от 2 до 4 атомов углерода ("C₂-C₄алкенил"), от 2 до 3 атомов углерода ("C₂-C₃алкенил") или 2 атома углерода ("C₂алкенил"). Одна или несколько двойных углерод-углеродных связей могут быть внутренними (как, например, в 2-бутениле) или концевыми (как, например, в 1-бутениле). Примеры C₂-C₄алкенильных групп включают этенил (C₂), 1-пропенил (C₃), 2-пропенил (C₃), 1-бутенил (C₄), 2-бутенил (C₄), бутадиенил (C₄) и т. п. Примеры C₂-C₆алкенильных групп включают вышеупомянутые C_2-4алкенильные группы, а также пентенил (C₅), пентадиенил (C₅), гексенил (C₆) и т. п. Каждая отдельная алкенильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный алкенил") или замещенной ("замещенный алкенил") одним или несколькими заместителями; например, 1-5 заместителями, 1-3 заместителями или 1 заместителем.

Используемый в данном документе термин "алкинил" относится к радикалу углеводородной группы с прямой или разветвленной цепью, имеющей от 2 до 24 атомов углерода, одну или несколько тройных углерод-углеродных связей ("C₂-C₂₄алкинил"). В некоторых вариантах осуществления алкинильная группа имеет от 2 до 12 атомов углерода ("C₂-C₁₀алкинил"), от 2 до 10 атомов углерода ("C₂-C₁₀алкинил"), от 2 до 8 атомов углерода ("C₂-C₈алкинил"), от 2 до 6 атомов углерода ("C₂-C₆алкинил"), от 2 до 5 атомов углерода ("C₂-C₅алкинил"), от 2 до 4 атомов углерода ("C₂-C₄алкинил"), от 2 до 3 атомов углерода ("C₂-C₃алкинил") или 2 атома углерода ("C₂алкинил"). Одна или несколько тройных углерод-углеродных связей могут быть внутренними (как, например, в 2-бутиниле) или концевыми (как, например, в 1-бутиниле). Примеры C₂-C₄алкинильных групп включают этинил (C₂), 1-пропинил (C₃), 2-пропинил (C₃), 1-бутинил (C₄), 2-бутинил (C₄) и т. п. Каждая отдельная алкинильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный алкинил") или замещенной ("замещенный алкинил") одним или несколькими заместителями; например, 1-5 заместителями, 1-3 заместителями или 1 заместителем.

Используемый в данном документе термин "гетероалкил" относится к нециклической стабильной прямой или разветвленной цепи или ее комбинациям, включающим по меньшей мере один атом углерода и по меньшей мере один гетероатом, выбранный из группы, состоящей из O, N, P, Si и S, и где атомы азота и серы необязательно могут быть окисленными, а гетероатом азота необязательно может быть кватернизованным. Гетероатом(-ы) O, N, P, S и Si могут быть расположены в любом положении гетероалкильной группы. Иллюстративные гетероалкильные группы включают без ограничения: -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃, -CH=CH-N(CH₃)-CH₃, -O-CH₃ и -O-CH₂-CH₃. Не более двух или трех гетероатомов могут быть расположены последовательно, как, например, -CH₂-NH-OCH₃ и -CH₂-O-Si(CH₃)₃. В тех случаях, когда перечислен "гетероалкил", за которым следует перечисление конкретных гетероалкильных групп, таких как -CH₂O, -NR^CR^D и т. п., следует понимать, что термины гетероалкил и -CH₂O или -NR^CR^D не являются избыточными или взаимоисключающими. Напротив, конкретные гетероалкильные группы перечислены для большей ясности. Таким образом, термин "гетероалкил" не следует толковать в данном документе как исключающий конкретные гетероалкильные группы, такие как -CH₂O, -NR^CR^D и т. п. Каждая отдельная гетероалкильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный гетероалкил") или замещенной ("замещенный гетероалкил") одним или несколькими заместителями; например, 1-5 заместителями, 1-3 заместителями или 1 заместителем.

Термины "алкилен", "алкенилен", "алкинилен" или "гетероалкилен", отдельно или как часть другого заместителя, означают, если не указано иное, двухвалентный радикал, полученный из алкила, алкенила, алкинила или гетероалкила соответственно. Например, алкиленовая, алкениленовая, алкиниленовая или гетероалкиленовая группа может быть описана, как C₁-C₆-членный алкилен, C₂-C₆-членный алкенилен, C₂-C₆-членный алкинилен или C₁-C₆-членный гетероалкилен, где термин "членный" относится к отличным от водорода атомам в пределах фрагмента. В случае гетероалкиленовых групп гетероатомы могут также занимать один или оба конца цепи (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и т. п.). Более того, в случае алкиленовых и гетероалкиленовых связывающих групп направление, в котором написана формула связывающей группы, не подразумевает ориентацию связывающей группы. Например, формула -C(O)₂R'- может изображать как -C(O)₂R'-, так и -R'C(O)₂-.

Используемый в данном документе "арил" относится к радикалу моноциклической или полициклической (например, бициклической или трициклической) 4n+2 ароматической кольцевой системы (например, имеющей 6, 10 или 14 π-электронов, обобществленных в циклической структуре), имеющей 6-14 атомов углерода в кольце и нуль гетероатомов, входящих в состав ароматической кольцевой системы ("C₆-C₁₄арил"). В некоторых вариантах осуществления арильная группа имеет шесть атомов углерода в кольце ("C₆арил"; например, фенил). В некоторых вариантах осуществления арильная группа имеет десять атомов углерода в кольце ("C₁₀арил"; например, нафтил, такой как 1-нафтил и 2-нафтил). В некоторых вариантах осуществления арильная группа имеет четырнадцать атомов углерода в кольце ("C₁₄арил"; например, антрацил). Например, арильная группа может быть описана как C₆-C₁₀-членный арил, где термин "членный" относится к отличным от водорода атомам в кольце в пределах фрагмента. Арильные группы включают фенил, нафтил, инденил и тетрагидронафтил. Каждая отдельная арильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный арил") или замещенной ("замещенный арил") одним или несколькими заместителями.

Используемый в данном документе термин "гетероарил" относится к радикалу 5-10-членной моноциклической или бициклической 4n+2 ароматической кольцевой системы (например, имеющей 6 или 10 π-электронов, обобществленных в циклической структуре), имеющей атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатомов в кольце, входящих в состав ароматической кольцевой системы, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы ("5-10-членный гетероарил"). В гетероарильных группах, которые содержат один или несколько атомов азота, точкой присоединения может быть атом углерода или азота, если позволяет валентность. Гетероарилбициклические кольцевые системы могут включать один или несколько гетероатомов в одном или обоих кольцах. "Гетероарил" также включает кольцевые системы, в которых гетероарильное кольцо, как определено выше, конденсировано с одной или несколькими арильными группами, где точка присоединения находится либо на арильном, либо на гетероарильном кольце, и в таких случаях число членов кольца обозначает число членов кольца в конденсированной (арильной/гетероарильной) кольцевой системе. В бициклических гетероарильных группах, в которых одно кольцо не содержит гетероатом (например, индолил, хинолинил, карбазолил и т. п.), точка присоединения может находиться на одном из двух колец, т. е. либо на кольце, содержащем гетероатом (например, 2-индолил), либо на кольце, которое не содержит гетероатом (например, 5-индолил). Гетероарильная группа может быть описана, например, как 6-10-членный гетероарил, где термин "членный" относится к отличным от водорода атомам в кольце в пределах фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления гетероарильная группа представляет собой 5-10-членную ароматическую кольцевую систему, имеющую атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, входящих в состав ароматической кольцевой системы, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы ("5-10-членный гетероарил"). В некоторых вариантах осуществления гетероарильная группа представляет собой 5-8-членную ароматическую кольцевую систему, имеющую атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, входящих в состав ароматической кольцевой системы, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы ("5-8-членный гетероарил"). В некоторых вариантах осуществления гетероарильная группа представляет собой 5-6-членную ароматическую кольцевую систему, имеющую атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, входящих в состав ароматической кольцевой системы, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы ("5-6-членный гетероарил"). В некоторых вариантах осуществления 5-6-членный гетероарил имеет 1-3 гетероатома в кольце, выбранных из азота, кислорода и серы. В некоторых вариантах осуществления 5-6-членный гетероарил имеет 1-2 гетероатома в кольце, выбранных из азота, кислорода и серы. В некоторых вариантах осуществления 5-6-членный гетероарил имеет 1 гетероатом в кольце, выбранный из азота, кислорода и серы. Каждая отдельная гетероарильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный гетероарил") или замещенной ("замещенный гетероарил") одним или несколькими заместителями.

Иллюстративные 5-членные гетероарильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения пирролил, фуранил и тиофенил. Иллюстративные 5-членные гетероарильные группы, содержащие два гетероатома, включают без ограничения имидазолил, пиразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил и изотиазолил. Иллюстративные 5-членные гетероарильные группы, содержащие три гетероатома, включают без ограничения триазолил, оксадиазолил и тиадиазолил. Иллюстративные 5-членные гетероарильные группы, содержащие четыре гетероатома, включают без ограничения тетразолил. Иллюстративные 6-членные гетероарильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения пиридинил. Иллюстративные 6-членные гетероарильные группы, содержащие два гетероатома, включают без ограничения пиридазинил, пиримидинил и пиразинил. Иллюстративные 6-членные гетероарильные группы, содержащие три или четыре гетероатома, включают без ограничения триазинил и тетразинил соответственно. Иллюстративные 7-членные гетероарильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения азепинил, оксепинил и тиепинил. Иллюстративные 5,6-бициклические гетероарильные группы включают без ограничения индолил, изоиндолил, индазолил, бензотриазолил, бензотиофенил, изобензотиофенил, бензофуранил, бензоизофуранил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензоксадиазолил, бензтиазолил, бензизотиазолил, бензтиадиазолил, индолизинил и пуринил. Иллюстративные 6,6-бициклические гетероарильные группы включают без ограничения нафтиридинил, птеридинил, хинолинил, изохинолинил, циннолинил, хиноксалинил, фталазинил и хиназолинил. Другие иллюстративные гетероарильные группы включают гем и производные гема.

Используемые в данном документе термины "арилен" и "гетероарилен", отдельно или как часть другого заместителя, означают двухвалентный радикал, полученный из арила и гетероарила соответственно.

Используемый в данном документе "циклоалкил" относится к радикалу неароматической циклической углеводородной группы, имеющей от 3 до 10 атомов углерода в кольце ("C₃-C₁₀циклоалкил") и нуль гетероатомов в неароматической кольцевой системе. В некоторых вариантах осуществления циклоалкильная группа имеет от 3 до 8 атомов углерода в кольце ("C₃-C₈циклоалкил"), от 3 до 6 атомов углерода в кольце ("C₃-C₆циклоалкил") или от 5 до 10 атомов углерода в кольце ("C₅-C₁₀циклоалкил"). Циклоалкильная группа может быть описана, например, как C₄-C₇-членный циклоалкил, где термин "членный" относится к отличным от водорода атомам в кольце в пределах фрагмента. Иллюстративные C₃-C₆циклоалкильные группы включают без ограничения циклопропил (C₃), циклопропенил (C₃), циклобутил (C₄), циклобутенил (C₄), циклопентил (C₅), циклопентенил (C₅), циклогексил (C₆), циклогексенил (C₆), циклогексадиенил (C₆) и т. п. Иллюстративные C₃-C₈циклоалкильные группы включают без ограничения вышеупомянутые C₃-C₆циклоалкильные группы, а также циклогептил (C₇), циклогептенил (C₇), циклогептадиенил (C₇), циклогептатриенил (C₇), циклооктил (C₈), циклооктенил (C₈), кубанил (C₈), бицикло[1.1.1]пентанил (C₅), бицикло[2.2.2]октанил (C₈), бицикло[2.1.1]гексанил (C₆), бицикло[3.1.1]гептанил (C₇) и т. п. Иллюстративные C₃-C₁₀циклоалкильные группы включают без ограничения вышеупомянутые C₃-C₈циклоалкильные группы, а также циклононил (C₉), циклононенил (C₉), циклодецил (C₁₀), циклодеценил (C₁₀), октагидро-1H-инденил (C₉), декагидронафталенил (C₁₀), спиро[4.5]деканил (C₁₀) и т. п. Как проиллюстрировано в приведенных выше примерах, в определенных вариантах осуществления циклоалкильная группа является либо моноциклической ("моноциклический циклоалкил"), либо содержит конденсированную, мостиковую или спиро-кольцевую систему, такую как бициклическая система ("бициклический циклоалкил"), и может быть насыщенной или может быть частично ненасыщенной. "Циклоалкил" также включает кольцевые системы, в которых циклоалкильное кольцо, как определено выше, конденсировано с одной или несколькими арильными группами, где точка присоединения находится на циклоалкильном кольце, и в таких случаях количество атомов углерода продолжает обозначать количество атомов углерода в циклоалкильной кольцевой системе. Каждая отдельная циклоалкильная группа может быть независимо необязательно замещенной, т. е. незамещенной ("незамещенный циклоарил") или замещенной ("замещенный циклоарил") одним или несколькими заместителями.

Используемый в данном документе "гетероциклил" относится к радикалу 3-10-членной неароматической кольцевой системы, содержащей атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода, серы, бора и фосфора и кремния ("3-10-членный гетероциклил"). В гетероциклильных группах, которые содержат один или несколько атомов азота, точкой присоединения может быть атом углерода или азота, если позволяет валентность. Гетероциклильная группа может быть либо моноциклической ("моноциклический гетероциклил"), либо конденсированной, мостиковой или спиро-кольцевой системой, такой как бициклическая система ("бициклический гетероциклил"), и может быть насыщенной или может быть частично ненасыщенной. Гетероциклилбициклические кольцевые системы могут включать один или несколько гетероатомов в одном или обоих кольцах. "Гетероциклил" также включает кольцевые системы, в которых гетероциклильное кольцо, как определено выше, конденсировано с одной или несколькими циклоалкильными группами, где точка присоединения находится либо на циклоалкильном, либо на гетероциклильном кольце, или кольцевые системы, в которых гетероциклильное кольцо, как определено выше, конденсировано с одной или несколькими арильными или гетероарильными группами, где точка присоединения находится на гетероциклильном кольце, и в таких случаях число членов кольца продолжает обозначать число членов кольца в гетероциклильной кольцевой системе. Гетероциклильная группа может быть описана, например, как 3-7-членный гетероциклил, где термин "членный" относится к отличным от водорода атомам в кольце, т. е. к атомам углерода, азота, кислорода, серы, бора, фосфора и кремния в пределах фрагмента. Каждый отдельный гетероциклил может быть независимо необязательно замещенным, т. е. незамещенным ("незамещенный гетероциклил") или замещенным ("замещенный гетероциклил") одним или несколькими заместителями. В определенных вариантах осуществления гетероциклильная группа представляет собой незамещенный 3-10-членный гетероциклил. В определенных вариантах осуществления гетероциклильная группа представляет собой замещенный 3-10-членный гетероциклил.

В некоторых вариантах осуществления гетероциклильная группа представляет собой 5-10-членную неароматическую кольцевую систему, имеющую атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода, серы, бора, фосфора и кремния ("5-10-членный гетероциклил"). В некоторых вариантах осуществления гетероциклильная группа представляет собой 5-8-членную неароматическую кольцевую систему, имеющую атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы ("5-8-членный гетероциклил"). В некоторых вариантах осуществления гетероциклильная группа представляет собой 5-6-членную неароматическую кольцевую систему, имеющую атомы углерода в кольце и 1-4 гетероатома в кольце, где каждый гетероатом независимо выбран из азота, кислорода и серы ("5-6-членный гетероциклил"). В некоторых вариантах осуществления 5-6-членный гетероциклил имеет 1-3 гетероатома в кольце, выбранных из азота, кислорода и серы. В некоторых вариантах осуществления 5-6-членный гетероциклил имеет 1-2 гетероатома в кольце, выбранных из азота, кислорода и серы. В некоторых вариантах осуществления 5-6-членный гетероциклил имеет один гетероатом в кольце, выбранный из азота, кислорода и серы.

Иллюстративные 3-членные гетероциклильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения азиридинил, оксиранил, тиоренил. Иллюстративные 4-членные гетероциклильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения азетидинил, оксетанил и тиетанил. Иллюстративные 5-членные гетероциклильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиофенил, дигидротиофенил, пирролидинил, дигидропирролил и пирролил-2,5-дион. Иллюстративные 5-членные гетероциклильные группы, содержащие два гетероатома, включают без ограничения диоксоланил, оксасульфуранил, дисульфуранил и оксазолидин-2-он. Иллюстративные 5-членные гетероциклильные группы, содержащие три гетероатома, включают без ограничения триазолинил, оксадиазолинил и тиадиазолинил. Иллюстративные 6-членные гетероциклильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения пиперидинил, пиперазинил, тетрагидропиранил, дигидропиридинил и тианил. Иллюстративные 6-членные гетероциклильные группы, содержащие два гетероатома, включают без ограничения пиперазинил, морфолинил, дитианил, диоксанил. Иллюстративные 6-членные гетероциклильные группы, содержащие два гетероатома, включают без ограничения триазинанил или тиоморфолинил-1,1-диоксид. Иллюстративные 7-членные гетероциклильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения азепанил, оксепанил и тиепанил. Иллюстративные 8-членные гетероциклильные группы, содержащие один гетероатом, включают без ограничения азоканил, оксеканил и тиоканил. Иллюстративные 5-членные гетероциклильные группы, конденсированные с C₆арильным кольцом (также обозначаемые в данном документе как 5,6-бициклическое гетероциклическое кольцо), включают без ограничения индолинил, изоиндолинил, дигидробензофуранил, дигидробензотиенил, бензоксазолинонил и т. п. Иллюстративные 6-членные гетероциклильные группы, конденсированные с арильным кольцом (также обозначаемые в данном документе как 6,6-бициклическое гетероциклическое кольцо), включают без ограничения тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил и т. п.

Используемый в данном документе "амино" относится к радикалу -NR⁷⁰R⁷¹, где каждый из R⁷⁰ и R⁷¹ независимо представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₃-C₁₀циклоалкил, C₄-C₁₀гетероциклил, C₆-C₁₀арил и C₅-C₁₀гетероарил. В некоторых вариантах осуществления амино относится к NH₂.

Используемый в данном документе "циано" относится к радикалу -CN.

Используемый в данном документе "галоген" или "галогенид", независимо или как часть другого заместителя, означает, если не указано иное, атом фтора (F), хлора (Cl), брома (Br) или йода (I).

Используемый в данном документе "гидрокси" относится к радикалу -ОН.

Алкильные, алкенильные, алкинильные, гетероалкильные, циклоалкильные, гетероциклильные, арильные и гетероарильные группы, как определено в данном документе, являются необязательно замещенными (например, "замещенная" или "незамещенная" алкильная, "замещенная" или "незамещенная" алкенильная, "замещенная" или "незамещенная" алкинильная, "замещенная" или "незамещенная" гетероалкильная, "замещенная" или "незамещенная" циклоалкильная, "замещенная" или "незамещенная" гетероциклильная, "замещенная" или "незамещенная" арильная или "замещенная" или "незамещенная" гетероарильная группа). В целом термин "замещенный", независимо от того, предшествует ли ему термин "необязательно" или нет, означает, что по меньшей мере один водород, присутствующий в группе (например, атома углерода или азота), заменен на допустимый заместитель, например, заместитель, который после замещения приводит к стабильному соединению, например, соединению, которое не подвергается самопроизвольной трансформации, такой как перегруппировка, циклизация, отщепление или другая реакция. Если не указано иное, "замещенная" группа имеет заместитель в одном или нескольких замещаемых положениях группы, и если в любой указанной структуре замещено более одного положения, заместитель в каждом положении является одинаковым или различным. Предусматривается, что термин "замещенный" включает замещение всеми допустимыми заместителями органических соединений, такими как любой из заместителей, описанных в настоящем документе, который приводит к образованию стабильного соединения. В настоящем изобретении предусматриваются все без исключения такие комбинации для получения стабильного соединения. Для целей настоящего изобретения гетероатомы, такие как азот, могут иметь водородные заместители и/или любой подходящий заместитель, описанный в данном документе, которые удовлетворяют валентностям гетероатомов и приводят к получению стабильного фрагмента.

Два или более заместителей необязательно могут соединяться с образованием арильной, гетероарильной, циклоалкильной или гетероциклильной групп. Как правило, хотя и не обязательно, такие так называемые образующие кольцо заместители присоединены к циклической основной структуре. В одном варианте осуществления образующие кольцо заместители присоединены к смежным членам основной структуры. Например, два образующих кольцо заместителя, присоединенные к смежным членам циклической основной структуры, создают конденсированную кольцевую структуру. В другом варианте осуществления образующие кольцо заместители присоединены к одному члену основной структуры. Например, два образующих кольцо заместителя, присоединенные к одному члену циклической основной структуры, создают спироциклическую структуру. В еще одном варианте осуществления образующие кольцо заместители присоединены к несмежным элементам основной структуры.

Описанные в данном документе соединения формулы (I) могут содержать один или несколько центров асимметрии и, таким образом, могут существовать в виде различных изомерных форм, например, в виде энантиомеров и/или диастереомеров. Например, соединения, описанные в данном документе, могут находиться в форме отдельного энантиомера, диастереомера или геометрического изомера или могут находиться в форме смеси стереоизомеров, в том числе рацемических смесей и смесей, обогащенных одним или несколькими стереоизомерами. Изомеры можно выделить из смесей при помощи способов, известных специалистам в данной области, в том числе хиральной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и образования и кристаллизации хиральных солей; или предпочтительные изомеры можно получить при помощи процедур асимметрического синтеза. См., например, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); и Wilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972). Настоящее изобретение дополнительно охватывает описанные в данном документе соединения в виде отдельных изомеров, фактически не содержащих другие изомеры, и, в качестве альтернативны, в виде смесей различных изомеров.

Используемое в данном документе чистое энантиомерное соединение фактически не содержит другие энантиомеры или стереоизомеры соединения (т. е. присутствует в энантиомерном избытке). Другими словами, "S"-форма соединения фактически не содержит "R"-форму соединения и, таким образом, присутствует в энантиомерном избытке относительно "R"-формы. Термин "энантиомерно чистый" или "чистый энантиомер" обозначает, что соединение содержит более 75% по весу, более 80% по весу, более 85% по весу, более 90% по весу, более 91% по весу, более 92% по весу, более 93% по весу, более 94% по весу, более 95% по весу, более 96% по весу, более 97% по весу, более 98% по весу, более 99% по весу, более 99,5% по весу или более 99,9% по весу данного энантиомера. В определенных вариантах осуществления показатели по весу основаны на общем весе всех энантиомеров или стереоизомеров соединения.

Соединения формулы (I), описанные в данном документе, также могут содержать одно или несколько изотопных замещений. Например, Н может присутствовать в любой изотопной форме, в том числе ¹H, ²H (D или дейтерий) и ³H (Т или тритий); C может присутствовать в любой изотопной форме, в том числе ¹²C, ¹³C и ¹⁴C; О может присутствовать в любой изотопной форме, в том числе ¹⁶O и ¹⁸O; и т. п.

Подразумевается, что термин "фармацевтически приемлемая соль" включает соли активных соединений, которые получают с помощью относительно нетоксичных кислот или оснований, в зависимости от конкретных заместителей, присутствующих в соединениях, описанных в данном документе. Если соединения, применяемые в настоящем изобретении, содержат относительно кислые функциональные группы, то могут быть получены соли присоединения основания путем приведения нейтральной формы таких соединений в контакт с достаточным количеством требуемого основания, либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения основания включают соль натрия, калия, кальция, аммония, органического амино или магния или аналогичную соль. Если соединения, применяемые в настоящем изобретении, содержат относительно основные функциональные группы, то могут быть получены соли присоединения кислоты путем приведения нейтральной формы таких соединений в контакт с достаточным количеством требуемой кислоты, либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты включают соли, полученные за счет неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, азотная, угольная, моногидроугольная, фосфорная, моногидрофосфорная, дигидрофосфорная, серная, моногидросерная, йодистоводородная кислота или фосфористая кислоты и т. п., а также соли, полученные за счет органических кислот, такие как уксусная, пропионовая, изомасляная, малеиновая, малоновая, бензойная, янтарная, субериновая, фумаровая, молочная, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, п-толилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и т. п. Также включены соли аминокислот, такие как аргинат и т. п., и соли органических кислот, таких как глюкуроновая или галактуноровая кислоты и т. п. (см., например, Berge et al, Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)). Определенные конкретные соединения, применяемые в настоящем изобретении, содержат как основные, так и кислотные функциональные группы, которые позволяют превращать соединения как в соли присоединения основания, так и в соли присоединения кислоты. Такие соли можно получать посредством способов, известных специалистам в данной области техники. Другие фармацевтически приемлемые носители, известные специалистам в данной области техники, являются подходящими для применения в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении могут использоваться соединения формулы (I) в форме пролекарства. Пролекарствами являются такие соединения, которые легко подвергаются химическим изменениям в физиологических условиях с получением соединений, применимых в настоящем изобретении. Кроме того, пролекарства можно превращать в применимые соединения формулы (I) посредством химических или биохимических способов в условиях ex vivo.

Определенные соединения формулы (I), описанные в данном документе, могут существовать в виде несольватированных форм, а также в виде сольватированных форм, в том числе гидратированных форм. В целом сольватированные формы эквивалентны несольватированным формам и охватываются объемом настоящего изобретения. Определенные соединения формулы (I), описанные в данном документе, могут существовать в виде нескольких кристаллических или аморфных форм. В целом все физические формы являются эквивалентными для путей применения, предусмотренных в настоящем изобретении, и, предусматривается, что они находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Термин "сольват" относится к формам соединения, которые ассоциированы с растворителем, обычно за счет реакции сольволиза. Эта физическая ассоциация может включать образование водородных связей. Традиционные растворители включают воду, метанол, этанол, уксусную кислоту, DMSO, THF, диэтиловый эфир и т. п. Описанные в данном документе соединения могут быть получены, например, в виде кристаллической формы и могут быть сольватированными. Подходящие сольваты включают фармацевтически приемлемые сольваты и дополнительно включают как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты.

Термин "гидрат" относится к соединению, которое ассоциировано с водой. Как правило, число молекул воды, содержащихся в гидрате соединения, находится в определенном соотношении с числом молекул соединения в гидрате. Следовательно, гидрат соединения может быть представлен, например, общей формулой R∙x H₂O, где R представляет собой соединение, и где x составляет число, превышающее 0.

Используемый в данном документе термин "таутомер" относится к соединениям, которые представляют собой взаимопревращающиеся формы структуры соединения и которые отличаются перестановкой атомов водорода и электронов. Таким образом, две структуры могут находиться в равновесии благодаря перемещению π-электронов и атома (обычно H). Например, енолы и кетоны являются таутомерами, потому что они быстро взаимопревращаются при обработке либо кислотой, либо основанием. Таутомерные формы могут иметь значение для достижения оптимальной химической реакционной способности и биологической активности представляющего интерес соединения.

Используемый в данном документе символ " " относится к связи с объектом, например полимером (например, гидрогельобразующим полимером, таким как альгинат) или имплантируемым элементом (например, частицей, устройством или материалом). Связь, представленная как " ", может относиться к прямому присоединению к объекту, например, полимеру или имплантируемому элементу, или может относиться к связи с объектом через группу присоединения. "Группа присоединения", описываемая в данном документе, относится к фрагменту для связывания соединения формулы (I) с объектом (например, полимером или имплантируемым элементом, описываемым в данном документе) и может предусматривать любые химические способы присоединения, известные в данной области техники. Список иллюстративных групп присоединения кратко изложен в Bioconjugate Techniques (3^rd ed, Greg T. Hermanson, Waltham, MA: Elsevier, Inc, 2013), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения содержит алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, -C(O)-, -OC(O)-, -N(R^C)-, -N(R^C)C(O)-, -C(O)N(R^C)-, -N(R^C)N(R^D)-, -NCN-, -C(=N(R^C)(R^D))O-, -S-, -S(O)_x-, -OS(O)_x-, -N(R^C)S(O)_x-, -S(O)_xN(R^C)-, -P(R^F)_y-, -Si(OR^A)₂ -, -Si(R^G)(OR^A)-, -B(OR^A)- или металл, где каждый из R^A, R^C, R^D, R^F, R^G, x и y независимо являются такими, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения содержит амин, кетон, сложный эфир, амид, алкил, алкенил, алкинил или тиол. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой сшивающее средство. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой -C(O)(C₁-C₆алкилен)-, где алкилен замещен R¹, а R¹ является таким, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой -C(O)(C₁-C₆алкилен)-, где алкилен замещен 1-2 алкильными группами (например, 1-2 метильными группами). В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой -C(O)C(CH₃)₂-. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой -C(O)(метилен)-, где алкилен замещен 1-2 алкильными группами (например, 1-2 метильными группами). В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой -C(O)CH(CH₃)-. В некоторых вариантах осуществления группа присоединения представляет собой -C(O)C(CH₃)-.

Свойства частиц

В настоящем изобретении описаны частицы, содержащие первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I), например, описанное в данном документе. Частица может быть сферической (например, гидрогелевая капсула) или любой другой формы. Частица может содержать такие материалы, как металлы, металлические сплавы, керамические материалы, полимеры, волокна, инертные материалы и их комбинации. Частица может полностью состоять из одного типа материала или может содержать множество других материалов во втором компартменте и любых первых компартментах.

В некоторых вариантах осуществления первый компартмент модифицирован с помощью соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления второй компартмент модифицирован с помощью соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления как первый компартмент, так и второй компартмент независимо модифицированы с помощью соединения формулы (I).

В некоторых вариантах осуществления частица имеет наибольший линейный размер (LLD), например, средний диаметр или размер, который превышает 1 миллиметр (мм), предпочтительно 1,5 мм или больше. В некоторых вариантах осуществления диаметр или размер частицы может достигать 10 мм. Например, размер частицы, описанной в данном документе находится в диапазоне от 0,5 мм до 10 мм, от 1 мм до 10 мм, от 1 мм до 8 мм, от 1 мм до 6 мм, от 1 мм до 5 мм, от 1 мм до 4 мм, от 1 мм до 3 мм, от 1 мм до 2 мм, от 1 мм до 1,5 мм, от 1,5 мм до 8 мм, от 1,5 мм до 6 мм, от 1,5 мм до 5 мм, от 1,5 мм до 4 мм, от 1,5 мм до 3 мм, от 1,5 мм до 2 мм, от 2 мм до 8 мм, от 2 мм до 7 мм, от 2 мм до 6 мм, от 2 мм до 5 мм, от 2 мм до 4 мм, от 2 мм до 3 мм, от 2,5 мм до 8 мм, от 2,5 мм до 7 мм, от 2,5 мм до 6 мм, от 2,5 мм до 5 мм, от 2,5 мм до 4 мм, от 2,5 мм до 3 мм, от 3 мм до 8 мм, от 3 мм до 7 мм, от 3 мм до 6 мм, от 3 мм до 5 мм, от 3 мм до 4 мм, от 3,5 мм до 8 мм, от 3,5 мм до 7 мм, от 3,5 мм до 6 мм, от 3,5 мм до 5 мм, от 3,5 мм до 4 мм, от 4 мм до 8 мм, от 4 мм до 7 мм, от 4 мм до 6 мм, от 4 мм до 5 мм, от 4,5 мм до 8 мм, от 4,5 мм до 7 мм, от 4,5 мм до 6 мм, от 4,5 мм до 5 мм, от 5 мм до 8 мм, от 5 мм до 7 мм, от 5 мм до 6 мм, от 5,5 мм до 8 мм, от 5,5 мм до 7 мм, от 5,5 мм до 6 мм, от 6 мм до 8 мм, от 6 мм до 7 мм, от 6,5 мм до 8 мм, от 6,5 мм до 7 мм, от 7 мм до 8 мм или от 7,5 мм до 8 мм. В некоторых вариантах осуществления средний диаметр или размер частицы находится в диапазоне от 1 мм до 8 мм. В некоторых вариантах осуществления средний диаметр или размер частицы находится в диапазоне от 1 мм до 4 мм. В некоторых вариантах осуществления средний диаметр или размер частицы находится в диапазоне от 1 мм до 2 мм. В некоторых вариантах осуществления средний диаметр или размер частицы находится в диапазоне от 1,5 мм до 2 мм.

В некоторых вариантах осуществления частица имеет наибольший линейный размер (LLD), например, средний диаметр или размер, который составляет 1 миллиметр (мм) или меньше. В некоторых вариантах осуществления размер частицы находится в диапазоне от 0,3 мм до 1 мм, от 0,4 мм до 1 мм, от 0,5 мм до 1 мм, от 0,6 мм до 1 мм, от 0,7 мм до 1 мм, от 0,8 мм до 1 мм или от 0,9 мм до 1 мм.

В некоторых вариантах осуществления второй (внешний) компартмент полностью окружает первый (внутренний) компартмент, а внутренняя граница второго компартмента образует границу раздела с внешней границей первого компартмента, например, как показано на фиг. 1. В таких вариантах осуществления толщина второго (внешнего) компартмента означает среднее расстояние между внешней границей второго компартмента и границей раздела между двумя компартментами. В некоторых вариантах осуществления толщина внешнего компартмента составляет более чем приблизительно 10 нанометров (нм), предпочтительно 100 нм или больше, и может достигать 1 мм. Например, толщина внешнего компартмента в частице, описанной в данном документе, может составлять от 10 нанометров до 1 миллиметра, от 100 нанометров до 1 миллиметра, от 500 нанометров до 1 миллиметра, от 1 микрометра (мкм) до 1 миллиметра, от 1 мкм до 1 мм, 1 от мкм до 500 мкм, от 1 мкм до 250 мкм, от 1 мкм до 1 мм, от 5 мкм до 500 мкм, от 5 мкм до 250 мкм, от 10 мкм до 1 мм, от 10 мкм до 500 мкм или от 10 мкм до 250 мкм. В некоторых вариантах осуществления толщина внешнего компартмента составляет от 100 нанометров до 1 миллиметра, от 1 мкм до 1 мм, от 1 мкм до 500 мкм или от 5 мкм до 1 мм.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит по меньшей мере одну пору или отверстие, например, для обеспечения свободного потока материалов. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор частицы составляет от приблизительно 0,1 мкм до приблизительно 10 мкм. Например, средний размер пор может составлять от 0,1 мкм до 10 мкм, от 0,1 мкм до 5 мкм, от 0,1 мкм до 2 мкм, от 0,15 мкм до 10 мкм, от 0,15 мкм до 5 мкм, от 0,15 мкм до 2 мкм, от 0,2 мкм до 10 мкм, от 0,2 мкм до 5 мкм, от 0,25 мкм до 10 мкм, от 0,25 мкм до 5 мкм, от 0,5 мкм до 10 мкм, от 0,75 мкм до 10 мкм, от 1 мкм до 10 мкм, от 1 мкм до 5 мкм, от 1 мкм до 2 мкм, от 2 мкм до 10 мкм, от 2 мкм до 5 мкм или от 5 мкм до 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор частицы составляет от приблизительно 0,1 мкм до 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор частицы составляет от приблизительно 0,1 мкм до 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор частицы составляет от приблизительно 0,1 мкм до 1 мкм. В некоторых вариантах осуществления значения среднего размера пор первого компартмента и второго компартмента частицы являются по сути одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления значения среднего размера пор первого компартмента и второго компартмента частицы отличаются на приблизительно 1,5%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, или больше. В некоторых вариантах осуществления средний размер пор частицы (например, средний размер пор первого компартмента и/или средний размер пор второго компартмента) зависит от ряда факторов, таких как материал(ы) в пределах каждого компартмента, а также наличие и плотность соединения формулы (I).

В некоторых вариантах осуществления частица содержит металл или металлический сплав. Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать металл или металлический сплав. Иллюстративные металлы или металлические сплавы включают титан и сплавы титановой группы (например, нитинол, никель-титановые сплавы, материалы на основе сплавов с термопамятью), платину, сплавы платиновой группы, нержавеющую сталь, тантал, палладий, цирконий, ниобий, молибден, никель-хром, хром-молибденовые сплавы или определенные сплавы кобальта (например, кобальт-хромовые и кобальт-хром-никелевые сплавы, например Elgiloy® и Phynox®). Например, металлическим материал может представлять собой нержавеющую сталь марки 316 (SS 316L) (состоящую из Fe, <0,3% C, 16-18,5% Cr, 10-14% Ni, 2-3% Мо, <2% Mn, < 1% Si, <0,45% P и <0,03% S). В содержащих металл частицах количество металла (например, в % по весу, фактический вес) может составлять по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, или больше, например, вес/вес; менее чем 20%, например, менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1%, или меньше.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит керамику. Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать керамику. Иллюстративные керамические материалы включают оксиды, карбиды или нитриды переходных элементов, такие как оксиды титана, оксиды гафния, оксиды иридия, оксиды хрома, оксиды алюминия и оксиды циркония. Также можно применять материалы на основе кремния, такие как диоксид кремния. В содержащих керамику частицах количество керамики (например, в % по весу, фактический вес) может составлять по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, или больше, например, вес/вес; менее чем 20%, например, менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1%, или меньше.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит полимер. Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать полимер. Полимер может быть линейным, разветвленным или сшитым полимером или полимером с выбранными диапазонами молекулярной массы, степенью полимеризации, вязкостью или скоростью течения расплава. Разветвленные полимеры могут предусматривать один или несколько из следующих типов: звездообразные полимеры, гребневые полимеры, полимерные щетки, древовидные полимеры, лестничные полимеры и дендримеры. Полимер может представлять собой термочувствительный полимер, например, гель (например, становящийся твердым или жидким при воздействии тепла или определенной температуры) или фотосшиваемый полимер. Иллюстративные полимеры включают полистирол, полиэтилен, полипропилен, полиацетилен, поли(винилхлорид) (PVC), полиолефиновые сополимеры, поли(уретан)ы, полиакрилаты и полиметакрилаты, полиакриламиды и полиметакриламиды, поли(метилметакрилат), поли(2-гидроксиэтилметакрилат), сложные полиэфиры, полисилоксаны, полидиметилсилоксаны (PDMS), простые полиэфиры, сложные поли(ортоэфиры), поли(карбонаты), поли(гидроксиалканоат)ы, полифторуглероды, PEEK®, Teflon® (политетрафторэтилен, PTFE), PEEK, силиконы, эпоксидные смолы, Kevlar®, Dacron® (конденсационный полимер, полученный из этиленгликоля и терефталевой кислоты), полиэтиленгликоль, найлон, полиалкены, фенольные смолы, природные и синтетические эластомеры, адгезивы и герметики, полиолефины, полисульфоны, полиакрилонитрил, биополимеры, такие как полисахариды и природный латекс, коллаген, целлюлозные полимеры (например, типы алкилцеллюлозы и т. д.), полиэтиленгликоль и 2-гидроксиэтилметакрилат (HEMA), полисахариды, поли(гликолевую кислоту), поли(L-молочную кислоту) (PLLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), полидиоксанон (PDA) или рацемическую поли(молочную кислоту), поликарбонаты (например, полиамиды (например, найлон)), фторопласты, углеродное волокно, агарозу, альгинат, хитозан и их смеси или сополимеры. В содержащих полимер частицах количество полимера (например, в % по весу частицы, фактический вес полимера) может составлять по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, или больше, например, вес/вес; менее чем 20%, например, менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1%, или меньше.

В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полиэтилен. Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать полиэтилен. Иллюстративные полиэтилены включают полиэтилен сверхнизкой плотности (ULDPE) (например, при этом полимеры характеризуются показателями плотности в диапазоне от 0,890 до 0,905 г/см³ и содержат сомономер); полиэтилен очень низкой плотности (VLDPE) (например, при этом полимеры характеризуются показателями плотности в диапазоне от 0,905 до 0,915 г/см³ и содержат сомономер); линейный полиэтилен низкой плотности (LLDPE) (например, при этом полимеры характеризуются показателями плотности в диапазоне от 0,915 до 0,935 г/см³ и содержат сомономер); полиэтилен низкой плотности (LDPE) (например, при этом полимеры характеризуются показателями плотности в диапазоне от приблизительно 0,915 до 0,935 г/м³); полиэтилен средней плотности (MDPE) (например, при этом полимеры характеризуются показателями плотности в диапазоне от 0,926 до 0,940 г/см³ и могут содержать или не содержать сомономер); полиэтилен высокой плотности (HDPE) (например, при этом полимеры характеризуются показателями плотности в диапазоне от 0,940 до 0,970 г/см³ и могут содержать или не содержать сомономер).

В некоторых вариантах осуществления частица содержит полипропилен. Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать полипропилен. Иллюстративные полипропилены включают гомополимеры, статистические сополимеры (гомофазные сополимеры) и ударопрочные сополимеры (гетерофазные сополимеры), например, описываемые в McKeen, Handbook of Polymer Applications in Medicine and Medical Devices, 3- Plastics Used in Medical Devices, (2014):21-53, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит полистирен. Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать полистирен. Иллюстративные полистиролы включают полистирол общего назначения или кристаллический полистирол (PS или GPPS), высокоударопрочный (HIPS) и синдиотактический (SPS) полистирол.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит термопластичный эластомер (TPE). Первый компартмент, второй компартмент или оба компартмента могут содержать TPE. Иллюстративные TPE включают: (i) TPA - полиамидный TPE, содержащий блок-сополимер из чередующихся жестких и мягких сегментов с амидными химическими связями в жестких блоках и эфирными и/или сложноэфирными связями в мягких блоках; (ii) TPC - сополиэфирный TPE, состоящий из блок-сополимера из чередующихся жестких сегментов и мягких сегментов, причем химические связи в основной цепи представляют собой сложноэфирные и/или эфирные; (iii) TPO - олефиновый TPE, состоящий из смеси полиолефина и обычного каучука, причем каучуковая фаза в смеси характеризуется незначительным сшиванием или его отсутствием; (iv) TPS - стирольный TPE, состоящий из по меньшей мере трехблочного сополимера стирола и специфического диена, где два концевых блока (жесткие блоки) представляют собой полистирол, а внутренний блок (мягкий блок или блоки) представляет собой полидиен или гидрогенизованный полидиен; (v) TPU - уретановый TPE, состоящий из блок-сополимера из чередующихся жестких и мягких сегментов с уретановыми химическими связями в жестких блоках и эфирными, сложноэфирными или карбонатными связями или их смесями в мягких блоках; (vi) TPV - вулканизат термопластичного каучука, состоящий из смеси термопластичного материала и обычного каучука, в котором каучук был сшит в процессе динамической вулканизации на стадии составления смеси и смешивания; и (vii) TPZ - неклассифицированный TPE, содержащий любую композицию или структуру, отличную от таковой в группах TPA, TPC, TPO, TPS, TPU и TPV.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит полисахарид, и полисахарид представляет собой альгинат. Альгинат представляет собой полисахарид, состоящий из β-D-маннуроновой кислоты (M) и α-L-гулуроновой кислоты (G). В некоторых вариантах осуществления альгинат представляет собой альгинат с высоким содержанием гулуроновой кислоты (G), и содержание гулуроновой кислоты (G) составляет более чем приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, или больше. В некоторых вариантах осуществления альгинат представляет собой альгинат с высоким содержанием маннуроновой кислоты (М), и содержание маннуроновой кислоты (М) составляет более чем приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, или больше. В некоторых вариантах осуществления отношение M:G составляет приблизительно 1. В некоторых вариантах осуществления отношение M:G составляет меньше 1. В некоторых вариантах осуществления отношение M:G больше 1. В содержащих альгинат частицах количество альгината (например, в % по весу частицы, фактический вес альгината) может составлять по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, или больше, например, вес/вес; менее чем 20%, например, менее чем 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1%, или меньше.

В некоторых вариантах осуществления как первый компартмент, так и второй компартмент содержат одинаковый полимер. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент и второй компартмент содержат разные полимеры. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления второй компартмент содержит альгинат. В некоторых вариантах осуществления как первый компартмент, так и второй компартмент содержат альгинат. В некоторых вариантах осуществления альгинат в первом компартменте отличается от альгината во втором компартменте. В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит альгинат, а второй компартмент содержит другой полимер (например, полисахарид, например, гиалуронат или хитозан). В некоторых вариантах осуществления второй компартмент содержит альгинат, а первый компартмент содержит другой полимер (например, полисахарид, например, гиалуронат или хитозан).

Как первый компартмент, так и второй компартмент могут предусматривать один компонент (например, один полимер) или более одного компонента (например, смесь полимеров). В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит только альгинат (например, химически модифицированный альгинат или смесь немодифицированного альгината и химически модифицированного альгината). В некоторых вариантах осуществления второй компартмент содержит только альгинат (например, химически модифицированный альгинат или смесь немодифицированного альгината и химически модифицированного альгината). В некоторых вариантах осуществления как первый, так и второй компартмент независимо содержат только альгинат (например, химически модифицированный альгинат или смесь немодифицированного альгината и химически модифицированного альгината).

В некоторых вариантах осуществления полимер в одном или обоих из первого и второго компартментов представляет собой (i) низкомолекулярный альгинат, например, характеризующийся примерной MW <75 кДа и соотношением G:M ≥ 1,5, (ii) среднемолекулярный альгинат, например, характеризующийся примерной молекулярной массой 75-150 кДа и соотношением G:M ≥ 1,5, (iii) высокомолекулярный альгинат, например, характеризующийся примерной MW 150 кДа - 250 кДа и соотношением G:M ≥ 1,5, (iv) или смесь двух или более этих разновидностей альгината. В одном варианте осуществления полимер в первом (внутреннем) компартменте представляет собой немодифицированный высокомолекулярный альгинат или немодифицированный среднемолекулярный альгинат, а полимер во втором (внешнем) компартменте представляет собой смесь химически модифицированного альгината (например, альгината, модифицированного с помощью соединения 101, представленного в таблице 2) и немодифицированного альгината, например, смесь 70:30 или смесь 60:40 CM-LMW-Alg-101:U-HMW-Alg, которая может быть получена, как описано в примерах ниже.

В некоторых вариантах осуществления частица содержит альгинат, и соединение формулы (I) ковалентно присоединено к некоторым или всем мономерам в альгинате. В некоторых вариантах осуществления некоторые или все мономеры в альгинате модифицированы с помощью одного и того же соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления некоторые или все мономеры в альгинате модифицированы с помощью различных соединений формулы (I).

В некоторых вариантах осуществления полимер первого компартмента частицы модифицирован с помощью одного соединения формулы (I), а полимер второго компартмент частицы модифицирован с помощью отличающегося соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления частица содержит смесь полимеров, модифицированных с помощью соединения формулы (I), и немодифицированных полимеров (например, полимеров, не являющихся модифицированными с помощью соединения формулы (I)). В некоторых вариантах осуществления первый компартмент содержит смесь полимеров, модифицированных с помощью соединения формулы (I), и немодифицированных полимеров (например, полимеров, не являющихся модифицированными с помощью соединения формулы (I)). В некоторых вариантах осуществления второй компартмент содержит смесь полимеров, модифицированных с помощью соединения формулы (I), и немодифицированных полимеров (например, полимеров, не являющихся модифицированными с помощью соединения формулы (I)).

Полимер частицы, описанной в данном документе, может предусматривать один или нескольких мономеров полимера, модифицированных с помощью соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Модифицированный полимер частицы может присутствовать в первом (внутреннем) компартменте частицы, втором (внешнем) компартменте частицы или как в первом (внутреннем), так и во втором (внешнем) компартментах частицы. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полимер присутствует только во втором компартменте (который содержит внешнюю поверхность частицы). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 0,5% мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I) (например, по меньшей мере 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или более мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I)). В некоторых вариантах осуществления от 0,5% до 50%, от 10% до 90%, от 10% до 50% или 25-75% мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления от 1% до 20% мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I). В некоторых вариантах осуществления от 1% до 10% мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I).

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, альгинат) (при модификации с помощью соединения формулы (I), например, соединения 101 из таблицы 2) характеризуется повышением % N (по сравнению с немодифицированным полимером, например, альгинатом) на любое из следующих значений: (i) по меньшей мере 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, или 10% N по весу; (ii) от 0,1% до 10% по весу, (iii) от 0,1% до 2% по весу; (iv) от 2% до 4% N по весу; (v) от 4% до 8% N по весу; (vi) от 5% до 9% N по весу; (vii) от 6% до 9% по весу, (viii) от 6% до 8% по весу; (ix) от 7% до 9% N по весу и (x) от 8% до 9% N по весу, где в каждом случае % N определяется с помощью анализа сжиганием (например, как описано в примере 2 в данном документе) и соответствует количеству соединения формулы (I) в модифицированном полимере.

Частица (например, первый компартмент или второй компартмент в ней) может содержать соединение формулы (I) в количестве, которое придает частице определенное свойство. Например, поверхность частицы (например, внешняя часть внешнего компартмента) может предусматривать такую концентрацию или плотность соединения формулы (I), которая придает частице противофиброзную активность (т. е. ослабление реакции на инородное тело) в организме субъекта. В одном варианте осуществления поверхность частицы содержит альгинат, химически модифицированный с помощью эффективного для обеспечения противофиброзной активности количества соединения 101. В одном варианте осуществления эффективное для обеспечения противофиброзной активности количество соединения 101 приводит к повышению % N (по сравнению с немодифицированным альгинатом) на величину от приблизительно 0,5% до 2% N, от 2% до 4% N, от приблизительно 4% до 6% N, от приблизительно 6% до 8% или от приблизительно 8% до 10% N), где % N определяется с помощью анализа сжиганием (например, как описано в примере 2 в данном документе) и соответствует количеству соединения 101 в модифицированном альгинате.

Как описано в примерах ниже, некоторые более высокие концентрации соединения формулы (I) во внешнем компартменте двухкомпартментных альгинатных гидрогелевых капсул приводят к снижению механической прочности капсул, возможно, ввиду уменьшения участков на молекулах альгината, которые доступны для сшивания. Таким образом, в одном варианте осуществления поверхность частицы (например, внешняя часть внешнего компартмента) может предусматривать концентрацию или плотность соединения формулы (I), которая является достаточно высокой для того, чтобы придать частице противофиброзную активность, но при этом является более низкой, чем пороговое значения, при котором не обеспечивается достижение необходимой механической прочности. В одном из вариантов осуществления необходимая механическая прочность относится к способности частицы сохранять свою форму и/или оставаться интактной при воздействии любого одного или нескольких из следующих стрессоров: (i) сжатия (например, с постоянной скоростью); (ii) в ходе осуществления процедуры введения (например, имплантации) в организм субъекта и (iii) после истечения необходимого периода имплантации. Механическая прочность частицы может быть измерена до имплантации частицы в организм субъекта и/или после извлечения имплантированной частицы (например, через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 6 недель, 8 недель, 12 недель или более продолжительный период после имплантации). В одном варианте осуществления необходимая механическая прочность частицы (например, гидрогелевой капсулы), определяемая после изготовления, но перед имплантацией, определяется путем проведения испытания на разрыв с использованием анализатора текстуры.

В одном варианте осуществления механическое испытание гидрогелевых капсул проводят с помощью анализатора текстуры TA.XT plus (Stable Micro Systems, Суррей, Великобритания) с использованием 5-миллиметрового зонда, прикрепленного к датчику нагрузки, рассчитанному на нагрузку до 5 кг. Отдельные капсулы помещаются на платформу и подвергаются сжатию за счет осуществляемого сверху воздействия зонда с фиксированной скоростью 0,5 мм/сек. Контакт между зондом и капсулой обнаруживается при измерении силы отталкивания 1 г. Зонд продолжает прохождение 90% расстояния, соответствующего высоте до контакта между зондом и платформой, сжимая капсулу до точки ее разрыва. Сопротивление сжимающей силе зонда измеряется и может быть отображено на графике как функция перемещения зонда (кривая зависимости силы от смещения). Обычно перед тем, как капсула полностью лопнет, она слегка надрывается, и сила, приложенная к зонду, будет незначительно уменьшаться. Макрос анализа может быть запрограммирован с обеспечением обнаружения первого составляющего 0,25-0,5 г уменьшения на кривой зависимости силы от смещения. Сила, приложенная зондом в момент, когда это происходит, называется силой первоначального разрыва. В одном варианте осуществления необходимая механическая прочность частицы, описанной в данном документе (например, двухкомпартментной гидрогелевой капсулы), характеризуется силой первоначального разрыва, составляющей более 1, 1,5, 2, 2,5 или 3 граммов или по меньшей мере 2 грамма.

В одном варианте осуществления необходимая механическая прочность частицы представляет собой способность оставаться интактной в необходимый момент времени после имплантации в организм субъекта, например, как внешний, так и внутренний компартменты гидрогелевой капсулы, извлеченной из организма субъекта, остаются визуально интактными после извлечения из иммунокомпетентной мыши при осмотре с помощью оптической микроскопии, например, посредством визуализации с помощью светлопольной микроскопии, как описано в приведенных в данном документе примерах.

В одном варианте осуществления поверхность частицы содержит альгинат, химически модифицированный с помощью соединения 101 в количестве, которое придает частице как противофиброзные свойства, так и необходимую механическую прочность, например, при концентрации или плотности соединения 101 в модифицированном альгинате, которая приводит к увеличению % N (по сравнению с немодифицированным альгинатом) на любое из следующих значений: (i) от 1% до 3% по весу, (ii) от 2% до 4% N по весу; (iii) от 4% до 8% N по весу; (iv) от 5% до 9% N по весу; (v) от 6% до 9% N по весу, (vi) от 6% до 8% N по весу; (vii) от 7% до 9% N по весу и (ix) от 8% до 9% N по весу; где в каждом случае % N определяется с помощью анализа сжиганием (например, как описано в примере 2 в данном документе) и соответствует количеству соединения формулы (I) в модифицированном альгинате.

Если частица (например, первый компартмент или второй компартмент в ней) содержит альгинат, то альгинат может быть химически модифицирован с помощью соединения формулы (I) с использованием любого подходящего способа, известного в данной области техники. Например, карбоксикислотный фрагмент альгината может быть активирован для связывания с одним или несколькими функционализированными аминогруппами соединениями для обеспечения альгината, модифицированного с помощью соединения формулы (I). Альгинатный полимер можно растворять в воде (30 мл/грамм полимера) и обрабатывать с помощью 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (0,5 экв.) и N-метилморфолина (1 экв.). К этой смеси можно добавлять раствор соединения формулы (I), растворенного в буфере или растворителе, таком как ацетонитрил (0,3 М). Реакционную смесь можно нагревать, например, до 55^°C в течение 16 часов, затем охлаждать до комнатной температуры и концентрировать с помощью роторного испарителя. Затем остаток можно растворять в буфере или растворителе, например в воде. Затем смесь можно фильтровать, например, через слой модифицированного цианогруппами силикагеля (Silicycle), а осадок на фильтре промывать водой. Затем полученный раствор может быть подвергнут диализу (мембрана 10000 MWCO) против буфера или воды в течение 24 часов, например, с заменой буфера или воды по меньшей мере один раз, по меньшей мере два раза, по меньшей мере три раза или больше. Полученный раствор можно концентрировать, например, путем лиофилизации, чтобы получить необходимый химически модифицированный альгинат.

В некоторых вариантах осуществления частица, описанная в данном документе, содержит клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована с обеспечением продуцирования терапевтического средства (например, белка или полипептида, например, антитела, белка, фермента или фактора роста). В некоторых вариантах осуществления клетка размещена в первом компартменте. В некоторых вариантах осуществления клетка размещена во втором компартменте. В некоторых вариантах осуществления клетка размещена в первом компартменте, а второй компартмент не содержит клетку. Частица может содержать активный или неактивный фрагмент белка или полипептида, такого как глюкозооксидаза (например, в случае сенсора глюкозы), киназа, фосфатаза, оксигеназа, гидрогеназа, редуктаза.

В некоторых вариантах осуществления частица способна предотвращать прохождение материалов, превышающих определенный размер, через пору или отверстие. В некоторых вариантах осуществления частица способна предотвращать прохождение материалов, размер которых больше 50 кДа, 75 кДа, 100 кДа, 125 кДа, 150 кДа, 175 кДа, 200 кДа, 250 кДа, 300 кДа, 400 кДа, 500 кДа, 750 кДа, 1000 кДа.

Частица, описанная в данном документе, может быть выполнена с возможностью высвобождения терапевтического средства, например, экзогенного вещества, например, терапевтического средства, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой биологический материал. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой нуклеиновую кислоту (например, РНК или ДНК), белок (например, гормон, фермент, антитело, фрагмент антитела, антиген или эпитоп), малую молекулу, липид, лекарственное средство, вакцину или любое их производное.

Частица (например, описанная в данном документе) может быть представлена в виде препарата или композиции для имплантации или введения в организм субъекта. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% частиц в препарате или композиции обладают характеристикой, описанной в данном документе, например, средним диаметром или средним размером пор.

В некоторых вариантах осуществления частица нацелена или разработана для определенной системы организма, например, нервной системы (например, периферической нервной системы (PNS) или центральной нервной системы (ЦНС)), сосудистой системы, скелетной системы, дыхательной системы, эндокринной системы, лимфатической системы, репродуктивной системы или желудочно-кишечного тракта. В некоторых вариантах осуществления частица нацелена на ЦНС. В некоторых вариантах осуществления частица нацелена или разработана для определенной части тела, например крови, глаза, головного мозга, кожи, легкого, желудка, рта, уха, ноги, ступни, руки, печени, сердца, почки, кости, поджелудочной железы, селезенки, толстой кишки, тонкой кишки, спинного мозга, мышцы, яичника, матки, влагалища или полового члена.

Частица может быть выполнена с возможностью имплантации, или имплантирована в любой участок тела, или размещена в нем или на нем. В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации, имплантирована или размещена в сальник субъекта, в подкожно-жировую клетчатку субъекта или в мышечную ткань субъекта. Частица может быть выполнена с возможностью имплантации, или имплантирована, или размещена на или в коже; поверхности слизистой оболочки, полости тела, брюшной полости (например, сальниковой сумке); центральной нервной системе, например, головном или спинном мозге; органе, например, сердце, печени, почке, селезенке, легком, лимфатической системе, сосудистом русле, ротовой полости, носовой полости, зубах, деснах, желудочно-кишечном тракте; кости; бедре; жировой ткани; мышечной ткани; циркулирующей крови; глазе (например, интраокулярно); молочной железе, влагалище; матке, суставе, например, коленном или тазобедренном суставе, или позвоночнике.

В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации или имплантирована или размещена в брюшной полости (например, сальнике). В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации или имплантирована или размещена в или на сальниковой сумке, также известной как сальниковый мешок или мешок сальника. Сальниковая сумка относится к полости, расположенной в брюшной полости, образованной сальником, и находится в непосредственной близости, например, от большого сальника, малого сальника, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, печени, селезенки, желудочно-селезеночной связки, надпочечников и поджелудочной железы. Обычно сальниковая сумка соединяется с брюшинной полостью через сальниковое отверстие (т. е. отверстие Винслоу). В некоторых вариантах осуществления сальниковая сумка содержит высокую концентрацию жировой ткани. Частица может быть имплантирована в брюшную полость (например, сальник, например, сальниковую сумку) или размещена на поверхности внутри брюшной полости (например, сальника, например, сальниковой сумки) с помощью инъекции или катетера. Дополнительные аспекты имплантации или размещения частицы в сальник (например, сальниковую сумку) приведены в M. Pellicciaro et al. (2017) CellR4 5(3):e2410, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации или имплантирована или размещена в центральной нервной системе (ЦНС), например, в головном или спинном мозге и их соответствующих тканях и полостях. У позвоночных ЦНС содержится в дорсальной полости тела, в том числе полости черепа и позвоночном канале. В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации или имплантирована или размещена во внутримозговом пространстве, например, внутрипаренхимальном пространстве, внутрижелудочковом пространстве или субдуральном пространстве. Частица может быть имплантирована в ЦНС или размещена на поверхности в ЦНС через отверстие, проделанное в черепе, и доставлена посредством инъекции или катетера.

В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации или имплантирована или помещена в глаз. Иллюстративные области, подходящие для имплантации или размещения частицы, включают любую поверхность или полость внутри глаза, такую как сетчатка, роговица, эпителий, водянистая влага или стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления частица выполнена с возможностью имплантации или имплантирована или размещена в стекловидном теле. Частица может быть имплантирована в глаз или размещена на поверхности внутри глаза посредством разреза и/или инъекции.

В некоторых вариантах осуществления частица легко извлекается из субъекта, например, не травмируя субъекта или не вызывая значительное разрушение окружающей ткани. В одном варианте осуществления частица может быть извлечена с помощью минимального хирургического отделения частицы от окружающей ткани или без него, например, за счет минимально инвазивного хирургического подхода, экстракции или резекции.

Частица может быть выполнена с возможностью ограниченного по времени воздействия (например, менее 2 дней, 1 дня, 24 часов, 20 часов, 16 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов, 6 часов, 5 часов, 4 часов, 3 часов, 2 часов, 1 часа или меньше). Частица может быть выполнена с возможностью длительного воздействия (например, по меньшей мере 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев, 20 месяцев, 21 месяц, 22 месяца, 23 месяца, 24 месяца, 1 год, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года, 3,5 года, 4 года или больше). Частица может быть выполнена с возможностью постоянного воздействия (например, по меньшей мере 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев, 20 месяцев, 21 месяц, 22 месяца, 23 месяца, 24 месяца, 1 год, 1,5 года, 2 года, 2,5 года, 3 года, 3,5 года, 4 года или больше).

В некоторых вариантах осуществления частица не является частицей, раскрытой в любой из WO2012/112982, WO2012/167223, WO2014/153126, WO2016/019391, WO2016/187225, US2012-0213708, US 2016-0030359 и US 2016-0030360.

Соединения

В некоторых вариантах осуществления частицы, описанные в данном документе, содержат соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления первый компартмент и/или второй компартмент частицы содержат соединение формулы (I):

(I),

или его фармацевтически приемлемую соль, где

А представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)-, -N(R^C)-, -N(R^C)C(O)-, -C(O)N(R^C)-, -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)-, -N(R^C)C(O)(C₂-C₆-алкенилен)-, -N(R^C)N(R^D)-, -NCN-, -C(=N(R^C)(R^D))O-, -S-, -S(O)_x-, -OS(O)_x-, -N(R^C)S(O)_x-, -S(O)_xN(R^C)-, -P(R^F)_y-, -Si(OR^A)₂-, -Si(R^G)(OR^A)-, -B(OR^A)- или металл, каждый из которых необязательно связан с группой присоединения (например, группой присоединения, описанной в данном документе) и необязательно замещен одним или несколькими R¹;

каждый из L¹ и L³ независимо представляет собой связь, алкил или гетероалкил, где каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен одним или несколькими R²;

L² представляет собой связь;

М отсутствует или представляет собой алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R³;

P отсутствует или представляет собой циклоалкил, гетероциклил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R⁴;

Z представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, -OR^A, -C(O)R^A, -C(O)OR^A, -C(O)N(R^C)(R^D), -N(R^C)C(O)R^A, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁵;

каждый R^A, R^B, R^C, R^D, R^E, R^F и R^G независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, азидо, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

или R^C и R^D, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо (например, 5-7-членное кольцо), необязательно замещенное одним или несколькими R⁶;

каждый R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, азидо, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1,-OC(O)R^B1, -N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^B1, -C(O)N(R^C1), SR^E1, S(O)_xR^E1, -OS(O)_xR^E1, -N(R^C1)S(O)_xR^E1, - S(O)_xN(R^C1)(R^D1), -P(R^F1)_y, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R^A1, R^B1, R^C1, R^D1, R^E1 и R^F1 независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R⁷ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, оксо, гидроксил, циклоалкил или гетероциклил;

х составляет 1 или 2; и

y составляет 2, 3 или 4.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-a):

(I-a),

или его соль, где

А представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)-, -N(R^C)-, -N(R^C)C(O)-, -C(O)N(R^C)-, -N(R^C)N(R^D)-, -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)-, -N(R^C)C(O)(C₂-C₆-алкенилен)-, -NCN-, -C(=N(R^C)(R^D))O-, -S-, -S(O)_x-, -OS(O)_x-, -N(R^C)S(O)_x-, -S(O)_xN(R^C)-, -P(R^F)_y-, -Si(OR^A)₂-, -Si(R^G)(OR^A)-, -B(OR^A)- или металл, каждый из которых необязательно связан с группой присоединения (например, группой присоединения, описанной в данном документе) и необязательно замещен одним или несколькими R¹;

каждый из L¹ и L³ независимо представляет собой связь, алкил или гетероалкил, где каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен одним или несколькими R²;

L² представляет собой связь;

М отсутствует или представляет собой алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R³;

P представляет собой гетероарил, необязательно замещенный одним или несколькими R⁴;

Z представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R⁵;

каждый R^A, R^B, R^C, R^D, R^E, R^F и R^G независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, азидо, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

или R^C и R^D, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо (например, 5-7-членное кольцо), необязательно замещенное одним или несколькими R⁶;

каждый R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, азидо, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1,-OC(O)R^B1, -N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^B1, -C(O)N(R^C1), SR^E1, S(O)_xR^E1, -OS(O)_xR^E1, -N(R^C1)S(O)_xR^E1, - S(O)_xN(R^C1)(R^D1), -P(R^F1)_y, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R^A1, R^B1, R^C1, R^D1, R^E1 и R^F1 независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R⁷ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, оксо, гидроксил, циклоалкил или гетероциклил;

х составляет 1 или 2; и

y составляет 2, 3 или 4.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) А представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)-, -N(R^C)C(O)-, -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)-, -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкенилен)- или -N(R^C)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)- или -N(R^C)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)- или -N(R^C)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой алкил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O) или -N(R^C)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -N(R^C)C(O)-, -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)- или -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкенилен)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -N(R^C)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -N(R^C) -, а R^C и R^D независимо представляет собой водород или алкил. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -NH-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)-, где алкилен замещен R¹. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)-, а R¹ представляет собой алкил (например, метил). В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -NHC(O)C(CH₃)₂-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -N(R^C)C(O)(метилен)-, а R¹ представляет собой алкил (например, метил). В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -NHC(O)CH(CH₃)-. В некоторых вариантах осуществления A представляет собой -NHC(O)C(CH₃)-.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) L¹ представляет собой связь, алкил или гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой связь или алкил. В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой связь. В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой алкил. В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой C₁-C₆алкил. В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой -CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂CH₂CH₂ или -CH₂CH₂-. В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой -CH₂- или -CH₂CH₂-.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) L³ представляет собой связь, алкил или гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой связь. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой алкил. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой C₁-C₁₂алкил. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой C₁-C₆алкил. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой -CH₂-. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой C₁-C₁₂гетероалкил, необязательно замещенный одним или несколькими R² (например, оксо). В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой C₁-C₆гетероалкил, необязательно замещенный одним или несколькими R² (например, оксо). В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой -C(O)OCH₂-, -CH₂(OCH₂CH₂)₂-, -CH₂(OCH₂CH₂)₃-, CH₂CH₂O- или -CH₂O-. В некоторых вариантах осуществления L³ представляет собой -CH₂O-.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) М отсутствует или представляет собой алкил, гетероалкил, арил или гетероарил. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой гетероалкил, арил или гетероарил. В некоторых вариантах осуществления М отсутствует. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой алкил (например, C₁-C₆алкил). В некоторых вариантах осуществления M представляет собой -CH₂-. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой гетероалкил (например, C₁-C₆гетероалкил). В некоторых вариантах осуществления M представляет собой (-OCH₂CH₂-)z, где z составляет целое число, выбранное от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления z составляет целое число, выбранное от 1 до 5. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой -OCH₂CH₂-, (-OCH₂CH₂-)₂, (-OCH₂CH₂-)₃, (-OCH₂CH₂-)₄ или (-OCH₂CH₂-)₅. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой -OCH₂CH₂-, (-OCH₂CH₂-)₂, (-OCH₂CH₂-)₃ или (-OCH₂CH₂-)₄. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой (-OCH₂CH₂-)₃. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой арил. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой фенил. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой незамещенный фенил. В некоторых вариантах осуществления M представляет собой . В некоторых вариантах осуществления M представляет собой фенил, замещенный R⁷ (например, 1 R⁷). В некоторых вариантах осуществления M представляет собой . В некоторых вариантах осуществления R⁷ представляет собой CF₃.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) P отсутствует или представляет собой гетероциклил или гетероарил. В некоторых вариантах осуществления Р отсутствует. В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) и (I-a) P представляет собой трициклический, бициклический или моноциклический гетероарил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой моноциклический гетероарил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой азотсодержащий гетероарил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой моноциклический азотсодержащий гетероарил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой 5-членный гетероарил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой 5-членный азотсодержащий гетероарил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой тетразолил, имидазолил, пиразолил или триазолил, пирролил, оксазолил или тиазолил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой тетразолил, имидазолил, пиразолил, или триазолил, или пирролил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой имидазолил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой . В некоторых вариантах осуществления P представляет собой триазолил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой 1,2,3-триазолил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления P представляет собой гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой 5-членный гетероциклил или 6-членный гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой имидазолидинонил. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой . В некоторых вариантах осуществления P представляет собой тиоморфолинил-1,1-диоксидил.

В некоторых вариантах осуществления P представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) Z представляет собой алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой моноциклический или бициклический гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z является кислородсодержащим гетероциклилом. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 4-членный гетероциклил, 5-членный гетероциклил или 6-членный гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 6-членный гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 6-членный кислородсодержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой тетрагидропиранил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой , или . В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 4-членный кислородсодержащий гетероциклил. В некоторых

вариантах осуществления Z представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой бициклический кислородсодержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой фталевый ангидрид. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой серосодержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 6-членный серосодержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 6-членный гетероциклил, содержащий атом азота и атом серы. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой тиоморфолинил-1,1-диоксидил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой . В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой азотсодержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 6-членный азотсодержащий гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой бициклический гетероциклил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой бициклический азотсодержащий гетероциклил, необязательно замещенный одним или несколькими R⁵. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 2-окса-7-азаспиро[3.5]нонанил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой . В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой 1-окса-3,8-диазаспиро[4.5]декан-2-он. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой .

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) Z представляет собой арил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой моноциклический арил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой фенил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил (например, 1 R⁵). В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ представляет собой азотсодержащую группу. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ представляет собой NH₂. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ представляет собой кислородсодержащую группу. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ представляет собой кислородсодержащий гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ представляет собой OCH₃. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ находится в орто-положении. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ находится в мета-положении. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой монозамещенный фенил, где 1 R⁵ находится в пара-положении.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) Z представляет собой алкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₁₂алкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₁₀алкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈алкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈алкил, замещенный 1-5 R⁵. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈алкил, замещенный 1 R⁵. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈алкил, замещенный 1 R⁵, где R⁵ представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1,-OC(O)R^B1 или -N(R^C1)(R^D1). В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈алкил, замещенный 1 R⁵, где R⁵ представляет собой-OR^A1 или -C(O)OR^A1. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈алкил, замещенный 1 R⁵, где R⁵ представляет собой-OR^A1 или -C(O)OH. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой -CH₃.

В некоторых вариантах осуществления в формулах (I) или (I-a) Z представляет собой гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₁₂гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₁₀гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₈гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой C₁-C₆гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой азотсодержащий гетероалкил, необязательно замещенный одним или несколькими R⁵. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой азот- или серосодержащий гетероалкил, замещенный 1-5 R⁵. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой N-метил-2-(метилсульфонил)этан-1-аминил.

В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой -OR^A или -C(O)OR^A. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой -OR^A (например, -OH или -OCH₃). В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой -OCH₃. В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой -C(O)OR^A (например, -C(O)OH).

В некоторых вариантах осуществления Z представляет собой водород.

В некоторых вариантах осуществления L² представляет собой связь, а P и L³ независимо отсутствуют. В некоторых вариантах осуществления L² представляет собой связь, P представляет собой гетероарил, L³ представляет собой связь, а Z представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой гетероарил, L³ представляет собой гетероалкил, а Z представляет собой алкил.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-b):

(I-b),

или его соль, где кольцо M¹ представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен 1-5 R³; кольцо Z¹ представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, необязательно замещенные 1-5 R⁵; каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, нитро, амино, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, или каждый из R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; X отсутствует или представляет собой N(R¹⁰)(R¹¹), O или S; R^C представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый из алкила, алкенила, алкинила, гетероалкила, циклоалкила, гетероциклила, арила или гетероарила необязательно замещен 1-6 R⁶; каждый R³, R⁵ и R⁶ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, азидо, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1, -OC(O)R^B1, -N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^B1, -C(O)N(R^C1), SR^E1, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; каждый из R¹⁰ и R¹¹ независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1, -OC(O)R^B1, -C(O)N(R^C1), циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; каждый R^A1, R^B1, R^C1, R^D1 и R^E1 независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, где каждый из алкила, алкенила, алкинила, гетероалкила, циклоалкила, гетероциклила, арила, гетероарила необязательно замещен 1-6 R⁷; каждый R⁷ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, оксо, гидроксил, циклоалкил или гетероциклил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в каждом R³ и R⁵ каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил необязательно и независимо замещен галогеном, оксо, циано, циклоалкилом или гетероциклилом.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-b-i):

(I-b-i),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо M² представляет собой арил или гетероарил, необязательно замещенный одним или несколькими R³; кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил, или гетероалкил, или каждый из R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; X отсутствует или представляет собой O или S; каждый R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1, при этом каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен галогеном; или два R⁵, взятые вместе, образуют 5-6-членное кольцо, конденсированное с кольцом Z²; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; p составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-b-i) представляет собой соединение формулы (I-b-ii):

(I-b-ii),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; каждый из R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1, при этом каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен галогеном; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый из p и q независимо составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-c):

(I-c),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; каждый из R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1, при этом каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен галогеном; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; m составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; каждый из p и q независимо составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-d):

(I-d),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; X отсутствует или представляет собой O или S; каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или каждый из R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1, при этом каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен галогеном; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый из m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; p составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-e):

(I-e),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; X отсутствует или представляет собой O или S; каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или каждый из R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый из m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; p составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (I-f):

(I-f),

или его фармацевтически приемлемую соль, где M представляет собой алкил, необязательно замещенный одним или несколькими R³; кольцо P представляет собой гетероарил, необязательно замещенный одним или несколькими R⁴; L³ представляет собой алкил или гетероалкил, необязательно замещенный одним или несколькими R²; Z представляет собой алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R⁵; каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или R^2a и R^2b, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R², R³, R⁴ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (II):

(II),

или его фармацевтически приемлемую соль, где M представляет собой связь, алкил или арил, при этом алкил или арил необязательно замещен одним или несколькими R³; L³ представляет собой алкил или гетероалкил, необязательно замещенный одним или несколькими R²; Z представляет собой водород, алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил или -OR^A, при этом алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁵; R^A представляет собой водород; каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или R^2a и R^2b, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R², R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 и 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (II) представляет собой соединение формулы (II-a):

(II-a),

или его фармацевтически приемлемую соль, где L³ представляет собой алкил или гетероалкил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R²; Z представляет собой водород, алкил, гетероалкил или -OR^A, при этом алкил и герероалкил необязательно замещены одним или несколькими R⁵; каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил, или R^2a и R^2b, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый R², R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; R^A представляет собой водород; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил, или гетероалкил; n составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (III):

(III),

или его фармацевтически приемлемую соль, где Z¹ представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен 1-5 R⁵; каждый из R^2a, R^2b, R^2cи R^2d независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, нитро, амино, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил; или R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; R^C представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил или гетероалкил, при этом каждый из алкила, алкенила, алкинила или гетероалкила необязательно замещен 1-6 R⁶; каждый из R³, R⁵ и R⁶ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; q составляет целое число от 0 до 25; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение формулы (III-a):

(III-a),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен 1-5 R⁵; каждый из R^2a, R^2b, R^2с и R^2d независимо представляет собой водород, алкил, гетероалкил, галоген; или R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый из R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; каждый o и p независимо составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; q составляет целое число от 0 до 25; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III-a) представляет собой соединение формулы (III-b):

(III-b),

или его фармацевтически приемлемую соль, где кольцо Z² представляет собой циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен 1-5 R⁵; каждый из R^2a, R^2b, R^2с и R^2d независимо представляет собой водород, алкил, гетероалкил, галоген; или R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый из R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; каждый o и p независимо составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; q составляет целое число от 0 до 25; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III-a) представляет собой соединение формулы (III-c):

(III-c),

или его фармацевтически приемлемую соль, где X представляет собой C(R')(R"), N(R') или S(O)_x; каждый из R' и R" независимо представляет собой водород, алкил, галоген или циклоалкил; каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил, гетероалкил или галоген; или R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый из R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; p составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; q составляет целое число от 0 до 25; x составляет 0, 1 или 2; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III-c) представляет собой соединение формулы (III-d):

(III-d),

или его фармацевтически приемлемую соль, где X представляет собой C(R')(R"), N(R') или S(O)_x; каждый из R' и R" независимо представляет собой водород, алкил, галоген или циклоалкил; каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, алкил, гетероалкил или галоген; или R^2a и R^2b или R^2c и R^2d, взятые вместе, образуют оксо-группу; каждый из R³ и R⁵ независимо представляет собой алкил, гетероалкил, галоген, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1 или -C(O)R^B1; каждый R^A1 и R^B1 независимо представляет собой водород, алкил или гетероалкил; каждый m и n независимо составляет 1, 2, 3, 4, 5 или 6; p составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5; q составляет целое число от 0 до 25; x составляет 0, 1 или 2; и " " обозначает связь с группой присоединения или полимером, описанным в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления L² представляет собой связь, а P и L³ независимо отсутствуют.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-a). В некоторых вариантах осуществления формулы (II-a) L² представляет собой связь, P представляет собой гетероарил, L³ представляет собой связь, а Z представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой гетероарил, L³ представляет собой гетероалкил, а Z представляет собой алкил. В некоторых вариантах осуществления L² представляет собой связь, а P и L³ независимо отсутствуют. В некоторых вариантах осуществления L² представляет собой связь, P представляет собой гетероарил, L³ представляет собой связь, а Z представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления P представляет собой гетероарил, L³ представляет собой гетероалкил, а Z представляет собой алкил.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b). В некоторых вариантах осуществления P отсутствует, L¹ представляет собой -NHCH₂, L² представляет собой связь, M представляет собой арил (например, фенил), L³ представляет собой -CH₂O, а Z представляет собой гетероциклил (например, азотсодержащий гетероциклил, например, тиоморфолинил-1,1-диоксид). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-b) представляет собой соединение 116.

В некоторых вариантах осуществления формулы (I-b) P отсутствует, L¹ представляет собой -NHCH₂, L² представляет собой связь, M отсутствует, L³ представляет собой связь, а Z представляет собой гетероциклил (например, кислородсодержащий гетероциклил, например, тетрагидропиранил, тетрагидрофуранил, оксетанил или оксиранил). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-b) представляет собой соединение 105.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b-i). В некоторых вариантах осуществления формулы (I-b-i) каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород или CH₃, каждый из R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 1 или 2, n составляет 1, X представляет собой O, p составляет 0, M² представляет собой фенил, необязательно замещенный одним или несколькими R³, R³ представляет собой -CF₃, а Z² представляет собой гетероциклил (например, кислородсодержащий гетероциклил, например, тетрагидропиранил, тетрагидрофуранил, оксетанил или оксиранил). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-b-i) представляет собой соединение 100, соединение 106, соединение 107, соединение 108, соединение 109 или соединение 111.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b-ii). В некоторых вариантах осуществления формулы (I-b-ii) каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, q составляет 0, p составляет 0, m составляет 1, а Z² представляет собой гетероциклил (например, кислородсодержащий гетероциклил, например, тетрагидропиранил). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-b-ii) представляет собой соединение 100.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-c). В некоторых вариантах осуществления формулы (I-c) каждый из R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 1, p составляет 1, q составляет 0, R⁵ представляет собой -CH₃, а Z представляет собой гетероциклил (например, азотсодержащий гетероциклил, например, пиперазинил). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-c) представляет собой соединение 113.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-d). В некоторых вариантах осуществления формулы (I-d) каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 1, n составляет 3, X представляет собой O, p составляет 0, а Z представляет собой гетероциклил (например, кислородсодержащий гетероциклил, например, тетрагидропиранил, тетрагидрофуранил, оксетанил или оксиранил). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-d) представляет собой соединение 110 или соединение 114.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-f). В некоторых вариантах осуществления формулы (I-f) каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, n составляет 1, M представляет собой -CH₂-, P представляет собой азотсодержащий гетероарил (например, имидазолил), L³ представляет собой -C(O)OCH₂-, а Z представляет собой CH₃. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I-f) представляет собой соединение 115.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (II-a). В некоторых вариантах осуществления формулы (II-a) каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, n составляет 1, q составляет 0, L³ представляет собой -CH₂(OCH₂CH₂)₂, а Z представляет собой -OCH₃. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (II-a) представляет собой соединение 112.

В некоторых вариантах осуществления формулы (II-a) каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, n составляет 1, L³ представляет собой связь или -CH₂, а Z представляет собой водород или -OH_. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (II-a) представляет собой соединение 103 или соединение 104.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (III). В некоторых вариантах осуществления формулы (III) каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 1, n составляет 2, q составляет 3, p составляет 0, R^C представляет собой водород, а Z¹ представляет собой гетероалкил, необязательно замещенный R⁵ (например, -N(CH₃)(CH₂CH₂)S(O)₂CH₃). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III) представляет собой соединение 120.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (III-b). В некоторых вариантах осуществления формулы (III-b), каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 0, n составляет 2, q составляет 3, p составляет 0, а Z² представляет собой арил (например, фенил), замещенный 1 R⁵ (например, -NH₂). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III-b) представляет собой соединение 102.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (III-b). В некоторых вариантах осуществления формулы (III-b) каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 1, n составляет 2, q составляет 3, p составляет 0, R^C представляет собой водород, а Z² представляет собой гетероциклил (например, азотсодержащий гетероциклил, например, азотсодержащий спирогетероциклил, например, 2-окса-7-азаспиро[3.5]нонанил). В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III-b) представляет собой соединение 121.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (III-d). В некоторых вариантах осуществления формулы (III-d) каждый из R^2a, R^2b, R^2c и R^2d независимо представляет собой водород, m составляет 1, n составляет 2, q составляет 1, 2, 3 или 4, p составляет 0, а X представляет собой S(O)₂. В некоторых вариантах осуществления формулы (III-d) каждый из R^2a и R^2b независимо представляет собой водород, m составляет 1, n составляет 2, q составляет 1, 2, 3 или 4, p составляет 0, а X представляет собой S(O)₂. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (III-d) представляет собой соединение 101, соединение 117, соединение 118 или соединение 119.

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b), (I-d) или (I-e). В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b), (I-d) или (II). В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b), (I-d) или (I-f). В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I-b), (I-d) или (III).

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) не является соединением, раскрытым в WO2012/112982, WO2012/167223, WO2014/153126, WO2016/019391, WO 2017/075630, US2012-0213708, US 2016-0030359 или US 2016-0030360.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) предусматривает соединение, представленное в таблице 2, или его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых вариантах осуществления частица, описанная в данном документе, содержит соединение, представленное в таблице 2, или его фармацевтически приемлемую соль.

Таблица 2. Иллюстративные соединения

Соединение № Структура 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой соединение формулы (I) (например, формул (I-a), (I-b), (I-c), (I-d), (I-e), (I-f), (II), (II-a), (III), (III-a), (III-b), (III-c) или (III-d)) или его фармацевтически приемлемую соль и выбрано из

, и или их фармацевтически приемлемой соли.

В некоторых вариантах осуществления частица, описанная в данном документе, содержит соединение, представляющее собой , или их фармацевтически приемлемую соль.

В одном варианте осуществления частица, описанная в данном документе, содержит соединение формулы (I) (например, соединение, представленное в таблице 2), ковалентно связанное с альгинатным полимером. В одном варианте осуществления частица, описанная в данном документе, содержит соединение формулы (I) (например, соединение, представленное в таблице 2, например, соединение 101), ковалентно связанное с одним или несколькими мономерами, представленными гулуроновой кислотой и/или маннуроновой кислотой, в альгинатном полимере, например, с помощью амидной связи.

В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) (например, соединение 101 в таблице 2) ковалентно присоединено к альгинату (например, альгинату с примерной MW <75 кДа, соотношением G:M ≥ 1,5) при плотности конъюгирования, составляющей по меньшей мере 2,0% и менее 9,0% азота, или от 2,0% до 5% азота, от 3,0% до 8,0% азота, от 5% до 8,0% азота, от 4,0% до 7,0% азота, от 5,0% до 7,0% азота, или от 6,0% до 7,0% азота, или приблизительно 6,8% азота, как определено с помощью анализа сжиганием для измерения процентного содержания азота, как описано в примерах ниже.

Клетки

Частицы по настоящему изобретению могут содержать широкий ряд различных типов клеток (например, клеток человека), в том числе эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки, кератиноциты, островковые клетки и клетки, полученные из любых из вышеперечисленных типов клеток. Клетки могут быть получены из стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Иллюстративные типы клеток включают типы клеток, перечисленные в WO 2017/075631. В некоторых вариантах осуществления клетки получены из линии клеток, представленной в таблице 3 ниже.

Таблица 3. Иллюстративные линии клеток

Линия клеток Тип клеток Зародышевый слой Коммерческий источник ARPE-19 Эпителиальная (сетчатка) Эктодерма ATCC (CRL-2302) BJ Фибробласт (крайняя плоть) Эктодерма ATCC (CRL-2522) CCD-841-CoN Эпителиальная (толстая кишка) Эндодерма ATCC (CRL-1790) HaCat Кератиноцит Эктодерма Addexbio (T0020001) HHSEC Эндотелиальная (синусоидные капилляры печени) Эндодерма Sciencellonline.com (№ 5000) Huv-EC-C Эндотелиальная (пуповина эмбриона) Мезодерма ATCC (CRL-1730) MCF-10A Эпителиальная (молочная железа) Эктодерма ATCC (CRL-10317) MRC-5 Фибробласт (легкое) Мезодерма ATCC (CCL-171) MSC человека Мезенхима (костный мозг) Мезодерма ATCC (PCS-500-012) MSC мыши Мезенхима (костный мозг) Мезодерма Cyagen (MU BMX-01001) WS-1 Фибробласт (кожа) Эктодерма ATCC (CRL-1502) 293F Эпителиальная (почка эмбриона) Мезодерма Thermo Fisher (R790007)

В некоторых вариантах осуществления частица не содержит какого-либо количества островковых клеток, как определено в данном документе. В одном варианте осуществления клетки, содержащиеся в частице по настоящему изобретению, например, клетки RPE, MSFC, в том числе сконструированные клетки RPE и MSFC, обладают одной или несколькими из следующих характеристик: (i) не способны продуцировать инсулин (например, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина или проинсулин) в количестве, эффективном для лечения сахарного диабета или другого заболевания или состояния, которое можно лечить с помощью инсулина; (ii) не способны продуцировать инсулин чувствительным к уровню глюкозы образом или (iii) не представляют собой индуцированную плюрипотентную клетку, которая сконструирована для превращения в дифференцированную инсулин-продуцирующую бета-клетку поджелудочной железы.

В одном варианте осуществления частицы, описанные в данном документе, содержат совокупность клеток. В одном варианте осуществления совокупность клеток находится в виде клеточной суспензии перед инкапсулированием внутрь частицы, описанной в данном документе. Клетки в суспензии могут находиться в виде отдельных клеток (например, из однослойной клеточной культуры) или могут быть представлены в другом виде, например размещаться на микроносителе (например, грануле или матрице) или находиться в виде трехмерного агрегата клеток (например, кластера или сфероида из клеток). Суспензия клеток может содержать множество кластеров клеток (например, в виде сфероидов) или микроносителей.

В некоторых вариантах осуществления клетки были сконструированы с обеспечением продуцирования терапевтического средства для предупреждения или лечения заболевания, нарушения или состояния, описанного, например, в WO 2017/075631. Терапевтическое средство может представлять собой любое биологическое вещество, такое как нуклеиновая кислота (например, нуклеотид, ДНК или РНК), полипептид, липид, сахар (например, моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид) или малая молекула. Иллюстративные терапевтические средства включают средства, приведенные в WO 2017/075631.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой пептид или полипептид (например, белок), такой как гормон, фермент, цитокин (например, провоспалительный цитокин или противовоспалительный цитокин), фактор роста, фактор свертывания или липопротеин. Пептид или полипептид (например, белок, например, гормон, фактор роста, фактор свертывания или фактор коагуляции, молекула антитела, фермент, цитокин, рецептор цитокина или химерный белок, в том числе цитокинов или рецептора цитокина), продуцируемые сконструированной клеткой, могут характеризоваться встречающейся в природе аминокислотной последовательностью или могут содержать вариант встречающейся в природе последовательности. Вариант может предусматривать встречающуюся в природе или не встречающуюся в природе аминокислотную замену, мутацию, делецию или добавление по сравнению с эталонной встречающейся в природе последовательностью. Встречающаяся в природе аминокислотная последовательность может представлять собой полиморфный вариант. Встречающаяся в природе аминокислотная последовательность может представлять собой человеческую или отличную от человеческой аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления встречающаяся в природе аминокислотная последовательность или ее встречающийся в природе вариант представляет собой человеческую последовательность. Кроме того, пептид или полипептид (например, белок) для применения по настоящему изобретению может быть модифицирован тем или иным образом, например, посредством химической или ферментативной модификации (например, с помощью гликозилирования, фосфорилирования). В некоторых вариантах осуществления пептид содержит приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления средняя молекулярная масса белка составляет 5 кДа, 10 кДа, 25 кДа, 50 кДа, 100 кДа, 150 кДа, 200 кДа, 250 кДа, 500 кДа или более.

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой гормон. Иллюстративные гормоны включают антидиуретический гормон (ADH), окситоцин, гормон роста (GH), пролактин, рилизинг гормон гормона роста (GHRH), тиреотропный гормон (TSH), тиреотропин-рилизинг гормон (TRH), адренокортикотропный гормон (ACTH), фолликулостимулирующий гормон (FSH), лютеинизирующий гормон (LH), рилизинг гормон лютеинизирующего гормона (LHRH), тироксин, кальцитонин, паратиреоидный гормон, альдостерон, кортизол, эпинефрин, глюкагон, инсулин, эстроген, прогестерон, тестостерон. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой инсулин (например, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина или проинсулин). В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой гормон роста, такой как гормон роста человека (hGH), рекомбинантный гормон роста человека (rhGH), гормон роста крупного рогатого скота, метионин-содержащий гормон роста человека, дез-фенилаланин-гормон роста человека и гормон роста свиней.

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой фактор роста, например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эпидермиса (EGF) трансформирующий фактор роста (TGF) и инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II).

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой фактор свертывания или фактор коагуляции, например, фактор свертывания крови или фактор коагуляции крови. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой белок, вовлеченный в коагуляцию, т. е. в процесс, при котором кровь превращается из жидкости в твердое вещество или гель. Иллюстративные факторы свертывания и факторы коагуляции включают фактор I (например, фибриноген), фактор II (например, протромбин), фактор III (например, тканевой фактор), фактор V (например, проакселерин, лабильный фактор), фактор VI, фактор VII (например, стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (например, антигемофильный фактор A), фактор VIIIC, фактор IX (например, антигемофильный фактор B), фактор X (например, фактор Стюарта-Прауэр), фактор XI (например, плазменный предшественник тромбопластина), фактор XII (например, фактор Хагермана), фактор XIII (например, фибрин-стабилизирующий фактор), фактор фон Виллебранда, прекалликреин, кофактор гепарина II, высокомолекулярный кининоген (например, фактор Фицджеральда), антитромбин III и фибронектин. В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой фактор, препятствующий свертыванию крови, такой как белок С.

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой молекулу антитела. Используемый в данном документе термин "молекула антитела" относится к белку, например, цепи иммуноглобулина или ее фрагменту, содержащему по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Термин "молекула антитела" включает, например, моноклональное антитело (в том числе полноразмерное антитело, которое имеет Fc-область иммуноглобулина). В одном варианте осуществления молекула антитела содержит полноразмерное антитело или полноразмерную цепь иммуноглобулина. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит антигенсвязывающий или функциональный фрагмент полноразмерного антитела или полноразмерной цепи иммуноглобулина. В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой молекулу моноспецифического антитела и связывает один эпитоп, например, молекулу моноспецифического антитела, содержащую совокупность последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, каждая из которых связывает один и тот же эпитоп.

В одном варианте осуществления молекула антитела представляет собой молекулу мультиспецифического антитела, например, она содержит совокупность последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулина, где первая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из совокупности характеризуется специфичностью связывания для первого эпитопа, и вторая последовательность вариабельного домена иммуноглобулина из совокупности характеризуется специфичностью связывания для второго эпитопа. В одном варианте осуществления первый и второй эпитопы находятся на одном и том же антигене, например, на одном и том же белке (или субъединице мультимерного белка). В одном варианте осуществления молекула мультиспецифического антитела содержит третий, четвертый или пятый вариабельный домен иммуноглобулина. В одном варианте осуществления молекула мультиспецифического антитела представляет собой молекулу биспецифического антитела, молекулу триспецифического антитела или молекулу тетраспецифического антитела.

Инкапсулированные сконструированные клетки могут продуцировать различные типы молекул антител, в том числе цельные иммуноглобулины любого класса, их фрагменты и синтетические белки, содержащие по меньшей мере антигенсвязывающий вариабельный домен антитела. Молекула антитела может представлять собой антитело, например антитело IgG, такое как IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄. Молекула антитела может быть в форме антигенсвязывающего фрагмента, в том числе фрагмента Fab, фрагмента F(ab')2, одноцепочечной вариабельной области и т. п. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными (mAb). Моноклональные антитела могут включать "химерные" антитела, у которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(-ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они специфически связывают целевой антиген и/или проявляют требуемую биологическую активность. В некоторых вариантах осуществления молекула антитела представляет собой однодоменное антитело (например, нанотело). Описанные антитела также могут быть модифицированы с помощью рекомбинантных способов, например, с помощью осуществления делеций, добавлений или замен аминокислот для повышения эффективности антитела в опосредовании требуемой функции. Иллюстративные антитела включают антитело к бета-галактозидазе, антитело к коллагену, антитело к CD14, антитело к CD20, антитело к CD40, антитело к HER2, антитело к IL-1, антитело к IL-4, антитело к IL6, антитело к IL-13, антитело к IL17, антитело к IL18, антитело к IL-23, антитело к IL-28, антитело к IL-29, антитело к IL-33, антитело к EGFR, антитело к VEGF, антитело к CDF, антитело к флагеллину, антитело к IFN-α, антитело к IFN-β, антитело к IFN-γ, антитело к маннозному рецептору, антитело к VEGF, антитело к TLR1, антитело к TLR2, антитело к TLR3, антитело к TLR4, антитело к TLR5, антитело к TLR6, антитело к TLR9, антитело к PDF, антитело к PD1, антитело к PDL-1 или антитело к фактору роста нервов. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело к фактору роста нервов (например, фулранумаб, фасинумаб, танезумаб).

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой цитокин, или цитокиновый рецептор, или химерный белок, включающий цитокины или их рецепторы, в том числе, например, фактор-альфа и -бета некроза опухоли, их рецепторы и их производные, ренин; липопротеины; колхицин; кортикотропин; вазопрессин; соматостатин; липрессин; панкреозимин; леупролид; альфа-1-антитрипсин; атриальный натрийуретический пептид; легочный сурфактант; активатор плазминогена, отличный от активатора плазминогена тканевого типа (t-PA), например, урокиназу; бомбезин; тромбин; энкефалиназу; RANTES (регулируется после активации, в норме экспрессируется и секретируется в Т-клетках); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека; мюллеровскую ингибирующую субстанцию; А-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; хорионический гонадотропин; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКазу; ингибин; активин; рецепторы для гормонов или факторов роста; интегрин; белок А или D; ревматоидные факторы; фактор роста тромбоцитов (PDGF); эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-α и TGF-β, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки CD, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; интерферон, такой как интерферон-альфа (например, интерферон-альфа-2А), -бета, -гамма, -лямбда и консенсусный интерферон; колониестимулирующие факторы (CSF), например M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например IL-1 - IL-10; супероксиддисмутазу; Т-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; фактор распада; транспортные белки; "хоминг"- рецепторы; адрессины; ингибиторы фертильности, такие как простагландины; стимуляторы фертильности; регуляторные белки; антитела (в том числе их фрагменты) и химерные белки, такие как иммуноадгезины; предшественники, производные, пролекарства и аналоги этих соединений и фармацевтически приемлемые соли этих соединений или их предшественники, производные, пролекарства и аналоги. Подходящие белки или пептиды могут быть нативными или рекомбинантными и включать, например, слитые белки.

Примеры полипептида (например, белка), продуцируемого частицей, описанной в данном документе, также включают CCL1, CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5 (RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9 (CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1 (KC), CXCL2 (SDF1a), CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8 (IL8), CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, CX3CL1, XCL1, XCL2, TNFA, TNFB (LTA), TNFC (LTB), TNFSF4, TNFSF5 (CD40LG), TNFSF6, TNFSF7, TNFSF8, TNFSF9, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF13B, EDA, IL2, IL15, IL4, IL13, IL7, IL9, IL21, IL3, IL5, IL6, IL11, IL27, IL30, IL31, OSM, LIF, CNTF, CTF1, IL12a, IL12b, IL23, IL27, IL35, IL14, IL16, IL32, IL34, IL10, IL22, IL19, IL20, IL24, IL26, IL29, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IL28, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA21, IFNB1, IFNK, IFNW1, IFNG, IL1A (IL1F1), IL1B (IL1F2), IL1Ra (IL1F3), IL1F5 (IL36RN), IL1F6 (IL36A), IL1F7 (IL37), IL1F8 (IL36B), IL1F9 (IL36G), IL1F10 (IL38), IL33 (IL1F11), IL18 (IL1G), IL17, KITLG, IL25 (IL17E), CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), SPP1, TGFB1, TGFB2, TGFB3, CCL3L1, CCL3L2, CCL3L3, CCL4L1, CCL4L2, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, AIMP1 (SCYE1), MIF, Areg, BC096441, Bmp1, Bmp10, Bmp15, Bmp2, Bmp3, Bmp4, Bmp5, Bmp6, Bmp7, Bmp8a, Bmp8b, C1qtnf4, Ccl21a, Ccl27a, Cd70, Cer1, Cklf, Clcf1, Cmtm2a, Cmtm2b, Cmtm3, Cmtm4, Cmtm5, Cmtm6, Cmtm7, Cmtm8, Crlf1, Ctf2, Ebi3, Edn1, Fam3b, Fasl, Fgf2, Flt3l, Gdf10, Gdf11, Gdf15, Gdf2, Gdf3, Gdf5, Gdf6, Gdf7, Gdf9, Gm12597, Gm13271, Gm13275, Gm13276, Gm13280, Gm13283, Gm2564, Gpi1, Grem1, Grem2, Grn, Hmgb1, Ifna11, Ifna12, Ifna9, Ifnab, Ifne, Il17a, Il23a, Il25, Il31, Iltifb, Inhba, Lefty1, Lefty2, Mstn, Nampt, Ndp, Nodal, Pf4, Pglyrp1, Prl7d1, Scg2, Scgb3a1, Slurp1, Spp1, Thpo, Tnfsf10, Tnfsf11, Tnfsf12, Tnfsf13, Tnfsf13b, Tnfsf14, Tnfsf15, Tnfsf18, Tnfsf4, Tnfsf8, Tnfsf9, Tslp, Vegfa, Wnt1, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Xcl1, эпинефрин, мелатонин, трийодтиронин, простагландин, лейкотриен, простациклин, тромбоксан, островковый амилоидный полипептид, мюллеров ингибирующий фактор или гормон, адипонектин, кортикотропин, ангиотензин, вазопрессин, аргинин-вазопрессин, атриопептин, натрийуретический пептид головного мозга, кальцитонин, холецистокинин, кортистатин, энкефалин, эндотелин, эритропоэтин, фолликулостимулирующий гормон, галанин, желудочный ингибиторный полипептид, гастрин, грелин, глюкагон, глюкагонподобный пептид 1, гонадотропин-рилизинг гормон, гепсидин, хорионический гонадотропин человека, плацентарный лактоген человека, ингибин, соматомедин, лептин, липотропин, меланоцитстимулирующий гормон, мотилин, орексин, окситоцин, панкреатический полипептид, пептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза, релаксин, ренин, секретин, соматостатин, тромбопоэтин, тиротропин, тиреотропин-рилизинг гормон, вазоактивный кишечный пептид, андроген, альфа-глюкозидазу (также известную как кислая мальтаза), гликогенфосфорилазу, гликоген-деветвящий фермент, фосфофруктокиназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, лактатдегидрогеназу, карнитинпалимитилтрансферазу, карнитин и миоаденилатдеаминазу.

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой средство заместительной терапии или заместительный белок. В некоторых вариантах осуществления средство заместительной терапии или заместительный белок представляют собой фактор свертывания или фактор коагуляции, например, фактор VIII (например, предусматривает аминокислотную последовательность встречающегося в природе фактора VIII человека или ее вариант) или фактор IX (например, предусматривает аминокислотную последовательность встречающегося в природе фактора IX человека или ее вариант).

В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии белка фактора VIII человека, например, рекомбинантного фактора VIII. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный фактор VIII представляет собой рекомбинантный фактор VIII с делецией B-домена (FVIII-BDD). В некоторых вариантах осуществления клетка получена из линии клеток RPE человека и содержит экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность FVIII-BDD, представленную на фиг. 2А (SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии FIX, например, FIX человека дикого типа, такого как показанный на фиг. 2B (SEQ ID NO: 2), или его полиморфного варианта (например, предусматривающего замену аланина на треонин в аминокислотном положении 148 SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления клетка сконструирована для экспрессии варианта с приобретением функции (GIF) белка FIX дикого типа (FIX-GIF), где вариант GIF характеризуется более высокой специфической активностью, чем соответствующий FIX дикого типа. В некоторых вариантах осуществления клетка получена из линии клеток RPE человека и содержит экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 2, за исключением наличия аминокислотной замены на аргинин в положении, соответствующем аминокислотному положению 338 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления заменяющая аминокислота в положении, соответствующем положению 338 аминокислоты в SEQ ID NO: 2, представляет собой аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин, лейцин, лизин или тирозин. В некоторых вариантах осуществления белок FIX, кодируемый клетками, содержащимися в частице, описанной в данном документе, представляет собой белок FIX-padua и содержит SEQ ID NO:36 (фиг.17), состоит по сути из или состоит из нее.

В некоторых вариантах осуществления инкапсулированные клетки получены из линии клеток человека RPE и содержат последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты, которая содержит промоторную последовательность (например, нуклеотиды 337-2069 из SEQ ID NO:26), функционально связанную с кодирующей последовательностью полипептида. В одном варианте осуществления кодирующая последовательность представляет собой кодон-оптимизированную кодирующую последовательность FVIII-BDD, показанную на фиг. 17 (SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17), или кодон-оптимизированную кодирующую последовательность FIX-padua, показанную на фиг. 17 (SEQ ID NO:19, 20 или 21).

В некоторых вариантах осуществления инкапсулированные клетки получены из линии клеток RPE человека и содержат промоторную последовательность (например, под SEQ ID NO:23 или нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO:23), функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 и 36.

В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой двухкомпартментную гидрогелевую капсулу, в которой внутренний компартмент сформирован из полимерного раствора, содержащего от приблизительно 20 миллионов клеток/мл до приблизительно 40 миллионов клеток/мл, где клетки получены из клеточной линии ARPE-19 и содержат нуклеотиды 337-2069 из SEQ ID NO:26, функционально связанные с кодон-оптимизированной кодирующей последовательностью FVIII-BDD, показанной на фиг. 17. В одном варианте осуществления кодирующая последовательность FVIII-BDD представляет собой SEQ ID NO:15.

В некоторых вариантах осуществления средство заместительной терапии или заместительный белок представляет собой фермент, например, альфа-галактозидазу, альфа-L-идуронидазу (IDUA) или N-сульфоглюкозаминсульфогидролазу (SGSH). В некоторых вариантах осуществления средство заместительной терапии или заместительный белок представляет собой фермент, например, альфа-галактозидазу A (например, содержит встречающуюся в природе аминокислотную последовательность альфа-галактозидазы A человека или ее вариант). В некоторых вариантах осуществления средство заместительной терапии или заместительный белок представляет собой цитокин или антитело.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой сахар, например, моносахарид, дисахарид, олигосахарид или полисахарид. В некоторых вариантах осуществления сахар предусматривает триозный, тетрозный, пентозный, гексозный или гептозный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления сахар предусматривает линейный моносахарид или циклизованный моносахарид. В некоторых вариантах осуществления сахар предусматривает глюкозу, галактозу, фруктозу, рамнозу, маннозу, арабинозу, глюкозамин, галактозамин, сиаловую кислоту, маннозамин, глюкуроновую кислоту, галактозуроновую кислоту, маннуроновую кислоту или гулуроновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления сахар присоединен к белку (например, N-связанный гликан или O-связанный гликан). Иллюстративные сахара включают глюкозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, сахарозу, рибозу, ксилозу, сиаловую кислоту, мальтозу, амилозу, инулин, фруктоолигосахарид, галактоолигосахарид, маннан, лектин, пектин, крахмал, целлюлозу, гепарин, гиалуроновую кислоту, хитин, амилопектин или гликоген. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой сахароспирт.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой липид. Липид может быть гидрофобным или амфифильным и может образовывать третичную структуру, такую как липосома, везикула или мембрана, или может быть встроен в липосому, везикулу или мембрану. Липид может предусматривать жирную кислоту, глицеролипид, глицерофосфолипид, стероидный липид, пренольный липид, сфинголипид, сахаролипид, поликетид или сфинголипид. Примеры липидов, продуцируемых инкапсулированными клетками, включают анандамид, докозагексаеновую кислоту, простагландин, лейкотриен, тромбоксан, эйкозаноид, триглицерид, каннабиноид, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, церамид, сфингомиелин, цереброзид, ганглиозид, эстроген, андростерон, тестостерон, холестерин, каротиноид, хинон, гидрохинон или убихинон.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой малую молекулу. Малая молекула может включать природный продукт, продуцируемый клеткой. В некоторых вариантах осуществления малая молекула характеризуется слабой доступностью или не соответствует "правилу пяти" Липински (набор правил, используемых для оценки того, сможет ли малая молекула стать пероральным лекарственным средством для человека; см., например, Lipinski, C.A. et al (2001) Adv Drug Deliv 46:2-36). Иллюстративные природные продукты, являющиеся малыми молекулами, включают антибактериальное лекарственное средство (например, карумонам, даптомицин, фидаксомицин, фосфомицин, испамицин, микрономицина сульфат, миокамицин, мупиоцин, нетилмицина сульфат, тейкопланин, тиенамицин, рифамицин, эритромицин, ванкомицин), противопаразитарное лекарственное средство (например, артемизинин, ивермектин), противораковое лекарственное средство (например, доксорубицин, акларубицин, аминолевулиновая кислота, арглабин, омацетаксина мепесукцинат, паклитаксел, пентостатин, пепломицин, ромидепсин, трабектедин, актиномицин D, блеомицин, хромомицин А, даунорубицин, лейковорин, неокарзиностатин, стрептозоцин, трабектедин, винбластин, винкристин), антидиабетическое лекарственное средство (например, воглибоз), лекарственное средство для центральной нервной системы (например, L-допа, галантамин, зиконтид), статин (например, мевастатин), противогрибковое лекарственное средство (например, фумагиллин, циклоспорин), 1-дезоксиноиримицин и теофиллин, стерины (холестерин, эстроген, тестерон). Дополнительные природные продукты, являющиеся малыми молекулами, описаны в Newman, D.J. and Cragg, M. (2016) J Nat Prod 79:629-661 и Butler, M.S. et al (2014) Nat Prod Rep 31:1612-1661, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылке во всей своей полноте.

В некоторых вариантах осуществления клетки сконструированы для синтеза малой молекулы, отличной от белка или пептида. Например, в одном варианте осуществления сконструированная клетка может продуцировать статин (например, тауростатин, правастатин, флувастатин или аторвастатин).

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой антиген (например, вирусный антиген, бактериальный антиген, грибковый антиген, растительный антиген, антиген окружающей среды или опухолевый антиген). Специалисты в данной области техники признают, что антиген является иммуностимулирующим, т. е. способен стимулировать иммунный ответ или обеспечивать эффективный иммунитет в отношении организма или молекулы, из которой он происходит. Антиген может представлять собой нуклеиновую кислоту, пептид, белок, сахар, липид или их комбинацию.

Частицы, содержащие клетку, могут обеспечивать продуцирование одного терапевтического средства или совокупности терапевтических средств. Терапевтические средства в совокупности могут быть родственными или могут образовывать комплекс. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство секретируется или высвобождается из частицы, содержащей клетку, в виде активной формы. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство секретируется или высвобождается из частицы, содержащей клетку, в виде неактивной формы, например, в качестве пролекарства. В последнем случае терапевтическое средство может активироваться нижележащим средством, таким как фермент.

Способы лечения

В данном документе описаны способы предупреждения или лечения заболевания, нарушения или состояния у субъекта путем введения или имплантации частиц, содержащих первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I) (например, как описано в данном документе), или содержащей их композиции. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, непосредственно или опосредованно уменьшают или облегчают по меньшей мере один симптом заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, предупреждают или замедлению манифестацию заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние поражает определенную систему организма, например нервную систему (например, периферическую нервную систему (PNS) или центральную нервную систему (CNS)), сосудистую систему, скелетную систему, дыхательную систему, эндокринную систему, лимфатическую систему, репродуктивную систему или желудочно-кишечный тракт. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние поражает частью организма, например, кровь, глаз, головной мозг, кожу, легкое, желудок, рот, ухо, ногу, стопу, руку, печень, сердце, почку, кость, поджелудочную железу, селезенку, толстую кишку, тонкую кишку, спинной мозг, мышцу, яичник, матку, влагалище или половой член.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой нейродегенеративное заболевание, диабет, заболевание сердца, аутоиммунное заболевание, рак, заболевание печени, лизосомную болезнь накопления, нарушение свертываемости крови или нарушение коагуляции, ортопедическое состояние, нарушение метаболизма аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой нейродегенеративное заболевание. Иллюстративные нейродегенеративные заболевания включают болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона (PD), боковой амиотрофический склероз (ALS), рассеянный склероз (MS) и церебральный паралич (CP), дентато-рубро-паллидо-люисову атрофию (DRPLA), болезнь нейрональных внутриядреных гиалиновых включений (NIHID), деменцию с тельцами Леви, синдром Дауна, болезнь Галлервордена-Шпатца, прионные заболевания, деменцию с аргирофильными зеренами, кортокобазальную дегенерацию, деменцию боксеров, диффузные нейрофибриллярные сплетения, болезнь Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Ниманна-Пика типа 3, прогрессирующий надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, спиноцеребеллярую атаксию, болезнь Пика и дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой аутоиммунное заболевание, например, склеродермию, рассеянный склероз, волчанку или аллергию.

В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой заболевание печени, например, гепатит B, гепатит C, цирроз печени, NASH.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой рак. Иллюстративные типы рака включают лейкоз, лимфому, меланому, рак легкого, рак головного мозга (например, глиобластому), саркому, рак поджелудочной железы, рак почки, рак печени, рак яичка, рак предстательной железы или рак матки.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой ортопедическое состояние. Иллюстративные ортопедические состояния включают остеопороз, остеонекроз, болезнь Педжета или перелом.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой лизосомную болезнь накопления. Иллюстративные лизосомные болезни накопления включают болезнь Гоше (например, типа I, типа II, типа III), болезнь Тея-Сакса, болезнь Фабри, болезнь Фарбера, синдром Гурлер (также известный как мукополисахаридоз типа I (MPS I)), синдром Хантера, дефицит лизосомальной кислой липазы, болезнь Ниманна-Пика, болезнь Салла, синдром Санфилиппо (также известный как мукополисахаридоз типа IIIA (MPS3A)), множественную сульфатазную недостаточность, синдром Марото-Лами, метахроматическую лейкодистрофию, болезнь Краббе, синдром Шейе, синдром Гурлер-Шейе, синдром Слая, дефицит гиалуронидазы, болезнь Помпе, болезнь Данона, ганглиозидоз или синдром Моркио.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой нарушение свертывания крови или нарушение коагуляции. Иллюстративные нарушения свертывания крови или нарушения коагуляции включают гемофилию (например, гемофилию А или гемофилию В), болезнь Виллебранда, тромбоцитопению, уремию, синдром Бернара-Сулье, дефицит фактора XII, дефицит витамина К или врожденную афибриногенимию.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой нарушение метаболизма аминокислот, например, фенилкетонурию, тирозинемию (например, типа 1 или типа 2), алкаптонурию, гомоцистинурию, гипергомоцистеинемию, болезнь кленового сиропа.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой нарушение метаболизма жирных кислот, например, гиперлипидемию, гиперхолестеринемию, галактоземию.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой нарушение метаболизма пуринов или пиримидинов, например, синдром Леша-Нихена.

В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние представляет собой сахарный диабет (например, сахарный диабет I типа или II типа).

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы идентификации субъекта, имеющего или предположительно имеющего заболевание, нарушение или состояние, описанное в данном документе, и после такой идентификации введение субъекту частиц, содержащих первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I) (например, как описано в данном документе), или композиции, содержащей такие частицы. В одном варианте осуществления субъект представляет собой человека.

Фармацевтические композиции, наборы и введение

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие частицы, описанные в данном документе, а также их наборы.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит частицу, содержащую первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I), а также фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления частицы в фармацевтической композиции содержат клетку (например, человеческую клетку, например, сконструированную человеческую клетку) и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления частицы представлены в фармацевтической композиции в эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой терапевтически эффективное количество. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой профилактически эффективное количество.

Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть получены любым способом, известным в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадии объединения частиц (например, частиц, т. е. "активного ингредиента") с носителем и/или одним или несколькими другими вспомогательными ингредиентами, и затем, если необходимо и/или требуется, придания формы и/или упаковки продукта в требуемый однодозовый или многодозовый контейнер.

Фармацевтические композиции можно получать, упаковывать или реализовывать в нерасфасованном виде, в виде единичной стандартной лекарственной формы и/или в виде совокупности стандартных лекарственных форм. Используемая в данном документе "стандартная лекарственная форма" представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей предварительно заданное количество активного ингредиента (т. е. число частиц). Количество активного ингредиента обычно равно дозе активного ингредиента, которая будет вводиться субъекту, и/или удобной доле такой дозы, такой как, например, половина или одна треть такой дозы.

Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции по настоящему изобретению будут меняться в зависимости от индивидуальных особенностей, размера и/или состояния субъекта, подлежащего лечению, и дополнительно зависят от пути, посредством которого будут вводить композицию. Например, композиция может содержать от 0,1 до 100% (вес/вес) активного ингредиента.

Термин "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество" относится к нетоксичному носителю, адъюванту, разбавителю или наполнителю, который не нарушает фармакологическую активность соединения, с которым оно составлено. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, применимые при изготовлении фармацевтических композиций по настоящему изобретению, представляют собой любые из хорошо известных в области получения фармацевтических составов и включают инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие средства, поверхностно-активные средства и/или эмульгаторы, дезинтегрирующие средства, связующие средства, консерванты, буферные средства, смазывающие средства и/или масла. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, применимые при изготовлении фармацевтических композиций по настоящему изобретению, включают без ограничения ионообменные вещества, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу натрия, полиакрилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Частицы, описанные в данном документе, можно вводить перорально, парентерально (в том числе подкожно, внутримышечно и внутрикожно), местно, ректально, назально, внутрь опухоли, интратекально, буккально, вагинально или с помощью имплантируемого резервуара. В некоторых вариантах осуществления предусмотренные частицы или композиции можно вводить подкожно или посредством имплантата.

В некоторых вариантах осуществления частицы и соответствующие композиции, описанные в данном документе, можно вводить или имплантировать в или на определенную область тела, такую как поверхность слизистой оболочки или полость тела. Иллюстративные места введения или имплантации включают брюшную полость (например, сальниковую сумку), жировую ткань, сердце, глаз, мышцу, селезенку, лимфатический узел, пищевод, нос, пазуху, зубы, десны, язык, рот, горло, тонкую кишку, толстую кишку, щитовидную железу, кость (например, бедро или сустав), молочную железу, хрящ, влагалище, матку, маточную трубу, яичник, половой член, яички, кровеносный сосуд, печень, почку, центральную нервную систему (например, мозг, спинной мозг, нерв) или ухо (например, улитку).

В некоторых вариантах осуществления частицы и соответствующие композиции, описанные в данном документе, вводят или имплантируют в место, отличное от центральной нервной системы, например, головного мозга, спинного мозга, нерва. В некоторых вариантах осуществления частицы и соответствующие композиции, описанные в данном документе, вводят или имплантируют в место, отличное от глаза (например, сетчатки).

Стерильные инъецируемые формы композиций по настоящему изобретению могут представлять собой водную или масляную суспензию. Эти суспензии могут быть составлены в соответствии с методиками, известными в данной области техники, с применением подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств. Стерильный инъекционный препарат также может представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых сред-носителей и растворителей, которые можно использовать, вода, раствор Рингера и изотонический раствор натрия хлорида. Кроме того, стерильные нелетучие масла традиционно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды.

В случае офтальмологического применения предусмотренные фармацевтически приемлемые композиции могут быть составлены в виде микронизированных суспензий или в виде мази, такой как вазелин.

Хотя описания фармацевтических композиций, предусмотренных в данном документе, в первую очередь направлены на фармацевтические композиции, которые подходят для введения человеку, специалисту должно быть понятно, что такие композиции обычно подходят для введения животным всех видов. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения человеку, чтобы получить композиции, подходящие для введения различным животным, хорошо понятна, и обычный опытный ветеринарный фармаколог может разработать и/или выполнить такую модификацию с помощью стандартных экспериментов.

Частицы и соответствующие композиции, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде стандартной дозированной формы, например, единичной стандартной дозированной формы, для простоты введения и однородности дозирования. Однако будет понятно, что решение о суммарной дозе и схемах использования композиций по настоящему изобретению будет принимать лечащий врачом в рамках обоснованного врачебного решения. Конкретный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного субъекта или организма будет зависеть от целого ряда факторов, включая заболевание, подлежащее лечению, и тяжесть нарушения; активность конкретного используемого активного ингредиента; конкретную используемую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион субъекта; время введения, путь введения и скорость экскреции конкретного используемого активного ингредиента; продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретным используемым активным ингредиентом; и аналогичных факторов, хорошо известные в области медицины.

Точное количество средства лечения, требуемое для достижения эффективного количества, будет меняться от субъекта к субъекту в зависимости, например, от видовой принадлежности, возраста и общего состояния субъекта, тяжести побочных эффектов или нарушения, природы конкретной(-ых) частицы(-ц), пути введения и т. п. Требуемую дозу можно доставлять три раза в день, два раза в день, один раз в день, через день, через три дня, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или каждые четыре недели. В определенных вариантах осуществления требуемую дозу можно доставлять с применением нескольких введений (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати или более введений).

Будет понятно, что частицы и соответствующие композиции, описанные в данном документе, можно вводить в комбинации с одним или несколькими дополнительными фармацевтическими средствами. Частицы или композиции можно вводить в комбинации с дополнительными фармацевтическими средствами, которые улучшают их биодоступность, уменьшают и/или модифицируют их метаболизм, ингибируют их экскрецию и/или модифицируют их распределение в пределах организма. Также будет понятно, что используемое средство терапии может достигать требуемого эффекта в случае одного нарушения и/или может достигать разных эффектов.

В настоящем изобретении также предусмотрены наборы (например, фармацевтические упаковки). Наборы по настоящему изобретению могут быть применимы для предупреждения и/или лечения любых заболеваний, нарушений или состояний, описанных в данном документе. Предусмотренные наборы могут содержать описанные в данном документе фармацевтическую композицию или частицу по настоящему изобретению и контейнер (например, флакон, ампулу, бутыль, шприц и/или дозирующую упаковку или другой подходящий контейнер). В некоторых вариантах осуществления предусмотренные наборы могут необязательно дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтическое вспомогательное вещество для разбавления или получения суспензии описанных в данном документе фармацевтической композиции или частицы по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе фармацевтическую композицию или частицу по настоящему изобретению, предоставляемые в контейнере, и второй контейнер объединяют с получением одной стандартной лекарственной формы.

Способы изготовления частиц

В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы изготовления частицы, описанной в данном документе, например, частицы, содержащей первый компартмент, второй компартмент и соединение формулы (I). В некоторых вариантах осуществления, где частица представляет собой гидрогелевую капсулу, способ изготовления частицы включает приведение совокупности капель, содержащих первый и второй полимерные растворы (например, каждый из которых содержит гидрогельобразующий полимер), в контакт с водным раствор для сшивания. Капли могут быть образованы с использованием любой методики, известной в данной области техники.

Каждый компартмент частицы, описанной в данном документе, может содержать немодифицированный полимер, полимер, модифицированный с помощью соединения формулы (I), или их смесь. Вкратце, при осуществлении способа получения частицы, выполненной в виде двухкомпартментной гидрогелевой капсулы, объем первого полимерного раствора (например, содержащего немодифицированный полимер, полимер, модифицированный с помощью соединения формулы (I), или их смесь и необязательно содержащего клетки) загружают в первый шприц, соединенный с внутренним просветом коаксиальной иглы. Затем первый шприц может быть соединен со шприцевым насосом, ориентированным вертикально над сосудом, содержащим водный раствор для сшивания, который содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность. Объем второго полимерного раствора (например, содержащего немодифицированный полимер, полимер, модифицированный с помощью соединения формулы (I), или их смесь и необязательно содержащего клетки) загружают во второй шприц, соединенный с внешним просветом коаксиальной иглы. Затем второй шприц может быть соединен со шприцевым насосом, ориентированным горизонтально по отношению к сосуду, содержащему раствор для сшивания. Затем к верхней и нижней части иглы может быть подключен электрогенератор высокого напряжения. Затем шприцевые насосы и электрогенератор можно применять для экструзии первого и второго полимерных растворов через шприцы с настройками, установленными для обеспечения достижения необходимой скорости образования капель полимерного раствора, вводимых в раствор для сшивания. Специалист в данном области техники может легко определить различные комбинации размеров просвета иглы, диапазона значений напряжения, скорости потока, скорости образования капель и расстояния падения для создания композиций на основе 2-компартментных гидрогелевых капсул, в которых большинство (например, по меньшей мере 80%, 85%, 90% или больше) капсул находятся в пределах 10% от целевого размера и имеют сферическую форму. После истощения первого и второго объемов полимерного раствора каплям можно предоставлять возможность сшивания в растворе для сшивания в течение определенного времени, например, приблизительно пяти минут.

Иллюстративные параметры процедуры получения композиции милликапсул (например, милликапсул диаметром 1,5 мм) включают следующее. Коаксиальная игла размещена над поверхностью раствора для сшивания на расстоянии, достаточном для обеспечения расстояния падения от кончика иглы до поверхности раствора. В одном варианте осуществления расстояние между кончиком иглы и поверхностью раствора составляет от 1 до 5 см. В одном варианте осуществления первый и второй полимерные растворы экструдируются через иглу с общей скоростью потока от 0,05 мл/мин. до 5 мл/мин., или от 0,05 мл/мин. до 2,5 мл/мин., или от 0,05 мл/мин. до приблизительно 1 мл/мин., или от 0,05 мл/мин. до 0,5 мл/мин., или от 0,1 мл/мин. до 0,5 мл/мин. В одном варианте осуществления первый и второй полимерные растворы экструдируются через иглу с общей скоростью потока приблизительно 0,05 мл/мин., 0,1 мл/мин., 0,15 мл/мин., 0,2 мл/мин., 0,25 мл/мин., 0,3 мл/мин., 0,35 мл/мин., 0,4 мл/мин., 0,45 мл/мин. или 0,5 мл/мин. В одном варианте осуществления значения скорости потока первого и второго полимерных растворов через иглу являются по сути одинаковыми. В одном варианте осуществления значения скорости потока первого и второго полимерных растворов через иглу различаются.

В одном варианте осуществления напряжение в приборе составляет от 1 кВ до 20 кВ, или от 1 до 15 кВ, или от 1 кВ до 10 кВ, или от 5 кВ до 10 кВ. Напряжение можно регулировать до тех пор, пока не будет достигнута необходимая скорость образования капель. В одном варианте осуществления скорость образования капель прибором составляет от 1 капли/10 секунд до 50 капель/10 секунд или от 1 капли/10 секунд до 25 капель/10 секунд.

В одном варианте осуществления определяют количество отличных от частиц остатков на поверхности раствора для сшивания. Затем частицы, упавшие на дно емкости для сшивания, могут быть собраны, например, путем переноса раствора для сшивания, содержащего частицы, в отдельный контейнер, оставляя любые отличные от частиц остатки на поверхности раствора в исходном сосуде для сшивания. Затем можно позволить произойти осаждению удаленных частиц, раствор для сшивания можно удалить, и затем можно выполнить промывание частиц один или несколько раз с помощью буфера (например, буфера HEPES). В одном варианте осуществления одну или несколько аликвот полученной содержащей частицы композиции (например, препарата на основе частиц) исследуют под микроскопом для оценки качества композиции, например, количества дефектов частиц и частиц-сателлитов.

В некоторых вариантах осуществления раствор для сшивания дополнительно содержит технологическую добавку (например, гидрофильное неионное поверхностно-активное вещество). Технологическая добавка может приводить к снижению поверхностного натяжения раствора для сшивания. Средства, применимые в качестве технологической добавки в настоящем изобретении, включают поверхностно-активные вещества полисорбатного типа, сополимер полиэтиленоксида (PEO) и полипропиленоксида (PPO), трехблочные сополимеры поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) (PEO-PPO-PEO) и неионные поверхностно-активные вещества, такие как Tween^® 20, Tween^® 80, Triton^TM X-100, IGEPAL® CA-630, полоксамер 188 или полоксамер 407, или поверхностно-активные вещества, характеризующиеся по сути такими же химическими и физическими свойствами, как и приведенные в таблице иллюстративных поверхностно-активных веществ, приведенной непосредственно ниже.

Таблица иллюстративных поверхностно-активных веществ Марка или генерическое название Коммерческий поставщик Примерная средняя
молекулярная масса (г/моль) Гидрофильность,
HLB^a Tween^® 20^b Millipore Sigma 1228 16,7 Tween^® 80^c Millipore Sigma 1310 15 Triton^TM X-100^d Millipore Sigma 625 13,4 IGEPAL^® CA-630^e Millipore Sigma 603 13 Полоксамер 188^f Millipore Sigma 8400 >24 Полоксамер 407^g Millipore Sigma 12,500 18-23

^a Гидрофильно-липофильный баланс

^b Химические названия и синонимы: сорбитанмонолаурат полиэтиленгликоля, сорбитанмонолаурат полиоксиэтилена (20), полисорбат 20, сорбитанмонододеканоат полиоксиэтилена 20

^c Химические названия и синонимы: сорбитанмоноолеат полиэтиленгликоля, сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена (20), полисорбат 80, (x)- -сорбитанмоно-9-октадеценоат поли(окси-1,2-этандиила)

^d Химические названия и синонимы: 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиэтиленгликоль,

t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол, трет-октилфениловый эфир полиэтиленгликоля; октилфенолэтоксилат, конденсат октилфенола и этиленоксида

^e Химические названия и синонимы: октилфеноксиполиэтоксиэтанол, октилфеноксиполи(этиленокси)этанол, разветвленный

^f Химическое название: поли(этиленгликоль)-блок-поли(пропиленгликоль)-блок-поли(этиленгликоль)

^g Химическое название: поли(этиленгликоль)-блок-поли(пропиленгликоль)-блок-поли(этиленгликоль)

В некоторых вариантах осуществления технологическая добавка представляет собой неионное поверхностно-активное вещество. В одном варианте осуществления технологическая добавка содержит более одного поверхностно-активного вещества, например, более одного гидрофильного поверхностно-активного вещества. В некоторых вариантах осуществления технологическая добавка не содержит Tween® 20 (полисорбат 20) или Triton^TM X-100. В одном варианте осуществления технологической добавкой является IGEPAL® CA-630 (сорбитанмоноолеат полиэтиленгликоля). В некоторых вариантах осуществления технологическая добавка представляет собой полоксамер 188.

В некоторых вариантах осуществления технологическая добавка (например, поверхностно-активное вещество) присутствует в растворе для сшивания в концентрации по меньшей мере 0,0001% или больше. В некоторых вариантах осуществления раствор для сшивания содержит по меньшей мере 0,001%, 0,01% или 0,1% технологической добавки. В некоторых вариантах осуществления технологическая добавка присутствует в концентрации, выбранной из концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,01% и от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%. В одном варианте осуществления технологическая добавка представляет собой поверхностно-активное вещество и присутствует в концентрации ниже критической концентрации мицеллообразования для поверхностно-активного вещества.

В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство содержит двухвалентные катионы одного типа или смесь разных типов, например, один или несколько из Ba²⁺, Ca²⁺, Sr²⁺. В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство представляет собой BaCl₂, например, в концентрации от 1 мМ до 100 мМ или от 7,5 мМ до 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство представляет собой CaCl₂, например, в концентрации от 50 мМ до 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство представляет собой SrCl₂, например, в концентрации от 37,5 мМ до 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство представляет собой смесь BaCl₂ (например, от 5 мМ до 20 мМ) и СaCl₂ (например, от 37,5 мМ до 12,5 мМ) или смесь BaCl₂ (например, от 5 мМ до 20 мМ) и SrCl₂ (например, от 37,5 мМ до 12,5 мМ).

В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство представляет собой SrCl₂, а технологическая добавка представляет собой Tween® 80 (или поверхностно-активное вещество с по сути такими же химическими и физическими свойствами, как и приведенные в таблице иллюстративных поверхностно-активных веществ) в концентрации менее 0,1%, например, от приблизительно 0,005% до 0,05%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,01%. В некоторых вариантах осуществления концентрация SrCl₂ составляет приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления сшивающее средство представляет собой SrCl₂, а технологическая добавка представляет собой полоксамер 188 в концентрации 1%.

Тип и концентрацию буфера в водном растворе для сшивания выбирают таким образом, чтобы поддерживать pH раствора на примерно нейтральном уровне, например, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5 или приблизительно 7,0. В одном варианте осуществления буфер совместим с биологическим материалом, который должен быть инкапсулирован в частицу, например, с клетками. В некоторых вариантах осуществления буфер в водном растворе для сшивания предусматривает HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту).

Средство, регулирующее осмолярность, в водном растворе для сшивания выбирают для обеспечения поддержания осмолярности раствора на уровне, аналогичном уровню осмолярности полимерного раствора (который в некоторых вариантах осуществления содержит суспензию клеток), например уровень осмолярности, который имеет более высокое или менее высокое отклонение на величину до 20%, 10% или 5%. В некоторых вариантах осуществления средство, регулирующее осмолярность, представляет собой маннит в концентрации от 0,1 М до 0,3 М.

В некоторых вариантах осуществления раствор для сшивания содержит 25 мМ буфер HEPES, 20 мМ BaCl₂, 0,2 М маннит и 0,01% полоксамера 188.

В некоторых вариантах осуществления раствор для сшивания содержит 50 мМ гексагидрат хлорида стронция, 0,165 М маннит, 25 мМ HEPES и 0,01% поверхностно-активного вещества с по сути такими же химическими и физическими свойствами, как и приведенные в таблице иллюстративных поверхностно-активных веществ для Tween 80.

В одном варианте осуществления технологическая добавка представляет собой полоксамер 188, который присутствует в содержащей частицы композиции (например, препарате на основе частиц) в поддающемся обнаружению количестве после стадий промывки. Полоксамер 188 может быть обнаружен с помощью любой методики, известной в данной области техники, например, с помощью частичного или полного растворения частиц в аликвоте композиции путем осаждения сульфатом натрия и анализа супернатанта с помощью LC/MS.

Снижение поверхностного натяжения раствора для сшивания можно оценить с помощью любого способа, известного в данной области техники, например, с помощью гониометра контактного угла или тензиометра, например, с помощью метода кольца Дю Нуи (см., например, Davarci et al (2017) Food Hydrocolloids 62:119-127).

Пронумерованные иллюстративные варианты осуществления

1. Частица, содержащая:

a) первый компартмент;

b) второй компартмент и

c) соединение формулы (I-a):

(I-a),

или его фармацевтически приемлемую соль, где

А представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, -O-, -C(O)O-, -C(O)-, -OC(O)-, -N(R^C)-, -N(R^C)C(O)-, -C(O)N(R^C)-, -N(R^C)N(R^D)-, -NCN-, -N(R^C)C(O)(C₁-C₆-алкилен)-, -N(R^C)C(O)(C₂-C₆-алкенилен)-, -C(=N(R^C)(R^D))O-, -S-, -S(O)_x-, -OS(O)_x-, -N(R^C)S(O)_x-, -S(O)_xN(R^C)-, -P(R^F)_y-, -Si(OR^A)₂-, -Si(R^G)(OR^A)-, -B(OR^A)- или металл, каждый из которых необязательно связан с группой присоединения (например, группой присоединения, описанной в данном документе) и необязательно замещен одним или несколькими R¹;

каждый из L¹ и L³ независимо представляет собой связь, алкил или гетероалкил, где каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен одним или несколькими R²;

L² представляет собой связь;

М отсутствует или представляет собой алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R³;

P представляет собой гетероарил, необязательно замещенный одним или несколькими R⁴;

Z представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R⁵;

каждый R^A, R^B, R^C, R^D, R^E, R^F и R^G независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, азидо, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

или R^C и R^D, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо (например, 5-7-членное кольцо), необязательно замещенное одним или несколькими R⁶;

каждый R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, азидо, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1,-OC(O)R^B1, -N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^B1, -C(O)N(R^C1), SR^E1, S(O)_xR^E1, -OS(O)_xR^E1, -N(R^C1)S(O)_xR^E1, - S(O)_xN(R^C1)(R^D1), -P(R^F1)_y, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R^A1, R^B1, R^C1, R^D1, R^E1 и R^F1 независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R⁷ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, оксо, гидроксил, циклоалкил или гетероциклил;

х составляет 1 или 2; и

y составляет 2, 3 или 4.

2. Частица по варианту осуществления 1, где первый компартмент окружен вторым компартментом.

3. Частица по любому из вариантов осуществления 1-2, где первый компартмент размещен во втором компартменте.

4. Частица по любому из вариантов осуществления 1-3, где второй компартмент образует барьер вокруг первого компартмента.

5. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где общий объем второго компартмента больше, например, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз, чем объем первого компартмента.

6. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где дифференциальный объем второго компартмента больше, например, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз, чем объем первого компартмента.

7. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где общий объем второго компартмента на приблизительно 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% больше, чем объем первого компартмента.

8. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где дифференциальный объем второго компартмента на приблизительно 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% больше, чем объем первого компартмента.

9. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где дифференциальный объем второго компартмента меньше, например, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз, чем объем первого компартмента.

10. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где общий объем второго компартмента на приблизительно 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% меньше, чем объем первого компартмента.

11. Частица по любому из вариантов осуществления 1-4, где дифференциальный объем второго компартмента на приблизительно 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% меньше, чем объем первого компартмента.

12. Частица по варианту осуществления 1, характеризующаяся свойством, выбранным из следующего:

а) первый компартмент содержит соединение формулы (I-a);

b) второй компартмент содержит соединение формулы (I-a);

с) соединение формулы (I-а) размещено на наружной поверхности частицы и/или

d) частица содержит границу раздела между первым и вторым компартментами, а соединение формулы (I-a) размещено на границе раздела.

13. Частица по варианту осуществления 12, характеризующаяся свойством а.

14. Частица по любому из вариантов осуществления 12-13, характеризующаяся свойством b.

15. Частица по любому из вариантов осуществления 12-14, характеризующаяся свойством с.

16. Частица по любому из вариантов осуществления 12-15, характеризующаяся свойством d.

17. Частица по варианту осуществления 1, где первый компартмент или второй компартмент по сути не содержит соединения формулы (I-a).

18. Частица по варианту осуществления 1, где внешняя поверхность частицы по сути не содержит соединения формулы (I-a).

19. Частица по варианту осуществления 1, характеризующаяся свойством, выбранным из следующего:

а) первый компартмент по сути не содержит соединения формулы (I-a);

b) второй компартмент по сути не содержит соединения формулы (I-a);

с) внешняя поверхность частицы по сути не содержит соединения формулы (I-a); или

d) частица содержит границу раздела между первым и вторым компартментами, и граница раздела по сути не содержит соединения формулы (I-a).

20. Частица по варианту осуществления 19, характеризующаяся свойством а.

21. Частица по любому из вариантов осуществления 19-20, характеризующаяся свойством b.

22. Частица по любому из вариантов осуществления 19-21, характеризующаяся свойством с.

23. Частица по любому из вариантов осуществления 19-22, характеризующаяся свойством d.

24. Частица по варианту осуществления 19, характеризующаяся свойствами а и b.

25. Частица по любому из вариантов осуществления 1-24, где частица характеризуется наибольшим линейным размером (LLD), например диаметром, составляющим от 20 нанометров до 10 миллиметров.

26. Частица по любому из вариантов осуществления 1-25, где частица характеризуется наибольшим линейным размером (LLD), например диаметром, составляющим от 500 нанометров до 10 миллиметров.

27. Частица по любому из вариантов осуществления 1-26, где частица характеризуется наибольшим линейным размером (LLD), например диаметром, составляющим от 1 миллиметра до 5 миллиметров, например, от 1 миллиметра до 4 миллиметров, от 1 миллиметра до 3 миллиметров, от 1 миллиметра до 2 миллиметров, от приблизительно 1,5 миллиметра до 2 миллиметров или приблизительно 1,5 миллиметра.

28. Частица по любому из вариантов осуществления 1-27, где частица выполнена в виде гидрогелевой капсулы, при этом первый компартмент окружен вторым компартментом.

29. Частица по варианту осуществления 28, где толщина второго компартмента выбрана из группы, состоящей из:

(а) 1 нанометра и 1 миллиметра;

(b) 100 нанометров и 1 миллиметра и

(c) 500 нанометров и 500 микрометров.

30. Частица по варианту осуществления 29, где толщина второго компартмента составляет по меньшей мере приблизительно 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% диаметра частицы.

31. Частица по любому из вариантов осуществления 1-30, где частица содержит клетку.

32. Частица по любому из вариантов осуществления 1-31, где первый компартмент содержит клетку.

33. Частица по любому из вариантов осуществления 1-32, где второй компартмент содержит клетку.

34. Частица по любому из вариантов осуществления 1-33, где первый компартмент содержит клетку, а второй компартмент не содержит клетку.

35. Частица по любому из вариантов осуществления 1-34, где первый компартмент содержит клетку, и второй компартмент содержит клетку.

36. Частица по варианту осуществления 35, где первый компартмент и второй компартмент содержат клетку одного и того же типа.

37. Частица по варианту осуществления 35, где клетка в первом компартменте представляет собой клетку, относящуюся к типу, отличающемуся от типа, к которому относится клетка во втором компартменте.

38. Частица по любому из вариантов осуществления 31-36, где частица содержит границу раздела между первым компартментом и вторым компартментом, а клетка размещена на границе раздела, например, клетка контактирует как с первым, так и со вторым компартментами.

39. Частица по любому из вариантов осуществления 31-37, где количество или плотность клеток во втором компартменте меньше количества или плотности клеток в первом компартменте.

40. Частица по любому из вариантов осуществления 31-39, где первый компартмент сформирован из полимерного раствора, содержащего по меньшей мере 0,5 × 10⁶, 1 × 10⁶, 5 × 10⁶, 10 × 10⁶, 15 × 10⁶ или 20 × 10⁶ клеток на мл.

41. Частица по любому из вариантов осуществления 31-40, где первый компартмент сформирован из полимерного раствора, содержащего по меньшей мере 0,5 × 10⁶, 1 × 10⁶, 5 × 10⁶, 10 × 10⁶, 15 × 10⁶, 20 × 10⁶ или 25 × 10⁶ клеток на мл, или из полимерного раствора, содержащего от 100 до 300 миллионов клеток на мл.

42. Частица по любому из вариантов осуществления 31-41, где частица содержит по меньшей мере 100; 250; 500; 750; 1000; 2500; 5000; 10000; 25000 или 50000 клеток.

43. Частица по любому из вариантов осуществления 31-42, где первый компартмент содержит по меньшей мере 100; 250; 500; 750; 1000; 2500; 5000; 10000; 25000 или 50000 клеток.

44. Частица по любому из вариантов осуществления 31-43, где клетки присутствуют в виде отдельных клеток, одного или нескольких сфероидов или связаны с одним или несколькими микроносителями.

45. Частица по любому из вариантов осуществления 31-44, где наружная поверхность частицы по сути не содержит клеток.

46. Частица по любому из вариантов осуществления 31-45, где:

а) одна или совокупность клеток размещены в первом компартменте;

b) число или плотность клеток во втором компартменте в по меньшей мере 2, 5, 10, 10², 10³ или 10⁴ раз меньше, чем число или плотность клеток в первом компартменте;

c) первый компартмент (например, внешняя граница первого компартмента) содержит соединение формулы (I-a); или

d) второй компартмент (например, внешняя граница второго компартмента) содержит соединение формулы (I-a).

47. Частица по варианту осуществления 46, характеризующаяся свойством а.

48. Частица по любому из вариантов осуществления 46-47, характеризующаяся свойством b.

49. Частица по любому из вариантов осуществления 46-48, характеризующаяся свойством с.

50. Частица по любому из вариантов осуществления 46-49, характеризующаяся свойством d.

51. Частица по варианту осуществления 50, характеризующаяся свойствами а и b.

52. Частица по варианту осуществления 50, характеризующаяся свойствами а, b и с.

53. Частица по варианту осуществления 50, характеризующаяся свойствами а, b и d.

54. Частица по варианту осуществления 50, характеризующаяся свойствами а, b, c и d.

55. Частица по любому из вариантов осуществления 31-54, где второй компартмент по сути не содержит клеток.

56. Частица по любому из вариантов осуществления 31-55, где клетка представляет собой эпителиальную клетку, эндотелиальную клетку, фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или кератиноцит.

57. Частица по любому из вариантов осуществления 31-56, где клетка представляет собой клетку RPE (например, ARPE-19) или MSC.

58. Частица по любому из вариантов осуществления 31-56, где клетка представляет собой островковую клетку.

59. Частица по любому из вариантов осуществления 31-58, где клетка экспрессирует терапевтическое средство (например, полипептид).

60. Частица по варианту осуществления 59, где полипептид представляет собой белок фактора VIII или его вариант или белок фактора IX или его вариант.

61. Частица по любому из вариантов осуществления 59-60, где полипептид содержит SEQ ID NO:1 или ее вариант.

62. Частица по любому из вариантов осуществления 59-60, где полипептид содержит SEQ ID NO: 2 или ее вариант, например, предусматривающий замену аланина на треонин в аминокислотном положении 148 SEQ ID NO:2 или замену лейцина на аргинин в аминокислотном положении 338 SEQ ID NO:2.

63. Частица по варианту осуществления 59, где полипептид представляет собой инсулин (например, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина или проинсулин).

64. Частица по любому из вариантов осуществления 1-63, где частица содержит полимер.

65. Частица по варианту осуществления 64, где полимер представляет собой полисахарид.

66. Частица по любому из вариантов осуществления 64-65, где полимер выбран из альгината, хитозана, гиалуроната, желатина, поли(L-молочной кислоты) (PLLA) или сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA).

67. Частица по любому из вариантов осуществления 64-66, где первый компартмент содержит полимер (например, полисахарид, например, альгинат).

68. Частица по любому из вариантов осуществления 64-67, где второй компартмент содержит полимер (например, полисахарид, например, альгинат).

69. Частица по любому из вариантов осуществления 64-68, где как первый компартмент, так и второй компартмент содержат полимер (например, полисахарид, например, альгинат).

70. Частица по любому из вариантов осуществления 64-69, где первый компартмент и второй компартмент содержат одинаковый полимер.

71. Частица по любому из вариантов осуществления 64-70, где первый компартмент и второй компартмент содержат различающийся полимер.

72. Частица по любому из вариантов осуществления 64-71, где первый компартмент не содержит альгинат, а второй компартмент содержит альгинат.

73. Частица по любому из вариантов осуществления 64-72, где первый компартмент содержит альгинат, а второй компартмент содержит полимер, отличный от альгината.

74. Частица по любому из вариантов осуществления 64-73, где второй компартмент содержит альгинат, а первый компартмент содержит полимер, отличный от альгината.

75. Частица по варианту осуществления 74, где первый компартмент содержит гиалуронат или хондроитин, а второй компартмент содержит альгинат.

76. Частица по любому из вариантов осуществления 73-75, где полимер первого компартмента модифицирован с помощью соединения формулы (I-a).

77. Частица по любому из вариантов осуществления 73-76, где полимер второго компартмента модифицирован с помощью соединения формулы (I-a).

78. Частица по любому из вариантов осуществления 1-77, где наружная поверхность частицы и внутренняя часть второго компартмента содержат соединение формулы (I-a).

79. Частица по любому из вариантов осуществления 64-78, где полимеры как первого компартмента, так и второго компартмента модифицированы с помощью соединения формулы (I-a).

80. Частица по любому из вариантов осуществления 1-79, где соединение формулы (I-a) представляет собой соединение любой из формул (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (II), (II-a), (III), (III-a), (III-b), (III-c) или (III-d) или их фармацевтически приемлемую соль.

81. Частица по любому из вариантов осуществления 76-80, где соединение формулы (I-a) выбрано из соединения 110, соединения 112, соединения 113 или соединения 114, представленных в таблице 2.

82. Частица по любому из вариантов осуществления 76-80, где соединение формулы (I-а) представляет собой соединение 112, представленное в таблице 2.

83. Частица по любому из вариантов осуществления 76-80, где соединение формулы (I-а) представляет собой соединение 113, представленное в таблице 2.

84. Частица по любому из вариантов осуществления 76-80, где соединение формулы (I-а) представляет собой соединение 114, представленное в таблице 2.

85. Частица по любому из вариантов осуществления 76-80, где соединение формулы (I-а) не представляет собой соединение 100, представленное в таблице 2.

86. Частица по любому из вариантов осуществления 76-80, где соединение формулы (I-а) представляет собой соединение 101, представленное в таблице 2.

87. Частица по любому из вариантов осуществления 76-86, где по меньшей мере 0,5% мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I-а) (например, по меньшей мере 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или более мономеров полимера модифицированы с помощью соединения формулы (I-а)).

88. Частица по любому из вариантов осуществления 76-86, где по меньшей мере 0,5% мономеров полимера в первом (внутреннем) компартменте частицы модифицированы с помощью соединения формулы (I-а) (например, по меньшей мере 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или более мономеров полимера в первом (внутреннем) компартменте частицы модифицированы с помощью соединения формулы (I-а)).

89. Частица по любому из вариантов осуществления 76-86, где по меньшей мере 0,5% мономеров полимера во втором (внешнем) компартменте частицы модифицированы с помощью соединения формулы (I-а) (например, по меньшей мере 1%, 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или более мономеров полимера во втором (внешнем) компартменте частицы модифицированы с помощью соединения формулы (I-а)).

90. Частица по любому из вариантов осуществления 76-86, где полимер (при модификации с помощью соединения формулы (Ia)) характеризуется повышением % N (по сравнению с немодифицированным полимером) на величину от 0,1% до 10% N по весу (например, от 0,1% до 2% N, от 2% до 4% или от 4% до 8% N по весу), где % N определяется с помощью анализа сжиганием и соответствует количеству соединения формулы (I-a) в модифицированном полимере.

91. Частица по любому из вариантов осуществления 76-86, где первый (внутренний) компартмент частицы содержит полимер (при модификации с помощью соединения формулы (Ia)), который характеризуется повышением % N (по сравнению с немодифицированным полимером) на величину от 0,1% до 10% N по весу (например, от 0,1% до 2% N, от 2% до 4% или от 4% до 8% N по весу), где % N определяется с помощью анализа сжиганием и соответствует количеству соединения формулы (I-a) в модифицированном полимере.

92. Частица по любому из вариантов осуществления 76-84, где второй (внешний) компартмент частицы содержит полимер (при модификации с помощью соединения формулы (Ia)), который характеризуется повышением % N (по сравнению с немодифицированным полимером) на величину от 0,1% до 10% N по весу (например, от 0,1% до 2% N, от 2% до 4% или от 4% до 8% N по весу), где % N определяется с помощью анализа сжиганием и соответствует количеству соединения формулы (I-a) в модифицированном полимере.

93. Частица по любому из вариантов осуществления 76-84, где частица представляет собой гидрогелевую капсулу, а второй (внешний) компартмент капсулы сформирован с использованием смеси немодифицированного альгината и альгината, модифицированного с помощью соединения формулы (Ia) (например, соединения 101) при плотности конъюгирования, составляющей по меньшей мере 2,0% и менее 9,0% азота (N), как определено с помощью анализа сжиганием для измерения процентного содержания азота, как описано в примерах ниже в данном документе, или составляющей от 3,0% до 8,0%, от 4,0% до 7,0%, от 5,0% до 7,0%, или от 6,0% до 7,0%, или приблизительно 6,8%.

94. Частица по любому из вариантов осуществления 1-93, где частица представляет собой сферическую частицу.

95. Частица по любому из вариантов осуществления 1-94, где частица изготовлена с помощью​способа, в котором второй компартмент формируют вокруг первого компартмента.

96. Частица по любому из вариантов осуществления 1-95, полученная с помощью способа, предусматривающего приведение совокупности капель полимерного раствора в контакт с водным раствором для сшивания в течение периода времени, достаточного для получения частицы, где раствор для сшивания содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность.

97. Частица по варианту осуществления 96, где раствор для сшивания дополнительно содержит технологическую добавку.

98. Частица по варианту осуществления 97, где технологическая добавка представляет собой поверхностно-активное вещество.

99. Частица по варианту осуществления 98, где поверхностно-активное вещество выбрано из поверхностно-активного вещества полисорбатного типа, сополимера полиэтиленоксида (PEO) и полипропиленоксида (PPO), трехблочного сополимера поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) (PEO-PPO-PEO), полисорбата 20, полисорбата 80, 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиэтиленгликоля, октилфеноксиполиэтоксиэтанола, полоксамера 188 и полоксамера 407.

100. Частица по любому из вариантов осуществления 98-99, где поверхностно-активное вещество характеризуется показателем гидрофильно-липофильного баланса (HLB), составляющим по меньшей мере 18 или по меньшей мере 24, и при этом необязательно поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер 188.

101. Частица по любому из вариантов осуществления 97-99, где технологическая добавка присутствует в растворе для сшивания в концентрации от по меньшей мере приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,05%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,01% или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%.

102. Частица по любому из вариантов осуществления 96-101, где сшивающее средство содержит двухвалентные катионы одного типа или смесь разных типов, при этом необязательно сшивающее средство содержит один или несколько из Ba²⁺, Ca²⁺ и Sr²⁺.

103. Частица по любому из вариантов осуществления 96-102, где сшивающее средство выбрано из группы, состоящей из:

a. BaCl₂ в концентрации от 1 мM до 100 мM или от 7,5 мM до 20 мM;

b. CaCl₂ в концентрации от 50 мM до 100 мM;

c. SrCl₂ в концентрации от 37,5 мM до 100 мM;

d. смеси BaCl₂ в концентрации от 5 мM до 20 мM и CaCl₂ в концентрации от 37,5 мM до 12,5 мM и

e. смеси BaCl₂ в концентрации от 5 мM до 20 мM и SrCl₂ в концентрации от 37,5 мM до 12,5 мM.

104. Частица по любому из вариантов осуществления 96-103, где буфер содержит 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту) (HEPES).

105. Частица по любому из вариантов осуществления 96-104, где средство, регулирующее осмолярность, содержит маннит в концентрации от 0,1 М до 0,3 М.

106. Частица по любому из вариантов осуществления 96-105, где сшивающее средство не представляет собой SrCl₂.

107. Частица по любому из вариантов осуществления 96-106, где сшивающее средство не представляет собой ВаCl₂.

108. Частица по любому из вариантов осуществления 96-107, где раствор для сшивания содержит 25 мМ буфер HEPES, 20 мМ BaCl₂, 0,2 М маннит и 0,01% полоксамера 188.

109. Частица по любому из вариантов осуществления 96-108, где сшивающее средство представляет собой SrCl₂, а технологическая добавка представляет собой поверхностно-активное вещество в концентрации приблизительно 0,01%, при этом поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.

110. Частица по варианту осуществления 109, где раствор для сшивания содержит 50 мМ гексагидрат хлорида стронция, 0,165 М маннит, 25 мМ HEPES и 0,01% полисорбата 80.

111. Частица по любому из вариантов осуществления 1-110, где частица представляет собой гидрогелевую милликапсулу, содержащую гидрогельобразующий полимер в каждом из первого и второго компартментов.

112. Частица по варианту осуществления 111, где единственный гидрогельобразующий полимер в первом компартменте представляет собой высокомолекулярный альгинат, а гидрогельобразующий полимер во втором компартменте представляет собой смесь химически модифицированного низкомолекулярного альгината и немодифицированного высокомолекулярного альгината.

113. Препарат на основе совокупности частиц, где совокупность предусматривает частицу по любому из вариантов осуществления 1-112.

114. Препарат по варианту осуществления 113, где по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или больше частиц в совокупности частиц представляют собой сферические частицы, и при этом необязательно препарат содержит поддающееся определению количество технологической добавки.

115. Препарат по вариантам осуществления 113-114, где препарат представляет собой фармацевтически приемлемый препарат.

116. Способ изготовления частицы, описанной в данном документе, например, частицы по любому из вариантов осуществления 1-115.

117. Способ по варианту осуществления 116, предусматривающий формирование первого компартмента до формирования второго компартмента.

118. Способ по варианту осуществления 117, предусматривающий формирование первого компартмента одновременно с формированием второго компартмента.

119. Способ по любому из вариантов осуществления 116-118, предусматривающий приведение совокупности капель первого и второго полимерных растворов в контакт с водным раствор для сшивания в течение периода времени, достаточного для получения гидрогелевой капсулы с первым и вторым компартментами, где раствор для сшивания содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность.

120. Способ по любому из вариантов осуществления 116-119, где способ предусматривает применение коаксиальной иглы.

121. Способ по любому из вариантов осуществления 116-120, где первый полимерный раствор содержит клетки.

122. Способ имплантации частицы в организм субъекта, включающий

получение частицы, описанной в данном документе, например, в любом из вариантов осуществления 1-112; и

размещение частицы в теле субъекта.

123. Способ предоставления вещества, например, терапевтического вещества, например, полипептида, субъекту, включающий

получение частицы, описанной в данном документе, например, в любом из вариантов осуществления 1-112; которая содержит вещество или обладает способностью к его продуцированию; и

размещение частицы в теле субъекта.

124. Способ оценки частицы, например, в организме субъекта, включающий

получение частицы, описанной в данном документе, например, в любом из вариантов осуществления 1-112; и

размещение частицы в теле субъекта.

125. Способ лечения субъекта, нуждающегося в веществе, например, полипептиде, необходимом для субъекта, включающий

получение частицы, описанной в данном документе, например, в любом из вариантов осуществления 1-112; которая содержит вещество или обладает способностью к его продуцированию; и

размещение частицы в теле субъекта.

126. Композиция на основе частиц для применения в лечении субъекта, нуждающегося в веществе, например, полипептиде, необходимом для субъекта, которое предусматривает

получение частицы, описанной в данном документе, например, в любом из вариантов осуществления 1-112; которая содержит вещество или обладает способностью к его продуцированию; и

размещение частицы в теле субъекта.

Примеры

Для более полного понимания настоящего изобретения, описанного в данном документе, изложены следующие примеры. Примеры, описанные в настоящей заявке, предоставлены, чтобы проиллюстрировать частицы, химические модификации, композиции и способы, предусмотренные в данном документе, и никоим образом не должны быть истолкованы как ограничивающие их объем.

Пример 1. Синтез иллюстративных соединений для получения химически модифицированных имплантируемых элементов

Общие протоколы

В приведенных ниже процедурах описаны способы получения иллюстративных соединений для получения химически модифицированных имплантируемых элементов. Соединения, предусмотренные в данном документе, можно получать из легкодоступных исходных материалов с применением модификаций конкретных протоколов синтеза, изложенных ниже, которые будут хорошо известны специалистам в данной области техники. Будет понятно, что в случаях, когда приведены типичные или предпочтительные условия процесса (т. е. значения температуры реакции, значения времени, значения мольного соотношения реагентов, растворителей, значения давления и т. д.), можно также применять другие условия процесса, если не указано иное. Оптимальные условия реакции могут меняться в зависимости от конкретных применяемых реагентов или растворителей, но такие условия могут быть определены специалистом в данной области техники с помощью традиционных процедур оптимизации.

Кроме того, как будет очевидно специалистам в данной области техники, традиционные защитные группы могут понадобиться, чтобы предотвратить нежелательные реакции у определенных функциональных групп. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также подходящие условия для введения защитных групп и удаления защитных групп широко известны из уровня техники. Например, многочисленные защитные группы, а также их введение и удаление описаны в Greene et al., Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991 и в цитируемых там ссылках.

Циклоприсоединение Хьюсгена для получения 1,4-замещенных триазолов

Катализируемое медью циклоприсоединение Хьюсгена [3+2] применяли для получения соединений на основе триазола и их композиций, устройств и материалов. Область применения и типичные протоколы были предметом многих обзоров (например, Meldal, M. and Tornoe, C. W. Chem. Rev. (2008) 108:2952-3015; Hein, J. E. and Fokin, V. V. Chem. Soc. Rev. (2010) 39(4):1302-1315; оба из которых включены в данный документ посредством ссылки).

В примере, показанном выше, азид представляет собой реакционноспособную группу во фрагменте, содержащем соединительный элемент A, тогда как алкин представляет собой реакционноспособный компонент боковой группы Z. Как показано ниже, эти функциональные группы можно менять местами для получения структурно родственного триазольного продукта. Получение этих альтернатив является аналогичным и не требует отдельного рассмотрения.

Типичная процедура циклоприсоединения Хьюсгена, начиная с йодида, кратко изложена ниже. В некоторых случаях йодиды преобразуют в азиды во время протекания реакции для безопасности.

Раствор азида натрия (1,1 экв.), аскорбата натрия (0,1 экв.), транс-N, N'-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,25 экв.), йодида меди(I) в метаноле (1,0 М, лимитирующий реагент) дегазировали с помощью барботирования азотом и обрабатывали ацетиленом (1 экв.) и арилйодидом (1,2 экв.). Данную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем нагревали до 55^oC в течение 16 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через воронку и осадок на фильтре промывали метанолом. Объединенные фильтраты концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (120 г диоксида кремния, градиент от 0 до 40% (3% водный гидроксид аммония, 22% метанол, остальная часть - дихлорметан) в дихлорметане с получением требуемого целевого материала.

Типичная процедура циклоприсоединения Хьюсгена, начиная с азида, кратко изложена ниже.

Раствор трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина (0,2 экв.), триэтиламина (0,5 экв.), йодида меди(I) (0,06 экв.) в метаноле (0,4 М, лимитирующий реагент) обрабатывали ацетиленом (1,0 экв.) и охлаждали до 0^oC. Обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры в течение 30 минут, затем нагревали до 55^oC в течение 16 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, концентрировали и очищали с помощью HPLC (колонка C18, градиент от 0 до 100% (3% водный гидроксида аммония, 22% метанол, остальная часть - дихлорметан) в дихлорметане с получением требуемого целевого материала.

Циклоприсоединение Хьюсгена для получения 1,5-замещенных триазолов

Циклоприсоединение Хьюсгена [3+2] также осуществляли с помощью рутениевых катализаторов для получения преимущественно 1,5-дизамещенных продуктов (например, как описано в Zhang et al, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 15998-15999; Boren et al, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 8923-8930, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

Как описано ранее, азидные и алкиновые группы можно менять местами для образования триазолов, аналогичных тем, которые изображены ниже.

Типичная процедура описана следующим образом: раствор алкина (1 экв.) и азида (1 экв.) в диоксане (0,8 М) добавляли по каплям в раствор пентаметилциклопентадиенилбис(трифенилфосфин)рутения(II) хлорида (0,02 экв.) в диоксане (0,16 М). Колбу продували азотом, герметизировали и смесь нагревали до 60^oC в течение 12 ч. Полученную смесь концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле с получением необходимого соединения.

Экспериментальная процедура для (4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (3)

Смесь (4-йодофенил)метанамина (1, 843 мг, 3,62 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (74 мкл, 0,47 ммоль, 0,13 экв.), аскорбата натрия (72 мг, 0,36 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (69 мг, 0,36 ммоль, 0,1 экв.), азида натрия (470 мг, 7,24 ммоль, 2,0 экв.) и 1-метил-4-(проп-2-ин-1-ил)пиперазина (2, 0,5 г, 3,62 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (9 мл) и воде (1 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, концентрировали при пониженном давлении и коричневатую взвесь экстрагировали с помощью дихлорметана. К объединенным дихлорметановым фазам добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония), в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 7,5% с получением (4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (3, 0,45 г, 43%). LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₅H₂₂N₆ 287,2; Найденное значение 287,1.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (4)

Раствор (4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (3, 1,2 г, 4,19 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,70 мл, 5,03 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (50 мл) охлаждали до 0°C с помощью ледяной бани и добавляли метакрилоилхлорид (0,43 мл, 4,40 ммоль, 1,05 экв. в 5 мл CH₂Cl₂). Реакционную смесь перемешивали в течение дня при охлаждении с помощью ледяной бани. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 7,5%. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученное твердое вещество растирали с диэтиловым эфиром, фильтровали и промывали несколько раз диэтиловым эфиром с получением N-(4-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (4, 0,41 г, выход 28%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₉H₂₆N₆O 355,2; Найденное значение 355,2.

Экспериментальная процедура для (4-(4-((2-(2-метоксиэтокси)этокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (6)

Смесь (4-йодофенил)метанамина (1, 2,95 г, 12,64 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (259 мкл, 1,64 ммоль, 0,13 экв.), аскорбата натрия (250 мг, 1,26 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (241 мг, 1,26 ммоль, 0,1 экв.), азида натрия (1,64 г, 25,29 ммоль, 2,0 экв.) и 3-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)проп-1-ина (5, 2,0 г, 12,64 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (40 мл) и воде (4 мл) продували азотом в течение 5 минут и затем нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в дихлорметане, фильтровали и концентрировали с помощью Celite® (10 г). Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве элюента. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 6,25% с получением (4-(4-((2-(2-метоксиэтокси)этокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (6, 1,37 г, 35%). LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₅H₂₂N₄O₃ 307,2; Найденное значение 307,0.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-((2-(2-метоксиэтокси)этокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (7)

Раствор 4-(4-((2-(2-метоксиэтокси)этокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (6, 1,69 г, 5,52 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,92 мл, 6,62 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (50 мл) охлаждали до 0°C с помощью ледяной бани и добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,57 мл, 5,79 ммоль, 1,05 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 1,25% с получением N-(4-(4-((2-(2-метоксиэтокси)этокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (7, 1,76 г, выход 85%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₉H₂₆N₄O₄ 375,2; Найденное значение 375,0.

Экспериментальная процедура для 3-(проп-2-ин-1-илокси)оксетана (9)

Суспензию гидрида натрия (27,0 г, 675 ммоль, чистота 60%) в THF (200 мл) охлаждали с помощью ледяной бани. Оксетан-3-ол (8, 25 г, 337 ммоль) добавляли по каплям и перемешивали в течение 30 минут при 0°C. Затем добавляли по каплям 3-бромпроп-1-ин (9, 41,2 мл, 371 ммоль, чистота 80%). Смесь перемешивали на протяжении ночи, при этом обеспечивали ее нагревание до комнатной температуры. Смесь фильтровали через целит, промывали с помощью THF и концентрировали с помощью целита при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) и элюировали с помощью гексанов/EtOAc. Концентрацию EtOAc в подвижной фазе увеличивали от 0 до 25% с получением желтого масла (9, 18,25 г, 48%).

Экспериментальная процедура для 3-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропан-1-амина (11)

Смесь 3-(проп-2-ин-1-илокси)оксетана (9, 7,96 г, 71 ммоль, 1,0 экв.), 3-азидопропан-1-амина (10, 7,82 г, 78 ммоль, 1,1 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (8,29 г, 15,6 ммоль, 0,22 экв.), йодида меди (1,35 г, 7,1 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (2,47 мл, 17,8 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (80 мл) нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли целит (20 г) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 15% с получением 3-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропан-1-амина (11, 11,85 г, 79%) в виде желтого масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₉H₁₆N₄O₂ 213,1; Найденное значение 213,0.

Экспериментальная процедура для N-(3-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропил)метакриламида (12)

Раствор 3-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропан-1-амина (11, 3,94 г, 18,56 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (3,1 мл, 22,28 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (100 мл) охлаждали до 0°C с помощью ледяной бани и добавляли по каплям метакрилоилхлорид (1,99 мл, 20,42 ммоль, 1,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, при этом обеспечивали нагревание до комнатной температуры. Добавляли 20 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/метанола в качестве подвижной фазы. Концентрацию метанола постепенно увеличивали от 0% до 5% с получением N-(3-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропил)метакриламида (12, 3,22 г, выход 62%) в виде твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₃H₂₀N₄O₃ 281,2; Найденное значение 281,0.

Экспериментальная процедура для N-(4-(1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (14)

К раствору (4-(1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (13, получен от WuXi, 1,2 г, 5,70 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (15 мл, 107,55 ммоль, 18,9 экв.) в CH₂Cl₂ (100 мл) медленно добавляли по каплям метакрилоилхлорид (893 мг, 8,54 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли 20 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 1,25% с получением N-(4-(1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (14, 1,38 г, выход 40%).

Экспериментальная процедура для (4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (15)

Смесь (4-йодофенил)метанамина гидрохлорида (5,0 г, 18,55 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,59 мл 3,71 ммоль, 0,2 экв.), аскорбата натрия (368 мг, 1,86 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (530 мг, 2,78 ммоль, 0,15 экв.), азида натрия (2,41 г, 37,1 ммоль, 2,0 экв.), Et₃N (3,11 мл, 22,26 ммоль, 1,2 экв.) и 2-(проп-2-ин-1-илокси)тетрагидро-2H-пирана (2,6 г, 18,55 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (50 мл) и воде (12 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через фильтровальную бумагу 413. Добавляли целит, и растворитель удаляли при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 6,25% с получением (4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (15, 3,54 г, 66%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₅H₂₀N₄O₂ 289,2; Найденное значение 289,2.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (16)

Раствор (4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (15, 3,46 г, 12,00 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (2,01 мл, 14,40 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (40 мл) охлаждали до 0°C с помощью ледяной бани и добавляли по каплям метакрилоилхлорид (1,23 мл, 12,60 ммоль, 1,05 экв., разбавленный в 5 мл CH₂Cl₂). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч. Добавляли 20 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 3,75% с получением N-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (16, 2,74 г, выход 64%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₉H₂₄N₄O₃ 357,2; Найденное значение 357,3.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-(гидроксиметил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (17)

Раствор N-(4-(4-(гидроксиметил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (16, 1,2 г, 3,37 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в метаноле (6 мл) и HCl (1 н., водн., 9 мл) в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии на силикагеле (24 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 12,5% с получением N-(4-(4-(гидроксиметил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (17, 0,85 г, выход 92%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₄H₁₆N₄O₂ 273,1; Найденное значение 273,1.

Экспериментальная процедура для (4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)бензил)карбамата (19)

Бензил(4-(гидроксиметил)бензил)карбамат (2,71 г, 10 ммоль, 1 экв.), 3,4-дигидро-2H-пиран (1,81 мл, 20 ммоль, 2 экв.), моногидрат п-толуолсульфоновой кислоты (285 мг, 1,5 ммоль, 0,15 экв.) в дихлорметане (100 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (24 г) с применением гексанов/EtOAc в качестве элюента, начиная со 100% гексанов и постепенно увеличивая концентрацию EtOAc до 100%, с получением бензил-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)бензил)-карбамата (19, 2,4 г, 68%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M+Na]⁺ Рассч. для C₂₁H₂₅NO₄ 378,17 Найденное значение 378,17.

Экспериментальная процедура для (4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-фенил)метанамина (20)

(4-(((Тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)бензил)карбамат (19, 1,5 г, 4,2 ммоль, 1 экв.), палладий на угле (160 мг, 10 вес. %) в EtOH быстро вакуумировали и затем добавляли водород через баллон и смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (12 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 25% с получением (4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)фенил)метанамина (20, 890 мг, 95%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₃H₁₉NO₂ 222,15 Найденное значение 222,14.

Экспериментальная процедура для N-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)бензил)-метакриламида (21)

Раствор (4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)фенил)метанамина (20, 0,5 г, 2,26 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,47 мл, 3,39 ммоль, 1,5 экв.) в CH₂Cl₂ (10 мл) быстро вакуумировали и продували азотом. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,33 мл, 3,39 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (12 г) с применением гексанов/EtOAc в качестве элюента, начиная со 100% гексанов и постепенно увеличивая концентрацию EtOAc до 100% с получением N-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)бензил)метакриламида (21, 0,47 г, выход 72%) в виде бесцветного твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+Na]⁺ Рассч. для C₁₇H₂₃NO₃ 312,16; Найденное значение 312,17.

Экспериментальная процедура для (4-(4-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (22)

Смесь (4-йодофенил)метанамина (5,0 г, 21,45 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,44 мл, 2,79 ммоль, 0,13 экв.), аскорбата натрия (425 мг, 2,15 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (409 мг, 2,15 ммоль, 0,1 экв.), азида натрия (2,79 г, 42,91 ммоль, 2,0 экв.) и 2-(бут-3-ин-1-илокси)тетрагидро-2H-пирана (3,36 мл, 21,45 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (20 мл) и воде (5 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через фильтровальную бумагу 413. Добавляли целит (10 г), и растворитель удаляли при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 5% с получением (4-(4-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (22, 3,15 г, 49%) в виде твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H ]⁺ Рассч. для C₁₆H₂₂N₄O₂ 303,18; Найденное значение 303,18.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида(23)

Раствор (4-(4-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (22, 3,10 г, 10,25 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (1,71 мл, 12,30 ммоль, 1,2 экв.) в H₂Cl₂ (55 мл) охлаждали до 0°C с помощью ледяной бани и добавляли по каплям метакрилоилхлорид (1,05 мл, 12,30 ммоль, 1,2 экв., разбавленный в 5 мл CH₂Cl₂). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч. Добавляли 8 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 2,5% с получением N-(4-(4-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (23, 2,06 г, выход 54%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₂₀H₂₆N₄O₃ 371,2078; Найденное значение 371,2085.

Экспериментальная процедура для (4-(1-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)фенил)метанамина (24)

Смесь (4-этинилфенил)метанамина (2,36 г, 18,00 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,56 мл, 3,60 ммоль, 0,2 экв.), аскорбата натрия (357 мг, 1,80 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (514 мг, 2,70 ммоль, 0,15 экв.) и 2-(2-азидоэтокси)тетрагидро-2H-пирана (3,08, 18,00 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (24 мл) и воде (6 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и фильтровали через целит, и ополаскивали с помощью MeOH (3×50 мл). Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток повторно растворяли в дихлорметане, добавляли целит (20 г), и растворитель удаляли при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 25% с получением (4-(1-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)фенил)метанамина (24, 3,51 г, 64%) в виде желтоватого масла. LCMS масса/заряд: [M+H ]⁺ Рассч. для C₁₆H₂₂N₄O₂ 303,1816; Найденное значение 303,1814.

Экспериментальная процедура для N-(4-(1-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)бензил)метакриламида (25)

Раствор (4-(1-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)фенил)метанамина (24, 1,5 г, 4,96 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (1,04 мл, 7,44 ммоль, 1,5 экв.) в CH₂Cl₂ (30 мл) быстро вакуумировали и продували азотом. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,72 мл, 7,44 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г) с применением гексанов/EtOAc в качестве элюента, начиная со 100% гексанов и постепенно увеличивая концентрацию EtOAc до 100%, с получением N-(4-(1-(2-((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)бензил)метакриламида (25, 0,9 г, выход 49%) в виде бесцветного твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M +Na]⁺ Рассч. для C₂₀H₂₆N₄O₃ 371,2078; Найденное значение 371,2076.

Экспериментальная процедура для 1-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)этан-1-амина (26)

Смесь 1-(4-йодофенил)этан-1-амина гидрохлорида (1,0 г, 4,05 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,08 мл, 0,53 ммоль, 0,13 экв.), аскорбата натрия (80 мг, 0,40 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (77 мг, 0,40 ммоль, 0,1 экв.), азида натрия (526 г, 8,09 ммоль, 2,0 экв.) и 2-(проп-2-ин-1-илокси)тетрагидро-2H-пирана (0,57 г, 4,05 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (9 мл) и воде (1 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в дихлорметане и фильтровали через пробку из целита. К фильтрату добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (40 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 5% с получением 1-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)этан-1-амина (26, 0,62 г, 51%) в виде желтоватого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₆H₂₂N₄O₂ 303,2; Найденное значение 303,2.

Экспериментальная процедура для N-(1-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)этил)метакриламида (27)

Раствор 1-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)этан-1-амина (26, 0,52 г, 1,7 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,29 мл, 2,1 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (11 мл) охлаждали до 0°C с помощью ледяной бани и добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,18 мл, 1,8 ммоль, 1,05 экв., разбавленный в 11 мл CH₂Cl₂). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч. Добавляли 5 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 2,5% с получением N-(1-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси) метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)этил)метакриламида (27, 0,49 г, выход 76%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₂₀H₂₆N₄O₃ 371,2078; Найденное значение 371,2087.

Экспериментальная процедура для (4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-2-(трифторметил)фенил)метанамина (28)

Смесь (4-йод-2-(трифторметил)фенил)метанамина (3,0 г, 9,97 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,31 мл 1,99 ммоль, 0,2 экв.), аскорбата натрия (197 мг, 1,00 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (285 мг, 1,49 ммоль, 0,15 экв.), азида натрия (1,30 г, 19,93 ммоль, 2,0 экв.), Et₃N (1,67 мл, 11,96 ммоль, 1,2 экв.) и 2-(проп-2-ин-1-илокси)тетрагидро-2H-пирана (1,40 г, 9,97 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (24 мл) и воде (6 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и фильтровали через пробку из целита, и ополаскивали с помощью метанола (3×50 мл). К фильтрату добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 25% с получением (4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-2-(трифторметил)фенил)метанамина (28, 2,53 г, 71%) в виде зеленого масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₆H₁₉N₄O₂F₃ 357,2; Найденное значение 357,1.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-2(трифторметил)бензил)метакриламида (29)

Раствор (4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-2-(трифторметил)фенил)метанамина (28, 1,0 г, 2,81 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,59 мл, 4,21 ммоль, 1,5 экв.) в CH₂Cl₂ (25 мл) быстро вакуумировали и продували азотом. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,41 мл, 4,21 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г) с применением гексанов/EtOAc в качестве элюента, начиная со 100% гексанов и постепенно увеличивая концентрацию EtOAc до 100%, с получением N-(4-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-2(трифторметил)бензил)метакриламида (29, 0,65 г, выход 55%) в виде бесцветного твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₂₀H₂₃N₄O₃F₃ 425,2; Найденное значение 425,1.

Экспериментальная процедура для 3-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропан-1-амина (30)

Смесь 3-азидопропан-1-амина гидрохлорида (1,5 г, 14,98 ммоль, 1,0 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (1,99 г, 3,75 ммоль, 0,25 экв.), йодида меди (0,29 г, 1,50 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (0,52 мл, 3,75 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (50 мл) и воде (6 мл) продували азотом в течение 5 минут и охлаждали до 0 C. Добавляли 2-(проп-2-ин-1-илокси)тетрагидро-2H-пиран (2,10 г, 14,98 ммоль, 1,0 экв.) и реакционную смесь нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через пробку из целита и ополаскивали с помощью метанола (3×50 мл). К фильтрату добавляли целит (20 г), растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 20% с получением 3-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропан-1-амина (30, 2,36 г, 66%). LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₁H₂₀N₄O₂ 241,2; Найденное значение 241,2.

Экспериментальная процедура для N-(3-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропил)метакриламида (31)

Раствор 3-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропан-1-амина (30, 1,0 г, 4,16 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,58 мл, 4,16 ммоль, 1,0 экв.) в CH₂Cl₂ (20 мл) быстро вакуумировали и продували азотом. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,40 мл, 4,16 ммоль, 1,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 20% с получением N-(3-(4-(((тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)пропил)метакриламида (31, 0,96 г, выход 75%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₅H₂₄N₄O₃ 309,2; Найденное значение 309,4.

Экспериментальная процедура для (4-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (32)

Смесь (4-йодофенил)метанамина гидрохлорида (2,64 г, 9,80 ммоль, 1,0 экв.), (1S,2S)-N1,N2-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,31 мл, 1,96 ммоль, 0,2 экв.), аскорбата натрия (198 мг, 0,98 ммоль, 0,1 экв.), йодида меди (279 мг, 1,47 ммоль, 0,15 экв.), азида натрия (1,27 г, 19,59 ммоль, 2,0 экв.), Et₃N (1,64 мл, 11,75 ммоль, 1,2 экв.) и 3-(проп-2-ин-1-илокси)оксетана (9, 1,10 г, 9,80 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (24 мл) и воде (6 мл) продували азотом в течение 5 минут и нагревали до 55°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, и фильтровали через пробку из целита, и ополаскивали с помощью метанола (3×50 мл). К фильтрату добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 25% с получением (4-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (32, 1,43 г, 56%) в виде масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₃H₁₆N₄O₂ 261,1346; Найденное значение 261,1342.

Экспериментальная процедура для N-(4-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (33)

Раствор (4-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)фенил)метанамина (32, 0,58 г, 2,23 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,47 мл, 3,34 ммоль, 1,5 экв.) в CH₂Cl₂ (20 мл) быстро вакуумировали и продували азотом. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,32 мл, 3,34 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (24 г) с применением гексанов/EtOAc в качестве элюента, начиная со 100% гексанов и постепенно увеличивая концентрацию EtOAc до 100%, с получением N-(4-(4-((оксетан-3-илокси)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)бензил)метакриламида (33, 0,48 г, выход 66%) в виде бесцветного твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₇H₂₀N₄O₃ 329,1608; Найденное значение 329,1611.

Экспериментальная процедура для этил-1-(2-метакриламидоэтил)-1H-имидазол-4-карбоксилата (35)

Раствор этил-1-(2-аминоэтил)-1H-имидазол-4-карбоксилата (34, 2,0 г, 10,91 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (3,80 мл, 27,29 ммоль, 2,5 экв.) в CH₂Cl₂ (20 мл) быстро вакуумировали и продували азотом. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (1,60 мл, 16,37 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Добавляли 15 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 25% с получением этил-1-(2-метакриламидоэтил)-1H-имидазол-4-карбоксилата (35, 1,28 г, выход 47%) в виде бесцветного твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₂H₁₇N₃O₃ 252,1; Найденное значение 252,1.

Экспериментальная процедура для N-(4-(1,1-диоксидотиоморфолино)бензил)метакриламида (37)

К раствору 4-(4-(аминометил)фенил)тиоморфолин-1,1-диоксида гидрохлорида (36, 1,15 г, 4,15 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (1,39 мл, 9,97 ммоль, 2,4 экв.) в CH₂Cl₂ (80 мл) добавляли по каплям раствор метакрилоилхлорида (0,43 мл, 4,36 ммоль, 1,05 экв., в CH₂Cl₂, 5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 22 ч при комнатной температуре. Добавляли 8 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 3,75% с получением N-(4-(1,1-диоксидотиоморфолино)бензил)метакриламида (37, 0,32 г, выход 25%) в виде твердого вещества.

Экспериментальная процедура для N-метил-N-(2-(метилсульфонил)этил)проп-2-ин-1-амина (38)

К смеси 1-метилсульфонилэтилена (4,99 г, 47,03 ммоль, 4,13 мл) и Amberlyst-15 (30% вес/вес) добавляли по каплям N-метилпроп-2-ин-1-амин (2,6 г, 37,62 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Катализатор удаляли посредством фильтрации и фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением N-метил-N-(2-(метилсульфонил)этил)проп-2-ин-1-амина (38, 6,43 г, 98%) в виде масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₇H₁₃NSO₂ 176,11; Найденное значение 176,1.

Экспериментальная процедура для N-((1-(2-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)-N-метил-2-(метилсульфонил)этан-1-амина (40)

Смесь N-метил-N-(2-(метилсульфонил)этил)проп-2-ин-1-амина (38, 5,02 г, 28,64 ммоль, 1,25 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (3,04 г, 5,73 ммоль, 0,25 экв.), йодида меди (436 мг, 2,29 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (0,8 мл, 5,7 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (50 мл) и воде (6 мл) вакуумировали и продували азотом (3 раза) и охлаждали с помощью ледяной бани. Добавляли по каплям 2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этан-1-амин (39, 5,02 г, 22,91 ммоль, 1,0 экв.), охлаждающую баню удаляли и смесь перемешивали в течение 5 минут. Реакционную смесь нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли целит (20 г) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 25% с получением N-((1-(2-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)-N-метил-2-(метилсульфонил)этан-1-амина (40, 4,98 г, 55%) в виде масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₅H₃₁N₅O₅S 394,2; Найденное значение 394,2.

Экспериментальная процедура для N-(2-(2-(2-(2-(4-((метил(2-(метилсульфонил)этил) амино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этил)метакриламида (41)

К раствору N-((1-(2-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)-N-метил-2-(метилсульфонил)этан-1-амина (40, 1,0 г, 2,54 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,43 мл, 3,05 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (15 мл) добавляли по каплям раствор метакрилоилхлорида (0,30 мл, 3,05 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре. Добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (40 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 12,5% с получением N-(2-(2-(2-(2-(4-((метил(2-(метилсульфонил)этил)амино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этил)метакриламида (41, 0,86 г, выход 73%) в виде масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₉H₃₅N₅O₆S 462,2; Найденное значение 462,2.

Экспериментальная процедура для 7-(проп-2-ин-1-ил)-2-окса-7-азаспиро[3,5]нонана (42)

3-Бромпроп-1-ин (4,4 мл, 39,32 ммоль 1,0 экв.) добавляли к смеси 2-окса-7-азаспиро[3,5]нонана (8,54 г, 39,32 ммоль, 1,0 экв.), карбоната калия (17,9 г, 129,7 ммоль, 3,3 экв.) в метаноле (200 мл) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь фильтровали, добавляли целит и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/метанола в качестве подвижной фазы. Концентрацию метанола постепенно увеличивали от 0% до 5% с получением 7-(проп-2-ин-1-ил)-2-окса-7-азаспиро[3,5]нонана (42, 4,44 г, 68%) в виде масла. Экспериментальная процедура для 2-(2-(2-(2-(4-((2-окса-7-азаспиро[3,5]нонан-7-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этан-1-амина (43)

Смесь 7-(проп-2-ин-1-ил)-2-окса-7-азаспиро[3.5]нонана (42, 2,5 г, 15,13 ммоль, 1,0 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (1,77 г, 3,33 ммоль, 0,22 экв.), йодида меди (288 мг, 1,51 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (0,53 мл, 3,8 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (50 мл) охлаждали с помощью ледяной бани. Добавляли по каплям 2-(2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этокси)этан-1-амин (39, 3,86 г, 17,70 ммоль, 1,17 экв.), охлаждающую баню удаляли и смесь перемешивали в течение 5 минут. Реакционную смесь нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли целит (10 г) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 10% с получением 2-(2-(2-(2-(4-((2-окса-7-азаспиро[3.5]нонан-7-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этан-1-амина (43, 4,76 г, 82%) в виде масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₈H₃₃N₅O₄ 384,3; Найденное значение 384,2.

Экспериментальная процедура для N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-окса-7-азаспиро[3.5]нонан-7-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этил)метакриламида (44)

Раствор 2-(2-(2-(2-(4-((2-окса-7-азаспиро[3.5]нонан-7-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этан-1-амина (43, 2,65 г, 6,91 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (1,16 мл, 8,29 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (100 мл) охлаждали с помощью ледяной бани в атмосфере азота. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,74 мл, 7,6 ммоль, 1,1 экв.). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/метанола в качестве подвижной фазы. Концентрацию метанола постепенно увеличивали от 0% до 10% с получением N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-окса-7-азаспиро[3.5]нонан-7-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этокси)этил)метакриламида (44, 1,50 г, выход 48%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₂₂H₃₇N₅O₅ 452,29; Найденное значение 452,25.

Экспериментальная процедура для 4-((1-(2-(2-аминоэтокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (45)

Смесь 4-(проп-2-ин-1-ил)тиоморфолин-1,1-диоксида (1,14 г, 6,58 ммоль, 1,0 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (768 мг, 1,45 ммоль, 0,22 экв.), йодида меди (125 мг, 0,66 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (0,23 мл, 1,65 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (20 мл) охлаждали с помощью ледяной бани. Добавляли по каплям 2-(2-азидоэтокси)этан-1-амин (1,00 г, 7,70 ммоль, 1,17 экв.), охлаждающую баню удаляли и смесь перемешивали в течение 5 минут. Реакционную смесь нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли целит (10 г) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (40 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 9,5% с получением 4-((1-(2-(2-аминоэтокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (45, 1,86 г, 93%) в виде белого твердого вещества. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₁H₂₁N₅O₄S 304,1438; Найденное значение 304,1445.

Экспериментальная процедура для N-(2-(2-(4-((1,1-диоксидотиоморфолино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этил)метакриламида (46)

Раствор 4-((1-(2-(2-аминоэтокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (45, 1,32 г, 4,35 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,73 мл, 5,22 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (100 мл) охлаждали с помощью ледяной бани в атмосфере азота. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,47 мл, 4,8 ммоль, 1,1 экв.). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (120 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 1,25% с получением N-(2-(2-(4-((1,1-диоксидотиоморфолино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этил)метакриламида (46, 0,90 г, выход 56%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₅H₂₅N₅O₄S 372,17; Найденное значение 372,15.

Экспериментальная процедура для 4-((1-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (47)

Смесь 4-(проп-2-ин-1-ил)тиоморфолин-1,1-диоксида (4,6 г, 26,55 ммоль, 1,0 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (3,1 г, 5,84 ммоль, 0,22 экв.), йодида меди (506 мг, 2,66 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (0,93 мл, 6,64 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (80 мл) охлаждали с помощью ледяной бани. Добавляли по каплям 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этан-1-амин (5,00 г, 28,68 ммоль, 1,08 экв.), охлаждающую баню удаляли и смесь перемешивали в течение 5 минут. Реакционную смесь нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли целит и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 10% с получением 4-((1-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (47, 5,26 г, 57%) в виде желтоватого масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₃H₂₅N₅O₄S 348,1700; Найденное значение 348,1700.

Экспериментальная процедура для N-(2-(2-(2-(4-((1,1-диоксидотиоморфолино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этил)метакриламида (48)

Раствор 4-((1-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (47, 1,49 г, 4,29 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,72 мл, 5,15 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (50 мл) охлаждали с помощью ледяной бани в атмосфере азота. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,46 мл, 4,7 ммоль, 1,1 экв.). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/метанола в качестве подвижной фазы. Концентрацию метанола постепенно увеличивали от 0% до 5% с получением N-(2-(2-(2-(4-((1,1-диоксидотиоморфолино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)этокси)этокси)этил)метакриламида (48, 0,67 г, выход 38%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₇H₂₉N₅O₅S 416,20; Найденное значение 416,20.

Экспериментальная процедура для 4-((1-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадецил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (49)

Смесь 4-(проп-2-ин-1-ил)тиоморфолин-1,1-диоксида (5,0 г, 28,86 ммоль, 1,0 экв.), трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]-амина (3,37 г, 6,35 ммоль, 0,22 экв.), йодида меди (550 мг, 2,89 ммоль, 0,1 экв.) и триэтиламина (1,01 мл, 7,22 ммоль, 0,25 экв.) в метаноле (90 мл) охлаждали с помощью ледяной бани. Добавляли по каплям 14-азидо-3,6,9,12-тетраоксатетрадекан-1-амин (8,86 г, 33,77 ммоль, 1,17 экв.), охлаждающую баню удаляли и смесь перемешивали в течение 5 минут. Реакционную смесь нагревали до 55°C и перемешивали в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли целит (15 г) и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали на силикагеле (220 г) с применением дихлорметана/(метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) в качестве подвижной фазы. Концентрацию (метанола, содержащего 12% (объем/объем) водного гидроксида аммония) постепенно увеличивали от 0% до 10% с получением 4-((1-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадецил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (49, 7,56 г, 60%) в виде масла. LCMS масса/заряд: [M+H]⁺ Рассч. для C₁₇H₃₃N₅O₆S 436,2224; Найденное значение 436,2228.

Экспериментальная процедура для N-(14-(4-((1,1-диоксидотиоморфолино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-3,6,9,12-тетраоксатетрадецил)метакриламида (50)

Раствор 4-((1-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадецил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил)тиоморфолин-1,1-диоксида (49, 1,95 г, 4,79 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (0,80 мл, 5,74 ммоль, 1,2 экв.) в CH₂Cl₂ (50 мл) охлаждали с помощью ледяной бани в атмосфере азота. Добавляли по каплям метакрилоилхлорид (0,51 мл, 5,26 ммоль, 1,1 экв.). Охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Добавляли 10 граммов целита и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (80 г) с применением дихлорметана/метанола в качестве подвижной фазы. Концентрацию метанола постепенно увеличивали от 0% до 5% с получением N-(14-(4-((1,1-диоксидотиоморфолино)метил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-3,6,9,12-тетраоксатетрадецил)метакриламида (50, 0,76 г, выход 32%) в виде бесцветного масла. LCMS масса/заряд: [M +H]⁺ Рассч. для C₂₁H₃₇N₅O₇S 504,25; Найденное значение 504,20.

Пример 2. Химическая модификация иллюстративных полимеров

Полимерный материал может быть химически модифицирован с помощью соединения формулы (I) (или его фармацевтически приемлемой соли) перед формированием частицы (например, гидрогелевой капсулы, описанной в данном документе). Протоколы синтеза иллюстративных соединений для модификации полимерных материалов кратко изложены выше в примере 1. Эти соединения или иные можно применять для химической модификации любого полимерного материала.

Например, в случае альгината, альгинатную карбоновую кислоту активируют для связывания с одним или несколькими функционализированными аминогруппой соединениями для обеспечения альгината, модифицированного с помощью соединения с противофиброзным действием, например, соединения формулы (I). Альгинатный полимер растворяли в воде (30 мл/грамм полимера) и обрабатывали с помощью 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (0,5 экв.) и N-метилморфолина (1 экв.). К данной смеси добавляли раствор представляющего интерес соединения (например, соединения 101, представленного в таблице 2) в ацетонитриле (0,3 М).

Количества добавляемого соединения и реагента для сочетания зависят от требуемой концентрации соединения, связываемого с альгинатом, например, плотности конъюгации. Средняя плотность конъюгации соединения 101 обычно составляет от 2% до 5% N, в то время как высокая плотность конъюгации соединения 101 обычно составляет от 5,1% до 8% N. Для получения полимерного раствора CM-LMW-Alg-101 средней плотности растворенный немодифицированный низкомолекулярный альгинат (приблизительная MW <75 кДа, соотношение G:M ≥ 1,5) обрабатывали с помощью 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (5,1 ммоль/г альгината), и N-метилморфолина (10,2 ммоль/г альгината), и соединения 101 (5,4 ммоль/г альгината). Для получения полимерного раствора CM-LMW-Alg-101 высокой плотности, растворенный немодифицированный низкомолекулярный альгинат (приблизительно MW < 75 кДа, соотношение G:M ≥ 1,5) обрабатывали с помощью 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (10,2 ммоль/г альгината), и N-метилморфолина (20,4 ммоль/г альгината), и соединения 101 (10,8 ммоль/г альгината).

Реакционную смесь нагревали до 55^oC в течение 16 ч, затем охлаждали до комнатной температуры и осторожно концентрировали с помощью ротационного выпаривания, затем остаток растворяли в воде. Смесь фильтровали через слой модифицированного цианогруппами силикагеля (Silicycle) и осадок на фильтре промывали с помощью воды. Затем полученный раствор подвергали интенсивному диализу (мембрана с MWCO 10000) и раствор альгината концентрировали с помощью лиофилизации для получения требуемого химически-модифицированного альгината в виде твердого вещества или концентрировали с применением любой методики, подходящей для получения раствора химически модифицированного альгината с вязкостью от 25 сП до 35 сП.

Плотность конъюгации с химически модифицированным альгинатом измеряли с помощью анализа сжиганием для измерения процентного содержания азота. Образец получали путем диализа раствора химически модифицированного альгината против воды (мембрана с MWCO 10000) в течение 24 часов с заменой воды дважды с последующей лиофилизацией до постоянного веса.

Пример 3. Получение иллюстративных растворов альгината

Смесь 70:30 химически модифицированного и немодифицированного альгината . Низкомолекулярный альгинат (альгинат PRONOVA™ VLVG, NovaMatrix, Саннвика, Норвегия, № в кат. 4200506, примерная молекулярная масса <75 кДа; соотношение G:M ≥ 1,5) химически модифицировали с помощью соединения 101 из таблицы 2 с получением раствора химически модифицированного низкомолекулярного альгината (CM-LMW-Alg-101) с вязкостью от 25 сП до 35 сП. Раствор немодифицированного высокомолекулярного альгината (U-HMW-Alg) получали растворением немодифицированного альгината (PRONOVA^TM SLG100, NovaMatrix, Саннвика, Норвегия, № в кат. 4202106, примерная молекулярная масса 150 кДа - 250 кДа) из расчета 3% веса на объем в 0,9% солевом растворе. Раствор CM-LMW-Alg смешивали с раствором U-HMW-Alg при объемном соотношении 70% CM-LMW-Alg и 30% U-HMW-Alg (в данном документе обозначается как раствор 70:30 CM-Alg:UM-Alg).

Контрольный раствор немодифицированного альгината. Немодифицированный среднемолекулярный альгинат (SLG20, NovaMatrix, Саннвика, Норвегия, № в кат. 4202006, примерная молекулярная масса 75-150 кДа) растворяли из расчета 1,4% веса на объем в 0,9% солевом растворе с получением раствора U-MMW-Alg.

Пример 4. Культивирование иллюстративных клеток для инкапсулирования в виде отдельных клеток

4A. Клетки АRPE-19. Эти клетки RPE культивировали и затем инкапсулировали в однокомпартментные или двухкомпартментные гидрогелевые милликапсулы. Клетки ARPE-19 можно культивировать в соответствии с любым способом, известным в данной области техники, например, в соответствии со следующим протоколом. Клетки ARPE-19 в культуральном флаконе 75 см² аспирировали для удаления культуральной среды, и клеточный слой быстро ополаскивали с помощью 0,05% (вес/объем) раствора трипсина/0,53 мМ EDTA ("трипсин-EDTA") для удаления всех следовых количеств сыворотки, содержащей ингибитор трипсина. 2-3 мл раствора трипсина/EDTA добавляли во флакон и клетки наблюдали под инвертированным микроскопом до тех пор, пока клеточный слой не диспергировался, как правило, в течение 5-15 минут. Чтобы избежать слипания клеток, манипуляции с ними проводили с осторожностью, и сводили к минимуму ударные воздействия на флакон или его встряхивание во время периода диспергирования. Если клетки не отделялись, флаконы выдерживали при 37^oC для облегчения диспергирования. После завершения диспергирования клеток добавляли 6-8 мл полной ростовой среды, и клетки аспирировали путем осторожного пипетирования. Суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при примерно 125 x g в течение 5-10 минут для удаления трипсина-EDTA. Супернатант удаляли, и клетки ресуспендировали в свежей среде для роста. Подходящие аликвоты суспензии клеток вносили в новые культуральные сосуды, которые инкубировали при 37^oC. Среду обновляли 2-3 раза в неделю.

4B. Клетки НEK293F. Эти клетки, реализуемые на рынке под наименованием FreeStyle™ 293 F (Thermo Fisher Scientific, Волтгем, Массачусетс, США), выращивали в суспензии с использованием 125 мл колбы Эрленмейера с рабочим объемом 25 мл среды для экспрессии FreeStyle 293. Колбы инкубировали при 37^°C на планшетном шейкере, установленном на 125 об./мин. Клетки выращивали до плотности от 2 до 3 × 10⁶ клеток/мл, при достижении которой клетки пересевали с обеспечением плотности от 2 до 3 × 10⁵ клеток/мл, обычно осуществляя данную процедуру каждые 3-4 дня. Чтобы избежать слипания, манипуляции с клетками проводили с осторожностью, их помещали в пробирку Falcon объемом 50 мл и центрифугировали на вортексе в течение 5-10 секунд для достижения максимальной гомогенности клеток. После количественного определения плотности клеток в новые культуральные сосуды добавляли соответствующие аликвоты клеточной суспензии.

Пример 5. Получение кластеров клеток для инкапсуляции

Сфероидные кластеры иллюстративных клеток (например, клеток ARPE-19) получали с применением планшетов для культивирования сфероидов AggreWell™ (STEMCELL Technologies) и протокола, кратко изложенного в данном документе. В день 1 раствор для ополаскивания (4 мл) добавляли в каждый планшет и планшеты центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об./мин. в большой центрифуге. Раствор для ополаскивания удаляли с помощью пипетки, и добавляли 4 мл полной ростовой среды. Клетки ARPE-19 высевали в планшеты из расчета требуемой плотности клеток и сразу же пипетировали для предотвращения агрегации, при этом общая эмпирическая закономерность такова, что 3,9 миллиона клеток на лунку будут образовывать кластеры диаметром 150 мкм. Планшет центрифугировали в течение 3 минут при 800 об./мин., и планшет помещали в инкубатор на ночь.

В день 2 планшет извлекали из инкубатора. Клетки осторожно пипетировали, применяя наконечники пипеток с широким просветом для того, чтобы отделить сфероидные кластеры. Кластеры фильтровали через сито для клеток с размером пор 40 мкм или 80 мкм для удаления лишних неприкрепленных отдельных клеток и затем центрифугировали в центрифуге при 2×1 минуту. Кластеры осторожно ресуспендировали с применением наконечников пипеток с широким просветом и осторожно перемешивали, чтобы распределить их по всему объему среды или другого материала (например, альгината).

В качестве альтернативы сфероиды ARPE-19 получали с применением следующего протокола. В день 1 планшеты AggreWell™ извлекают из упаковки в стерильном вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха. В каждую лунку добавляли по 2 мл раствора для ополаскивания Aggrewell™. Планшет центрифугируют при 2000 g в течение 5 минут для удаления пузырьков воздуха, а раствор для ополаскивания AggreWell™ удаляли из лунок. Каждую лунку промывали 2 мл полной среды для роста, и в каждую лунку добавляли 2 миллиона клеток ARPE-19 в 3,9 мл полной среды для роста. Планшет центрифугировали при 100 g в течение 3 минут, затем клетки инкубировали при 37°C в течение 48 часов. В день 3 тот же протокол, описанный выше, применяют для отделения сфероидных кластеров.

Пример 6. Формирование однокомпартментных и двухкомпартментных гидрогелевых капсул

Суспензии отдельных клеток (клетки ARPE-19 или клетки HEK293F, как описано в примере 4) инкапсулировали в одно- или двухкомпартментные гидрогелевые капсулы в соответствии с протоколами, описанными ниже.

Непосредственно перед инкапсулированием отдельные клетки центрифугировали при 1400 об./мин. в течение 1 мин. и промывали не содержащим кальция буфером Кребса-Хенселейта (KH) (4,7 мМ KCl, 25 мМ HEPES, 1,2 мМ KH₂PO₄, 1,2 мМ MgSO₄ × 7H₂O, 135 мМ NaCl, pH ≈ 7,4, ≈290 мОсм). После промывания клетки центрифугировали снова и весь супернатант аспирировали. В некоторых экспериментах клеточный осадок затем ресуспендировали в растворе 70:30 CM-Alg:UM-Alg, описанном в примере 3, с получением диапазона плотностей суспендированных отдельных клеток на мл раствора альгината. В некоторых экспериментах клетки применяли непосредственно без суспендирования (например, разведения) в растворе альгината ("неразведенные клетки").

Перед изготовлением однокомпартментных или двухкомпартментных гидрогелевых капсул буферы и растворы альгината стерилизовали путем фильтрации через 0,2-мкм фильтр с использованием асептической процедуры.

Для получения частиц, выполненных в виде двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул диаметром приблизительно 1,5 мм, электростатический генератор капель настраивали следующим образом: предусматривающий напряжение 0-100 кВ высоковольтный электрогенератор серии ES мощностью 20 Вт (серия EQ, Мацусада, Северная Каролина, США) подсоединяли к верхней и нижней части коаксиальной иглы (внутренний просвет 22G, внешний просвет 18G, Ramé-Hart Instrument Co., Саккасунна, Нью-Джерси, США). Внутренний просвет присоединяли к первому шприцу с замком Люэра на 5 мл (BD, Нью-Джерси, США), который был подсоединен к шприцевому насосу (Pump 11 Pico Plus, Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс, США), который был ориентирован вертикально. Внешний просвет соединяли через люэровское соединение со вторым 5-миллилитровым шприцем с замком Люэра, который был соединен со вторым шприцевым насосом (насос 11 Pico Plus), который был ориентирован горизонтально. При получении двухкомпартментных капсул, которые инкапсулируют клетки только во внутреннем компартменте, первый раствор альгината, содержащий клетки (в виде суспензии отдельных клеток), помещали в первый шприц, а второй раствор альгината без клеток помещали во второй шприц. Два шприцевых насоса перемещали первый и второй растворы альгината из шприцов через оба просвета коаксиальной иглы, и отдельные капли, содержащие оба раствора альгината, подвергались экструдированию из иглы в стеклянную чашку, содержащую раствор для сшивания. Параметры каждого шприцевого насоса Pico Plus предусматривали диаметр 12,06 мм, а скорости потока для каждого насоса регулировали для достижения различных тестовых скоростей потока, предусматриваемых в примерах ниже, но при сохранении общей скорости потока, установленной на уровне 10 мл/ч.

Для изготовления однокомпартментных гидрогелевых капсул диаметром приблизительно 1,5 мм раствор 70:30 CM-Alg:UM-Alg, описанный в примере 3 (с суспензией отдельных клеток или без нее), загружали в шприц, и на него надевали тупоконечную иглу 18 калибра (SAI Infusion Technologies). Шприц помещали в шприцевой насос, ориентированный вертикально над чашкой, содержащей буфер для сшивания. Электрогенератор высокого напряжения подключали к игле и заземляли на бокс биобезопасности. Шприцевой насос и электрогенератор запускали для обеспечения экструзии раствора альгината через иглу со скоростью потока 0,16 мл/мин. или 10 мл/час и регулированием напряжения в диапазоне 5-9 кВ до достижения скорости образования капель, составляющей 12 капель за 10 секунд.

Для изготовления как двухкомпартментных, так и однокомпартментных милликапсул после экструзии необходимых объемов растворов альгината капли альгината сшивали в течение пяти минут в растворе для сшивания, который содержал 25 мМ буфер HEPES, 20 мМ BaCl₂ и 0,2 M маннит. В некоторых экспериментах раствор для сшивания также содержал 0,01% полоксамера 188. Капсулы, которые опустились на дно сосуда для сшивания, собирали пипеткой в коническую пробирку. После того, как капсулы оседали в пробирке, буфер для сшивания удаляли и капсулы промывали. Капсулы без клеток промывали четыре раза буфером HEPES (NaCl 15,428 г, KCl 0,70 г, MgCl₂·6H₂O 0,488 г, 0 мл буферного раствора HEPES (1 М) (Gibco, Life Technologies, Калифорния, США) в 2 литрах деионизированной вода) и хранили при 4°C до применения. Капсулы, инкапсулирующие клетки, промывали четыре раза в буфере HEPES, два раза в 0,9% солевом растворе и два раза в культуральной среде и хранили в инкубаторе при 37°C.

В некоторых экспериментах проверяли качество капсул в композиции на основе двухкомпартментных или однокомпартментных капсул. Аликвоту, содержащую по меньшей мере 200 капсул, отбирали из композиции и переносили в луночный планшет, и аликвоту целиком исследовали в отношении качества с помощью световой микроскопии путем подсчета количества сферических капсул от общего количества.

В некоторых экспериментах механическую прочность капсул в композиции на основе двухкомпартментных капсул исследовали с использованием анализатора текстуры для определения силы первоначального разрыва, как описано в данном документе выше.

Пример 7. Оценка влияния загрузки клеток на качество капсул

Композиции на основе капсул (содержащие двухкомпартментные капсулы или однокомпартментные капсулы) получали, как описано в примере 6, с использованием раствора 70:30 CM-Alg:UM-Alg, описанного в примере 3, и различных загрузочных количеств клеток в растворе альгината, применяемом для получения первого (внутреннего) компартмента. Раствор для сшивания содержал 0,01% полоксамера 188. Двухкомпартментные капсулы (диаметром 1,5 мм) с первым и вторым компартментами равного объема, сформированные из раствора альгината 70:30, получали с использованием скорости потока 5 мл/час для растворов альгината в каждом из первого и второго шприцев. Кроме того, композицию на основе двухкомпартментных капсул диаметром 1,5 мм получали по сути таким же образом, за исключением того, что внутренний компартмент формировали с использованием неразведенных клеток (при концентрации, эквивалентной 500 миллионам клеток/мл) в первом шприце (например, без раствора альгината). Сконструированные клетки ARPE19, экспрессирующие фактор VIII, инкапсулировали из расчета 10-50 миллионов клеток/мл раствора альгината в однокомпартментные капсулы или 10-500 миллионов клеток/мл раствора альгината (при концентрации, эквивалентной однокамерным капсулам) в 2-компартментные капсулы. Различные композиции на основе капсул исследовали в отношении качества, а результаты показаны на фигуре 3.

В случае однокомпартментных милликапсул, как правило, наблюдали, что качество капсул (т. е. сферическая форма) снижалось по мере увеличения показателя загрузки клеток. Качество композиций, содержащих однокомпартментные милликапсулы, было ниже приемлемого порогового значения, предусматривающего 95% сферических частиц, в исследуемой аликвоте при показателях загрузки клеток, превышающих 20 миллионов клеток/мл альгината. Композиции, содержащие двухкомпартментные милликапсулы, имели очень высокое качество, выражаемое сферичностью, вплоть до значения загрузочного количества клеток, эквивалентного 500 миллионам клеток/мл раствора альгината, что примерно в 25 раз выше, чем максимально допустимая емкость клеточной загрузки для однокомпартментных частиц. Для этой конкретной конфигурации 70:30 CM-Alg:UM-Alg и размера капсулы значение загрузки клеток, эквивалентное 500 миллионам клеток/мл раствора альгината, по-видимому, является верхним пределом загрузки первого (внутреннего) компартмента. Таким образом, двухкомпартментых милликапсулы позволяли инкапсулировать значительно большее число клеток, не влияя на сферическую морфологию капсул.

Пример 8. Эффект изменения соотношения скоростей потока в отношении толщины второго компартмента

Композиции, содержащие двухкомпартментные гидрогелевые милликапсулы (диаметром около 1,5 мм), получали с использованием смеси 70:30 CM-Alg:U-Alg для обоих компартментов. Комбинированные скорости потока растворов альгината через внешний и внутренний просвет поддерживали постоянными на уровне 10 мл/ч., в то время как соотношение этих скоростей потока варьировали для получения капсул с различной толщиной компартментов. Для визуализации компартментов в полученных капсулах клетки ARPE19-FVIII инкапсулировали из расчета 20 миллионов клеток/мл раствора альгината в первый (внутренний) компартмент. Толщину компартмента измеряли с помощью анализа изображений.

Путем изменения соотношения скоростей потока для наружного и внутреннего просветов среднюю толщину второго (внешнего) компартмента 1,5-миллиметровой двухкомпартментной капсулы изменяли от 11 до 267 микрон, как показано на фигурах 4A-4B. Во всех случаях формировали сферические капсулы размером приблизительно 1,5 мм. Наименьший полученный второй (внешний) компартмент составлял приблизительно 11 микрон в диаметре, и увеличение соотношения скоростей потока для внешнего и внутреннего просветов увеличивало толщину второго (внешнего) компартмента на величину от приблизительно 11 микрон до максимум 267 микрон. Таким образом, толщину второго (внешнего) компартмента гидрогелевых капсул можно изменять путем варьирования скоростей потока растворов для внутреннего и внешнего компартментов для получения композиции на основе однородных сферических милликапсул.

Пример 9. Эффект варьирования состава и размера первого компартмента в отношении механических свойств частиц

Композиции на основе двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул получали путем экструзии первого и второго растворов альгината через коаксиальную иглу, как описано в примере 6. Второй (внешний) компартмент получали с использованием раствора 70:30 CM-Alg:U-Alg, описанного в примере 3, а первый (внутренний) компартмент получали с использованием раствора U-HMW-Alg, описанного в примере 3. При поддержании общей (например, комбинированной) скорости потока на уровне 10 мл/ч. соотношения скоростей потока растворов для внутреннего и внешнего компартментов (I:O) варьировали от 1 мл до 9 мл в час и от 9 мл до 1 мл в час для получения милликапсул с различной толщиной внутреннего и внешнего компартментов. Также получали контрольные композиции на основе капсул. Один контроль содержал однокомпартментные капсулы, изготовленные из того же раствора 70:30 CM-Alg:U-Alg. Вторая контрольная композиция содержала однокомпартментные капсулы, изготовленные из того же раствора U-HMW-Alg. Механическое испытание выполняли на аликвотах каждой из композиций с использованием анализатора текстуры для измерения показателя первоначального разрыва для отдельных капсул.

Двухкомпартментные капсулы диаметром приблизительно 1,5 мм получали при всех условиях. Однокомпартментные капсулы, полученные из смеси 70:30, характеризовались наименьшим показателем первоначального разрыва по сравнению со всеми конфигурациями двухкомпартментных капсул. Механическая прочность двухкомпартментных капсул с внутренним компартментом из U-HMW-Alg увеличивалась с увеличением объемной доли внутреннего компартмента по отношению ко всей капсуле (см. фиг. 5). Капсулы во второй контрольной композиции (однокомпартментные капсулы из U-HMW-Alg) характеризовались более высоким показателем первоначального разрыва, чем все двухкомпартментные частицы с внутренним и внешним компартментами, состоящими из U-HMW-Alg и 70:30 CM-Alg:U-Alg соответственно. По мере увеличения объемной доли внутреннего компартмента (U-HMW-Alg) усредненный показатель первоначального разрыва увеличивался. Следовательно, изменение конфигурации внутреннего компартмента (тип альгината и/или толщины) 2-компартментной милликапсулы может изменять ее механические свойства. Таким образом, 2-компартментные гидрогелевые милликапсулы могут иметь идентичную поверхность капсулы с точки зрения химической модификации (например, для ослабления FBR), но характеризоваться более высокой механической прочностью за счет изменения альгинатного состава в первом (внутреннем) компартменте.

Пример 10. Получение двухкомпартментных гидрогелевых капсул с варьирующимися значениями степени химической модификации во 2-м (внешнем) компартменте

Получали растворы химически модифицированного альгината с варьирующимися значениями степени конъюгирования с соединением 101. Полимеры получали с низкими (2,03% N), средними (4,42% N) или высокими (6,72% N) уровнями конъюгации с соединением 101, где % азота определяли с помощью анализа сжиганием, и данное значение соответствовало количеству малой молекулы, конъюгированной с полимером. Композиции на основе двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул получали следующим образом. Внешний компартмент получали с использованием (i) раствора, содержащего один из данных конъюгированных полимеров, смешанных с U-HMW-Alg в соотношении 70:30 CM-Alg-101 и U-HMW-Alg, или (ii) раствора U-MMW-Alg, описанного в примере 3 в качестве контроля. Внутренний компартмент получали с использованием раствора, содержащего CM-Alg-101 со средним уровнем конъюгирования, смешанный с U-HMW-Alg. Скорости потоков растворов для получения как внутреннего, так и внешнего компартментов составляли 5 мл/ч. Для визуализации первого (внутреннего) компартмента в первый (внутренний) компартмент капсулы инкапсулировали 20 миллионов клеток ARPE19-FVIII/мл раствора альгината.

На фиг. 6A - 6D показаны капсулы, полученные из полимеров CM-Alg с низкой, средней и высокой степенью конъюгации или контрольного (немодифицированного) полимера во втором (внешнем) компартменте. Композиции на основе сферических однородных милликапсул диаметром приблизительно 1,5 мм получали независимо от того, какой полимерный раствор CM-A использовали для формирования внешнего компартмента, демонстрируя, что капсулы высокого качества могут быть получены с использованием того же полимера, что и используемый для получения первого (внутреннего) компартмента, и с варьирующимися значениями степени химической модификации во втором (внешнем) компартменте.

Пример 11. Эффект варьирования степени химической модификации во втором компартменте в отношении биосовместимости

Гидрогелевые капсулы, полученные в примере 10, исследовали в отношении фиброза in vivo путем имплантации капсул в интраперитонеальное пространство мышей C57/BL6 на период продолжительностью в одну неделю. В этой мышиной модели инкапсулированные линии ксеногенных клеток, такие как клетки RPE человека, как правило, индуцируют фиброзный ответ. При извлечении частицы визуализировали в отношении наличия фиброза и измеряли показатель первоначального разрыва с помощью анализатора текстуры. Результаты показаны на фиг. 7A - 7F.

После извлечения пустые капсулы (без клеток) не характеризовались видимым фиброзом (фиг. 7D). Контрольные капсулы (внешний компартмент из U-MMW-Alg) характеризовались фиброзными отложениями, окружающими частицы (фиг. 7E). Для капсул с CM-Alg-101 во внешнем компартменте фиброзный ответ наблюдали только у капсул с CM-Alg с низкой степенью конъюгации (фиг. 7A), при этом минимальный фиброз наблюдали у капсул с CM-Alg со средней и высокой степенями конъюгации (фиг. 7B - 7C). Показатель первоначального разрыва измеряли до имплантации и при извлечении, и все 2-компартментные капсулы характеризовались схожими значениями показателя первоначального разрыва в каждый момент времени (фиг. 7F). Следовательно, изменение профиля химической модификации только во втором (внешнем) компартменте капсулы может применяться для модуляции противофиброзного свойства, т. е. увеличение концентрации соединения формулы I во внешнем компартменте может по сути уменьшать фиброз без влияния на механическую прочность.

Пример 12. Эффект варьирования степени химической модификации во втором компартменте в отношении адгезии макрофагов с течением времени

Степень адгезии макрофагов мыши in vivo в течение 1-4 недель на гидрогелевых капсулах с варьирующимися значениями степени (низкой, средней или высокой) химической модификации во втором (внешнем) компартменте исследовали следующим образом. Капсулы получали, как описано в примере 10, и имплантировали в организм мышей C57/BL6, как в примере 11, затем извлекали через 1, 2 и 4 недели после имплантации. При извлечении частицы визуализировали в отношении наличия макрофагов мыши с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (с использованием антител к F4/80). Результаты показаны на фиг. 9A - 9K.

Через 1 неделю после имплантации наблюдали адгезию макрофагов на капсулах положительного контроля (немодифицированный среднемолекулярный альгинат) и капсулах с низкой степенью конъюгации (фиг. 9A - 9B). Некоторый уровень адгезии макрофагов наблюдали на капсулах со средней степенью конъюгации (фиг. 9C), а минимальный уровень адгезии макрофагов наблюдали на капсулах с высокой степенью конъюгации (фиг. 9D) или пустых капсулах (фиг. 9E). Через 2 и 4 недели после имплантации адгезия макрофагов на пустых капсулах (фиг. 9H и 9K) отсутствовала, а уровень адгезии макрофагов на капсулах со средней степенью конъюгации (фиг. 9F и 9I) был выше по сравнению с капсулами с высокой степенью конъюгации (фиг. 9G и 9J), демонстрируя дозозависимость между уровнем химической модификации во втором (внешнем) компартменте капсулы и адгезией макрофагов (фиброзом) in vivo.

Пример 13. Эффект варьирования степени химической модификации во втором компартменте в отношении фиброза

Уровень химической модификации во втором (внешнем) компартменте иллюстративных частиц исследовали с точки зрения его эффекта в отношении фиброза с использованием способа, описанного ниже. Применяли капсулы с низким, средним и высоким уровнями конъюгации, полученные в примере 10. Кроме того, капсулы с умеренно высоким (4,79% N) и двойным высоким (9,00% N) уровнями конъюгации получали с использованием способов, описанных в примере 10, где % азота определяли с помощью анализа сжиганием, и данное значение соответствовало количеству малой молекулы, конъюгированной с полимером. Затем капсулы имплантировали в организм мышей C57/BL6, как описано в примере 11, и их извлекали через 2 недели после имплантации. Наличие фиброза для извлеченных капсул анализировали посредством визуализации с помощью светлопольной микроскопии, при этом непрозрачный слой вокруг капсулы указывал на наличие фиброза. Результаты показаны на фиг. 10A - 10E.

Пустые капсулы со средней степенью конъюгации применяли в качестве контроля, и они не демонстрировали наличия фиброза (фиг. 10А). Капсулы со средней степенью конъюгации или умеренно высокой степенью конъюгации демонстрировали более высокие уровни фиброза (фиг. 10B - 10C) по сравнению с капсулами с высокой степенью конъюгации (фиг. 10D). Многие из капсул с двойной высокой степенью конъюгации не представляли собой интактные сферы после извлечения, некоторые характеризовались наличием фиброза или уменьшенным размером, а также присутствовали значительные остатки капсул (фиг. 10E). Это предполагает, что второй (внешний) компартмент, содержащий высокие уровни соединения формулы (I), не сохранял интактность, демонстрируя, что существует верхний предел количества соединения формулы (I), которое может эффективно препятствовать фиброзу.

Пример 14. Эффект варьирования степени химической модификации во втором компартменте в отношении механической прочности

Механическую прочность капсул, применяемых в примере 13, измеряли по показателю первоначального разрыва с использованием анализатора текстуры. Каждую из контрольных капсул, капсул со средней, умеренно высокой, высокой и двойной высокой степенями конъюгации испытывали на механическую прочность как на до-, так и на постимплантационных стадиях. Результаты показаны на фиг. 11.

Первоначальная механическая прочность была выше у контрольных (пустых) капсул по сравнению с капсулами, загруженными клетками. Капсулы со средней, умеренно высокой и высокой степенями конъюгации характеризовались схожей прочностью как до, так и после имплантации, при этом после имплантации наблюдали снижение прочности. Капсулы с наиболее высоким уровнем конъюгации (двойным высоким) являлись наименее прочными капсулами, и большинство этих капсул не являлись интактными при извлечении (фиг. 11), как отмечено в примере 13. Это дополнительно демонстрирует, что существует верхний предел для степени конъюгации с малыми молекулами с противофиброзной активностью, которая обеспечивает эффективность, поскольку очень высокие уровни конъюгации отрицательно влияют на механическую прочность.

Пример 15. Эффект ковалентной и нековалентной химической модификации второго (внешнего) компартмента в отношении фиброза

Различие между конъюгированными и неконъюгированными соединениями формулы (I) во втором (внешнем) компартменте гидрогелевых капсул в качестве средства придания устойчивости к фиброзу определяли с помощью следующего эксперимента.

Капсулы со средним и высоким количествами соединений формулы (I) получали, как в примере 10. Кроме того, третий тип капсулы, характеризующихся наличием неконъюгированных противофиброзных малых молекул (обозначенный как капсулы с "возвращенным амином"), получали аналогично способу примера 10, где второй (внешний) компартмент капсулы изготавливали из раствора альгината, содержащего неконъюгированные соединения формулы (I). Этот раствор получали путем добавления неконъюгированной малой молекулы к раствору альгината со средней степенью конъюгации, используя количество неконъюгированной малой молекулы, необходимое для получения общего количества молекул соединения формулы (I), эквивалентного их количеству в растворе альгината с высокой степенью конъюгации. Раствор 70:30 CM-Alg:U-Alg применяли для первого (внутреннего) компартмента капсул с "возвращенным амином". Затем все капсулы имплантировали in vivo с использованием мышей C57/BL6, как описано в примере 11, и их извлекали через 2 недели после имплантации. Извлеченные капсулы визуализировали с помощью светлопольной микроскопии для обнаружения присутствия непрозрачного внешнего слоя прикрепленных клеток, указывающего на начало фиброза. Результаты показаны на фиг. 12A - 12C.

На капсулах со средней степенью конъюгации наблюдали слой прикрепленных клеток (фиг. 12A), в то время как на капсулах с высокой степенью конъюгации наблюдали лишь минимальный уровень адгезии (фиг. 12B). Капсулы с "возвращенным амином" также выглядели непрозрачными, что указывало на наличие слоя фиброзных клеток адгезированных на капсуле (фиг. 12C). Таким образом, эти данные демонстрируют, что только конъюгированные малые молекулы способствовали противофиброзным свойствам капсул.

Пример 16. Эффект варьирования уровня конъюгации с малыми молекулами и соотношения компонентов смеси полимеров во втором компартменте в отношении адгезии макрофагов

Капсулы, полученные из растворов альгината на основе двух смесей полимеров (содержащих разные соотношения низкомолекулярного альгината (CM-LMW) и немодифицированного высокомолекулярного альгината (U-HMW)) и варьирующихся количеств (среднего, умеренно высокого или высокого) молекул соединения формулы (I), сравнивали с точки зрения их устойчивости к фиброзу in vivo в следующем эксперименте.

Три полимерные смеси получали с соотношением 70% CM-LMW-Alg и 30% U-HMW-Alg (70:30), как описано в примере 3, со средними, умеренно высокими или высокими уровнями молекул соединения формулы (I). Также получали дополнительные три полимерные смеси с соотношением 60% CM-LMW-Alg и 40% U-HMW-Alg (60:40) также со средними, умеренно высокими или высокими уровнями молекул соединения формулы (I). Затем каждую полимерную смесь применяли для формирования второго (внешнего) компартмента капсул с применением способа, описанного в примере 10, с получением набора из шести гидрогелевых капсул, характеризующихся средним, умеренно высоким или высоким уровнями конъюгации, полученных из смесей полимеров с соотношением как 70:30, так и 60:40. Внутренние компартменты всех капсул содержали раствор 70:30 CM-Alg:U-Alg. Затем капсулы имплантировали in vivo, как описано в примере 11, и извлекали через 1 неделю после имплантации и анализировали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания в отношении адгезии макрофагов мыши (фиброза) на капсулах. Результаты показаны на фиг. 13A - 13F.

Тенденцию к снижению уровней прикрепленных макрофагов наблюдали в направлении от капсул со средней до капсул с высокой степенью конъюгации как для смесей с соотношением 70:30 (фиг. 13A - 13C), так и для смесей с соотношением 60:40 (фиг. 13D - 13F). Кроме того, большее количество прикрепленных макрофагов наблюдали в капсулах из смеси с соотношением 60:40 по сравнению с относительно более низким уровнем адгезии макрофагов в капсулах из смеси с соотношением 70:30. Поскольку изменение соотношения влияет на общую дозу малых молекул на капсуле, результаты позволяют сделать вывод о том, что количество малой молекулы, конъюгированной с полимером, и количество химически модифицированного полимера, применяемого для изготовления капсул, могут независимо изменять уровень адгезии макрофагов и фиброза.

Пример 17. Сравнение конструкции капсулы в отношении ее влияния на фиброзный ответ

Композиции однокомпартментных или двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул, инкапсулирующих отдельные клетки ARPE-19, экспрессирующие FVIII-BDD, получали путем экструзии капель раствора 70:30 CM-Alg:U-Alg, описанного в примере 3, с различными нагрузочными концентрациями клеток в раствор для сшивания. Однокомпартментные капсулы как не содержащие клеток, так и содержащие 5000 клеток, диспергированных по всему объему капсулы, получали в качестве контролей. Двухкомпартментные капсулы имели второй (внешний) компартмент, не содержащий клеток, и первый (внутренний) компартмент, содержащий 5000 или 2500 клеток на капсулу. Капсулы, содержащие 2500 и 5000 клеток, получали с использованием соотношения объемов внешнего и внутреннего компартментов, составляющего 50%:50%. Капсулы, содержащие 2500 клеток и характеризующиеся более высокой толщиной второго (внешнего) компартмента, получали с использованием соотношения объемов внешнего и внутреннего компартментов, составляющего 75%:25%. Капсулы имплантировали в интраперитонеальное пространство мышей C57/BL6 из расчета 0,5 мл капсул/мышь. Капсулы извлекали через 14 дней и визуализировали для определения наличия или отсутствия фиброза. Ожидалось, что в данной мышиной модели ксеногенные клетки ARPE-19 в капсуле индуцируют FBR.

Результаты этого эксперимента показали, что все капсулы, инкапсулирующие клетки ARPE-19, изготовленные с одним или двумя компартментами, подвергались фиброзу в модели мышей C57/BL6 (данные не показаны). На пустых однокомпартментных контрольных капсулах наличия фиброза не наблюдали. Таким образом, у мышей C57/BL6 конфигурация капсул в виде однокомпартментных или двухкомпартментных капсул не оказывала явного эффекта в отношении FBR, индуцированной ксеногенными клетками RPE.

Пример 18. Оценка клеточной пролиферации в иллюстративных частицах, выполненных в виде двухкомпартментных гидрогелевых капсул

Клетки HEK293F, рост которых происходил в суспензии, инкапсулировали во внутренний компартмент двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул диаметром приблизительно 1,5 мм. Капсулы получали с применением раствора 70:30 CM-Alg:U-MW-Alg, описанного в примере 3, для образования как внутреннего, так и внешнего компартментов. Нагрузочная концентрация клеток во внутреннем компартменте составляла 20 миллионов клеток HEK293F/мл (эквивалент 10 миллионам клеток/мл раствора альгината в 1,5-миллиметровой однокомпартментной капсуле). Двухкомпартментные капсулы изготавливали с использованием скоростей потока растворов для получения внутреннего и внешнего компартментов, составляющих 5 мл/ч. В качестве контроля получали однокомпартментные капсулы диаметром приблизительно 1,5 мм с применением того же раствора альгината, предусматривающего 70:30 CM-Alg:U-MW-Alg, содержащего 10 миллионов клеток HEK293F/мл. Капсулы инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 7 дней, а затем наблюдали под микроскопом.

При осмотре краев капсулы обнаруживалось наличие клеток, выступающих за края однокомпартментных капсул, но не двухкомпартментных капсул после одной недели культивирования (фиг. 14A - 14B). Свободно плавающие и прикрепленные клетки наблюдали на поверхности планшета для тканевых культур, содержащего однокомпартментные капсулы, демонстрируя неполную инкапсуляцию и/или потерю клеток (фиг. 14C). В отличие от этого, через одну неделю после культивирования за пределами двухкомпартментных капсул в планшете для культивирования наличия клеток не наблюдали (фиг. 14D). Аналогичные результаты получали, когда однокомпартментные и двухкомпартментные капсулы получали с использованием клеток ARPE19 вместо клеток HEK293F (данные не показаны). Таким образом, двухкомпартментные капсулы являются более эффективными, чем однокомпартментные капсулы в отношении удерживания клеток, например, не приводя к потере клеток или их выступанию над поверхностью капсулы.

Пример 19. Оценка высвобождения белка из одно- и двухкомпартментных капсул

Для определения того, способны ли белковые молекулы, экспрессируемые инкапсулированными клетками, высвобождаться из двухкомпартментных гидрогелевых капсул, сконструированные клетки ARPE19, экспрессирующие FVIII-BDD, инкапсулировали в двухкомпартментные капсулы, и секрецию белка измеряли через 24 часа.

Капсулы получали с использованием раствора 70:30 CM-alg:U-HMW-Alg, описанного в примере 3, в каждом из первого и второго шприцев и со скоростями потоков растворов для получения внутреннего и внешнего компартментов, составляющими 5 мл/ч. Раствор альгината для получения внутреннего компартмента также содержал ARPE19-FVIII в концентрации 20, 50 или 100 миллионов клеток/мл. Капсулы инкубировали в течение 24 часов при 37°C в известном объеме среды, и супернатант среды собирали и определяли FVIII с помощью ELISA для FVIII.

Через 24 часа FVIII обнаруживали в образцах супернатанта среды для каждой нагрузочной концентрации клеток. Наблюдали тенденцию к увеличению между нагрузочной концентрацией клеток и количеством обнаруживаемого FVIII для 2-компартментных частиц (данные не показаны). Эти результаты указывают на то, что FVIII, экспрессируемый клетками, инкапсулированными во внутренний компартмент двухкомпартментной капсулы, диффундирует через второй компартмент, а затем выходит из капсулы.

Пример 20. Концентрация клеток в капсулах может быть увеличена для обеспечения повышения уровней FIX в плазме крови и интраперитонеальной жидкости голых мышей

Композиции на основе двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул (1,5 мм), инкапсулирующих отдельные клетки ARPE-19:FIX, получали путем экструзии капель раствора 70:30 CM-Alg:U-Alg, описанного в примере 3, с различными нагрузочными концентрациями клеток в раствор для сшивания. Клетки инкапсулировали в концентрации 2, 20, 100, 300 миллионов клеток/мл альгината во внутренний компартмент (что эквивалентно 1, 10, 50, 150 миллионам клеток/мл раствора альгината в однокомпартментной капсуле диаметром 1,5 мм). Капсулы имплантировали в интраперитонеальное пространство голых мышей (0,5 мл/мышь) и извлекали через 5 дней. Уровни FIX в плазме крови и интраперитонеальной жидкости измеряли с помощью ELISA.

С помощью варьирования концентрации инкапсулируемых клеток общее количество инкапсулированных клеток варьировалось от 500 до 39000 клеток на капсулу, как показано на фиг. 15А. При всех концентрациях клеток получали капсулы со сферической морфологией (данные не показаны). Во время имплантации наблюдали некоторый уровень пролиферации клеток (фиг. 15A). Уровни FIX в плазме крови и интраперитонеальной жидкости увеличивались с увеличением концентрации клеток, за исключением концентрации, составляющей 2 миллиона клеток/мл, что соответствовало нижнему пределу обнаружения анализа ELISA (фиг. 15 B, C и данные не показаны). Имело место примерно 10-кратное увеличение уровней FIX в интраперитонеальной жидкости, где капсулы находятся в условиях локальной среды по сравнению с плазмой крови. При всех концентрациях клеток капсулы извлекали в интактном виде (данные не показаны). Таким образом, дозозависимость для экспрессии FIX как в IP, так и в плазме крови наблюдали в диапазоне концентраций от 2 до 300 млн. клеток/мл раствора альгината, применяемого для формирования внутреннего компартмента. Кроме того, успешная инкапсуляция 39000 клеток на капсулу значительно превышала величину, которая была приведена в научной литературе.

Пример 21. Оптимальная концентрация клеток обеспечивала максимальное увеличение уровней FIX и поддержание целостности капсул

Композиции на основе двухкомпартментных гидрогелевых милликапсул, инкапсулирующих отдельные клетки ARPE-19: FIX, получали таким же образом, как и в предыдущих примерах, при этом клетки инкапсулировали в количестве 100, 200, 300 и 646 миллионов клеток/мл раствора альгината, применяемого для формирования внутреннего компартмента (что эквивалентно 50, 100, 150, 323 миллионам клеток/мл раствора альгината в однокомпартментной капсуле диаметром 1,5 мм). Капсулы имплантировали в интраперитонеальное пространство голых мышей (0,5 мл/мышь) и извлекали через 4 недели. Уровни FIX в интраперитонеальной жидкости измеряли с помощью ELISA.

С помощью варьирования концентрации инкапсулируемых клеток общее количество инкапсулированных клеток варьировалось от 24000 до 54000 клеток на капсулу (данные не показаны). При всех концентрациях клеток получали капсулы со сферической морфологией (данные не показаны). Уровни FIX в интраперитонеальной жидкости увеличивались с увеличением концентрации клеток до 150 миллионов клеток/мл (фиг. 16A). При наиболее высокой загрузочной концентрации клеток (646 миллионов клеток/мл) уровни FIX были низкими, а извлеченные капсулы больше не были интактными (фиг. 16B). Большинство капсул, полученных с использованием 100 миллионов клеток/мл, характеризовались наибольшим количеством капсул, извлеченных в интактном виде (данные не показаны). Это демонстрирует, что существует оптимальная концентрация клеток, при которой обеспечиваются максимальные уровни белка, а капсулы сохраняют свою целостность.

Пример 22. Получение двухкомпартментных капсул с целевым размером, предусматривающим диаметр 0,75 мм или диаметр 1,0 мм

Композиции на основе двухкомпартментных капсул с целевым размером капсулы 1,0 мм или 0,75 мм получали, как описано в предыдущих примерах, но с внесением следующих корректировок. Раствор альгината, применяемый для формирования второго (внешнего) компартмента, содержал CM-Alg-101 со средним уровнем конъюгации с соединением 101 (например, полученный, как описано в примере 10), смешанный с U-HMW-Alg в соотношении 70:30 CM-Alg-101 и U-HMW-Alg. Тот же смешанный раствор альгината с суспензией клеток ARPE19 (50 миллионов клеток на мл), сконструированных для экспрессии фактора VIII человека, применяли для формирования первого (внутреннего) компартмента. Композиции на основе капсул с целевым размером капсулы 1,0 мм получали с применением коаксиальной иглы (OD 20G/ID 26G), напряжения 7,3 кВ, величин скорости потока для каждого из растворов для получения первого и второго компартментов, составляющих 5 мл/ч., и скорости образования капель для получения капсулы, составляющей 30-35 капель за 10 секунд. Композиции на основе капсул с целевым размером 0,75 мм получали с применением коаксиальной иглы (OD 20G/ID 26G), напряжения примерно 7,5 кВ, величин скорости потока для каждого из растворов для получения первого и второго компартментов, составляющих 5 мл/ч., и скорости образования капель для получения капсулы, составляющей 35-40 капель за 10 секунд.

Как показано на фиг. 18A - 18B, получали сферические двухкомпартментные капсулы размером 0,75 мм и 1,0 мм, содержащие клетки во внутреннем компартменте. Эти капсулы имели внешние компартменты, которые полностью инкапсулировали клетки во внутреннем компартменте. Таким образом, можно получать двухкомпартментные капсулы со средними диаметрами 0,75 и 1,0 мм.

ЭКВИВАЛЕНТЫ И ОБЪЕМ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящая заявка ссылается на различные выданные патенты, опубликованные заявки на патенты, журнальные статьи и другие публикации, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Если существует противоречие между любой из включенных ссылок и описанием настоящего изобретения, необходимо руководствоваться описанием изобретения. Кроме того, любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который относится к предшествующему уровню техники, может быть в явной форме исключен из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения. Поскольку считается, что такие варианты осуществления известны специалисту в данной области техники, они могут быть исключены, даже если исключение не изложено в явной форме в данном документе. Любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения может быть исключен из любого пункта формулы изобретения по какой-либо причине, не зависимо от того, относится ли он к существующему предшествующему уровню техники или нет.

Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, применяя всего лишь обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления, описанных в данном документе. Предусматривается, что объем вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных в данном документе, не ограничивается приведенным выше описанием, фигурами или примерами, а изложен в прилагаемой формуле изобретения. Специалисты в данной области техники будут понимать, что различные изменения и модификации данного описываемого изобретения могут быть выполнены без отступления от сущности или объема настоящего изобретения, определяемого в следующей формуле изобретения.

Группа изобретений относится к имплантируемой гидрогелевой капсуле для доставки терапевтического средства субъекту, содержащей: a) первый компартмент; b) второй компартмент и c) соединение формулы (I-a)

или его фармацевтически приемлемую соль, где первый и второй компартменты содержат альгинатный полимер; первый компартмент окружен вторым компартментом; первый компартмент содержит клетку, которая продуцирует терапевтическое средство; второй компартмент включает соединение формулы (I-а); капсула содержит границу раздела между первым и вторым компартментами, также относится к фармацевтически приемлемому препарату на основе совокупности имплантируемых гидрогелевых капсул, а также относится к способу изготовления имплантируемой гидрогелевой капсулы, включающему приведение совокупности капель полимерного раствора в контакт с водным раствором для сшивания в течение периода времени, достаточного для получения имплантируемой гидрогелевой капсулы, где раствор для сшивания содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность. Группа изобретений обеспечивает разработку частиц, выполненных в виде гидрогелевых милликапсул, содержащих первый гидрогелевый компартмент, второй гидрогелевый компартмент и соединение формулы (I), которые проявляют полезные свойства, например они характеризуются более высоким уровнем противофиброзной активности, чем аналогичные милликапсулы, не содержащие соединения формулы (I), но состоящие из полимера того же типа и имеющие по сути такой же размер, а также они могут вмещать большее число клеток, оказывая при этом минимальный отрицательный эффект в отношении качества капсулы по сравнению с милликапсулами, содержащими один компартмент. 3 н. и 28 з.п. ф-лы, 61 ил., 4 табл., 22 пр.

1. Имплантируемая гидрогелевая капсула для доставки терапевтического средства субъекту, содержащая:

a) первый компартмент;

b) второй компартмент и

c) соединение формулы (I-a)

(I-a)

или его фармацевтически приемлемую соль, где

первый и второй компартменты содержат альгинатный полимер;

первый компартмент окружен вторым компартментом;

первый компартмент содержит клетку, которая продуцирует терапевтическое средство;

второй компартмент включает соединение формулы (I-а);

капсула содержит границу раздела между первым и вторым компартментами;

где А представляет собой -N(R^C)- или -N(R^C)C(O)(C₂-C₆-алкенилен)-;

каждый из L¹ и L³ независимо представляет собой связь, алкил или гетероалкил, где каждый алкил и гетероалкил необязательно замещен одним или несколькими R²;

L² представляет собой связь;

М отсутствует или представляет собой гетероалкил или арил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R³;

P представляет собой триазолил, необязательно замещенный одним или несколькими R⁴;

Z представляет собой гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими R⁵;

каждый R^A, R^B, R^C, R^D, R^E, R^F и R^G независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, азидо, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁶;

или R^C и R^D, взятые вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют кольцо, необязательно замещенное одним или несколькими R⁶;

каждый R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, азидо, оксо, -OR^A1, -C(O)OR^A1, -C(O)R^B1,-OC(O)R^B1, -N(R^C1)(R^D1), -N(R^C1)C(O)R^B1, -C(O)N(R^C1), SR^E1, S(O)_xR^E1, -OS(O)_xR^E1, -N(R^C1)S(O)_xR^E1, - S(O)_xN(R^C1)(R^D1), -P(R^F1)_y, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R^A1, R^B1, R^C1, R^D1, R^E1 и R^F1 независимо представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил, где каждый алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил необязательно замещен одним или несколькими R⁷;

каждый R⁷ независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, галоген, циано, оксо, гидроксил, циклоалкил или гетероциклил;

х составляет 1 или 2; и

y составляет 2, 3 или 4.

2. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 1, где дифференциальный объем второго компартмента в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза или в 5 раз меньше, чем объем первого компартмента.

3. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 1, 2, где дифференциальный объем второго компартмента на 1%, 2%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 75% меньше, чем объем первого компартмента.

4. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 1, где первый компартмент не содержит соединения формулы (I-a).

5. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 1-4, где имплантируемая гидрогелевая капсула характеризуется наибольшим линейным размером (LLD), составляющим от 1 до 5 мм.

6. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 1-5, где среднее расстояние между внешней границей первого компартмента и внутренней границей второго компартмента составляет от 500 нм до 500 мкм.

7. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 1-6, где второй компартмент не содержит клетку.

8. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 7, где имплантируемая гидрогелевая капсула содержит по меньшей мере 5 × 10⁶, 10 × 10⁶, 15 × 10⁶ или 20 × 10⁶ клеток на мл.

9. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 7, 8, где клетка или клетки присутствуют в виде отдельных клеток, одного или нескольких сфероидов или связаны с одним или несколькими микроносителями.

10. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 1, где

а) одна или совокупность клеток размещены во втором компартменте;

b) число или плотность клеток во втором компартменте по меньшей мере в 2, 5, 10, 10², 10³ или 10⁴ раз меньше, чем число или плотность клеток в первом компартменте; и

c) первый компартмент содержит соединение формулы (I-a).

11. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 7-10, где клетка представляет собой эпителиальную клетку, эндотелиальную клетку, фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку (MSC) или кератиноцит.

12. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 7-11, где клетка представляет собой клетку пигментного эпителия сетчатки (RPE) или MSC.

13. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 7-12, где клетка представляет собой островковую клетку.

14. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 7-13, где терапевтическое средство представляет собой полипептид.

15. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 14, где полипептид представляет собой белок фактора VIII или его вариант или белок фактора IX или его вариант.

16. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 14, где полипептид представляет собой инсулин.

17. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 1, где полимеры как первого компартмента, так и второго компартмента модифицированы с помощью соединения формулы (I-a).

18. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 1-17, где соединение формулы (I-a) выбрано из группы, состоящей из , ,

19. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 1, где

а) первый компартмент содержит совокупность клеток, сконструированных для экспрессии полипептида; и

b) второй компартмент не содержит клеток.

20. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 19, где соединение формулы (I-a) представляет собой соединение 101, которое имеет структуру

21. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 20, где соединение 101 представлено в химически модифицированном альгинате при плотности, составляющей по меньшей мере 2,0% и менее 9,0% азота (N).

22. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 19, где первый компартмент сформирован из раствора альгината, в котором не содержится соединение формулы (I-a).

23. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 19-22, которая имеет средний диаметр от 1 до 2 мм или средний диаметр от 0,75 до 1,0 мм.

24. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 19-23, где первый компартмент сформирован из раствора альгината, содержащего от 10 до 50 миллионов клеток/мл, от 50 до 500 миллионов клеток/мл, от 75 миллионов до 450 миллионов клеток/мл, от 100 до 450 миллионов клеток/мл, от 100 до 400 миллионов клеток/мл или от 100 до 300 миллионов клеток/мл.

25. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 19-24, где клетки получены из клеток ARPE19 и содержат экзогенную нуклеотидную последовательность, которая предусматривает SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.

26. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 25, где экзогенная нуклеотидная последовательность предусматривает SEQ ID NO: 20.

27. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 25 или 26, где экзогенная нуклеотидная последовательность предусматривает SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 27.

28. Имплантируемая гидрогелевая капсула по п. 25 или 26, где экзогенная нуклеотидная последовательность предусматривает SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 28.

29. Имплантируемая гидрогелевая капсула по любому одному из пп. 1-28, изготовленная с помощью способа, включающего приведение совокупности капель полимерного раствора в контакт с водным раствором для сшивания в течение периода времени, достаточного для получения частицы, где раствор для сшивания содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность.

30. Фармацевтически приемлемый препарат на основе совокупности имплантируемых гидрогелевых капсул, где совокупность предусматривает имплантируемую гидрогелевую капсулу по любому одному из пп. 1-29.

31. Способ изготовления имплантируемой гидрогелевой капсулы по любому одному из пп. 1-28, включающий приведение совокупности капель полимерного раствора в контакт с водным раствором для сшивания в течение периода времени, достаточного для получения имплантируемой гидрогелевой капсулы, где раствор для сшивания содержит сшивающее средство, буфер и средство, регулирующее осмолярность.