Способ выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 C12N5/77 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинским технологиям, связанным с манипуляцией клетками, тканями, органами или всем организмом (вспомогательная репродукция).

В 2006 году S. Coleman в одной из своих публикаций отметил, что инъекционное введение жирового трансплантата, помимо эффекта объема, приводит и к другим позитивным изменениям тканей реципиентной зоны. В частности, автор на клиническом материале продемонстрировал улучшение качества рубцов кожи после угревой сыпи, а также улучшение качества облученных тканей после комбинированного лечения рабдомиосаркомы левой жевательной мышцы.

В 2007 году G. Rigotti et al. показали возможность лечения поздних лучевых повреждений путем инъекционного введения аутологичного жира в патологически измененные ткани. Клиническая картина характеризовалась уменьшением степени лучевого повреждения во всех случаях до 0-1 по шкале LENT-SOMA даже при обширных лучевых язвах. Гистологически было подтверждено формирование новой сосудистой сети, увеличение плотности капилляров, уменьшение явлений фиброза, улучшение гидратации тканей. Авторы пришли к выводу, что регенерация облученных тканей обусловлена наличием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), входящих в состав жирового трансплантата.

Эти публикации впервые продемонстрировали возможности использования жировой ткани в клинической практике пластического хирурга для стимуляции регенеративных процессов.

Присутствие ММСК в липоаспирате было открыто еще в 2001 году P. Zuk et al., после чего жировая ткань стала рассматриваться как наиболее удобный источник аутологичных стромальных клеток для клинического применения. Процесс получения ММСК включал выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) с последующим культивированием ядросодержащих клеток на питательной среде. Стромально-васкулярная фракция жировой ткани это комплекс клеточных популяций, включающий в себя стромальные клетки жировой ткани (ММСК), эндотелиальные и гладко мышечные клетки кровеносных сосудов и их предшественники, перициты, фибробласты, тканевые макрофаги, клетки крови - эритроциты и лейкоциты. Процесс выделения СВФ являлся промежуточной стадией и представлял собой ферментативную обработку липоаспирата с целью удаления адипоцитов и внеклеточного матрикса. В результате ядросодержащие клетки, устойчивые к воздействию коллагеназы, отделялись от тканевого матрикса, выпадая в осадок. Основным функциональным компонентом СВФ являются ММСК жировой ткани, способные к самообновлению и мультипотентной дифференцировке. Благодаря их пластичности, они считаются перспективными объектами для клеточной терапии и находят свое применение при лечении различных заболеваний.

В пластической хирургии клиническое применение СВФ первоначально было связано с попыткой улучшить приживление жирового трансплантата при липофилинге. Теоретическое обоснование обогащению жировой ткани аутологичными клетками (cell-assisted lipotransfer - CAL) было сформулировано К. Yoshimura et al. На животной модели авторы показали, что стромальные клетки играют важную роль в процессе приживления жирового трансплантата, отвечая за неоангиогенез и формирование новой ткани. Было подсчитано, что липоаспират содержит приблизительно в 2 раза меньше стромальных клеток в сравнении с интактным жиром. Восстановление естественной концентрации клеток в трансплантате, по мнению авторов, улучшало приживление инъецированной жировой ткани в сравнении с необогащенным липоаспиратом, что было подтверждено в эксперименте на мышах и отдельных клинических случаях.

По данным Zhu et al. капиллярная сеть при использовании обогащенных липографтов формируется от 3 до 7 суток. В настоящее время вопрос целесообразности обогащения жирового трансплантата СВФ остается дискутабельным. Литературные данные противоречивы, а возможности клинического применения данного метода зачастую ограничены, что связано либо с отсутствием необходимых по объему запасов жировой ткани у пациента, либо с отсутствием потребности в улучшении приживления жирового трансплантата. По всей видимости, существует зависимость клинического эффекта от количества клеток СВФ на единицу объема трансплантата, что объясняет противоречия в научной литературе.

Вместе с тем, возможности использования СВФ в клинической практике значительно шире. Это связано с рядом описанных выше эффектов, оказываемых различными клеточными популяциями СВФ при введении в ткани: синтез факторов роста, цитокинов, элементов экстрацеллюлярного матрикса, что обуславливает стимуляцию неоангиогенеза, модуляцию иммунного ответа и воспаления, поддержание жизнеспособности дифференцированных клеток в патологическом очаге, ремоделирование патологически измененных тканей, индукцию дифференцировки в специализированные клетки мезенхимального происхождения. Благодаря реализации этих универсальных эффектов СВФ может применяться практически во всех сферах медицины (травматология, урология, гинекология, кардиология, эндокринология, неврология и др.) и использоваться как локально, так и системно в виде внутривенных инъекций. В настоящее время активно ведутся научные работы в отношении регенерации костной, хрящевой, мышечной, нервной ткани при помощи стромально-васкулярной фракции жировой ткани, которая является одним из наиболее часто используемых инструментов регенеративной медицины. Активно проводятся исследования, посвященные применению СВФ жировой ткани в лечении острой реакции «трансплантат против хозяина», хронической аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, ревматоидного артрита, болезни Крона и других заболеваний.

Не смотря на высокую потребность в медицинском изделии, позволяющем выделять продукт СВФ надлежащего качества в уровне техники не выявлено способа, который бы позволил выделять стромально-васкулярную фракцию, сохраняя при этом ее клеточную целостность и функциональные свойства.

Таким образом, рассматривая технологический путь развития методов механического извлечения СВФ можно сделать вывод, что основные перспективы будут связаны с разработкой систем сепарации жировой ткани, нацеленных на увеличение числа жизнеспособных клеток СВФ. Это, в свою очередь, потребует проведения исследований, посвященных оценке механических свойств жировой ткани в динамике при выполнении процесса обработки. Также перспективным является разработка систем мультикомпонентной обработки, то есть из исходного образца жировой тканей эффективное получение разделенных между собой типов жировой ткани миллижир, микрожир и наножир.

Таким образом, задачей заявленного способа является разработка способа выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса который бы устранял известные недостатки, связанные с повреждением клеток выявленные в уровне техники.

Техническим результатом является разработка способа выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса, который бы позволил выделять стромально-васкулярную фракцию, сохраняя при этом ее клеточную целостность и функциональные свойства.

Технический результат достигается тем, что в способе выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса вначале поступившие в лабораторию шприцы с жировой тканью обрабатывают 70% этиловым спитом, затем проводят декантацию жировой ткани в шприцах для чего удаляют нижнюю жидкую фракцию, далее подготавливают систему для отмывки и инкубирования жировой ткани для чего берут контейнер предназначенный для присоединения к контейнеру с компонентами крови, полученными после центрифугирования, удаляют пластиковую иголку на конце магистрали контейнера, в полученное отверстие на конце магистрали контейнера вставляют шприц на 20 мл без поршня, затем декантированную жировую ткань переносят в контейнер без верхнего слоя жировой ткани, далее отмывают жировую ткань два раза раствором Рингера, для чего в контейнер добавляют через магистраль раствор Рингера в соотношении 1:1 к жировой ткани, перемешивают в контейнере, затем выстаивают до разделения фракций, удаляют нижнюю жидкую фракцию через магистраль обратно в шприц, затем к отмытой жировой ткани через магистраль добавляют 0,1% раствор коллагеназы II типа в соотношении 1:1 к жировой ткани, после чего перекрывают магистраль пластиковым зажимом, далее инкубируют смесь жировой ткани с коллагеназой в шейкере-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут, после инкубирования разводят клеточную суспензию в контейнере раствором Рингера в соотношении 1:1, при этом раствор Рингера вводят через магистраль контейнера, после чего переносят клеточную суспензию из контейнера в тестовые пробирки с ситом далее центрифугируют тестовые пробирки с ситом и с суспензией клеток в течение 7 минут при 400g в центрифуге после центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок с ситом путем слива через край пробирки, после чего в тестовые пробирки с ситом добавляют раствор Рингера, и центрифугируют тестовые пробирки с ситом и с суспензией клеток в течение 7 минут при 400g в центрифуге, после центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок с ситом путем слива через край пробирки, затем откручивают дно тестовых пробирок, ресуспендируют стерильной пипеткой клеточный осадок и переносят клеточную суспензию в чистую пробирку, после чего автоматическим дозатором отбирают аликвоту для подсчета клеток в полученной стромально-васкулярной фракции и проводят подсчет клеток на автоматическом счетчике.

Новизна патента на метод ферментативного получения СВФ из жировой ткани человека заключается в его специфическом подходе к обработке липоаспирата. В отличие от традиционных методов, основанных на механической обработке, предлагаемый метод использует ферментативную обработку. Это позволяет эффективно выделять стромально-васкулярную фракцию, сохраняя при этом ее клеточную целостность и функциональные свойства.

Применение ферментов в процессе обработки липоаспирата способствует более эффективному разделению жировых клеток и клеточных компонентов, таких как мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), эндотелиальные и гладкомышечные клетки. Этот подход также способствует повышению выхода целевой клеточной фракции, что делает метод особенно подходящим для использования в клеточной терапии, восстановительной медицине и других областях, где требуется точное извлечение и использование специфических клеточных популяций для лечения и регенерации тканей.

Новизна патента также заключается в его универсальной применимости как в условиях операционной, так и в лаборатории. При этом используется стандартный набор оборудования, которым оснащена любая операционноая или лаборатория для работы с клеточными культурами. Этот метод разработан с учетом возможности быстрой и эффективной обработки липоаспирата прямо в хирургической клинике или операционной. Это упрощает и ускоряет процесс подготовки клеточного материала, минимизируя риск его контаминации или потери биологической активности в процессе транспортировки или хранения.

Применение предлагаемого способа для ферментативного получения СВФ из жировой ткани человека не требует специфического использования каких-либо других медицинских изделий. Способ разработан с учетом совместимости по размерам с широким спектром центрифуг, используемых в медицинских учреждениях. Это обеспечивает простоту интеграции в существующие клинические процессы. Благодаря совместимости с существующим оборудованием минимизируется необходимость в приобретении дополнительного оборудования или расходных материалов для его реализации.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показан этап декантации жировой ткани в шприцах - удаление нижней жидкой фракции.

На фиг. 2 показан этап подготовки системы для отмывки и инкубирования жировой ткани.

На фиг. 3 показан этап переноса деконтированной жировой ткани в контейнер без верхнего «масляного» слоя.

На фиг. 4 показан этап отмывания жировой ткани раствором Рингера.

На фиг. 5 показан этап добавления к жировой ткани раствора коллагеназы II типа и перекрытие магистрали пластиковым зажимом.

На фиг. 6 показан этап инкубирования смесь жировой ткани с коллагеназой шейкере-инкубаторе.

На фиг. 7 показан этап переноса разведенной клеточной суспензии из контейнера в тестовые пробирки с ситом.

На фиг. 8 показан этап центрифугирования тыстовых пробирок с суспензией клеток.

На фиг. 9 показан этап удаления супернатанта из тестовых пробирок путем слива через край пробирки

На фиг. 10 показан этап добавления в тестовые пробирки раствора Рингера

На фиг. 11 показан этап удаления супернатант из тестовых пробирок путем слива через край пробирки после центрифугирования

На фиг. 12 показано открученное дно тестовых пробирок с клеточным отсатком.

Осуществление изобретения

Заявленный способ поясняется следующими примерами.

Процедуру выделения стромально-васкулярной фракции производят в условиях стерильного бокса, в БМБ-П-«Ламинар-С»-1,5 (SAVVY SL).

Поступившие в лабораторию шприцы с жировой тканью обрабатывают 70% этиловым спитом. Затем производят декантацию жировой ткани в шприцах: удаляют нижнюю жидкую фракцию (Фиг. 1).

Подготавливают систему для отмывки и инкубирования жировой ткани (Фиг. 2): берут контейнер «Компогем 300», удаляют пластиковую иголку на конце магистрали контейнера, в полученное отверстие вставляют шприц на 20 мл без поршня.

Деконтированную жировую ткань переносят в контейнер «Компогем 300» без верхнего «масляного» слоя (Фиг. 3).

Отмывают жировую ткань 2 раза раствором Рингера: в контейнер «Компогем 300» добавляют через магистраль раствор Рингера в соотношении 1:1, перемешивают в контейнере, ждут разделение фракций, удаляют нижнюю жидкую фракцию через магистраль обратно в шприц (Фиг. 4).

К отмытой жировой ткани через магистраль добавляют 0,1% раствор коллагеназы II типа (StemCell) в соотношении 1:1, перекрывают магистраль пластиковым зажимом (Фиг. 5).

Инкубируют смесь жировой ткани с коллагеназой в шейкере-инкубаторе Senova BS-3021 при 370С в течение 30 минут (Фиг. 6).

После инкубирования разводят клеточную суспензию в контейнере «Компогем 300» раствором Рингера в соотношении 1:1 (вводят раствор Рингера через магистраль контейнера).

Переносят разведенную клеточную суспензию из контейнера «Компогем 300» в тестовые пробирки с ситом (Фиг. 7).

Цетрифугируют тестовые пробирки с суспензией клеток в течение 7 минут при 400g в центрифуге Gyrozen 1248 (Фиг. 8).

После центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок путем слива через край пробирки (Фиг. 9).

Добавляют в тестовые пробирки раствор Рингера (Фиг. 10).

Цетрифугируют тестовые пробирки с суспензией клеток в течение 7 минут при 400g в центрифуге Gyrozen 1248.

После центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок путем слива через край пробирки (Фиг. 11).

Откручивают дно тестовых пробирок (Фиг. 12), ресуспендируют стерильной пипеткой клеточный осадок и переносят клеточную суспензию в чистую пробирку.

Отбирают автоматическим дозатором аликвоту для подсчета клеток в полученной стромально-васкулярной фракции.

Производят подсчет клеток на автоматическом счетчике RWD С100.

Возможны следующие подготовительные этапы перед выделением СВФ:

1. Нагревают водяную баню до 37°С.

2. Приготавливают раствор коллагеназы:

Сперва удаляют защитный металлический колпачок с крышки емкости с лиофиллизированной коллагенозой, протирают спиртовой салфеткой. Снимают резиновую пробку с емкости.

Набирают в шприц 5 мл раствора Рингера. Добавляют в емкость с лиофилизированной коллагеназой 5 мл раствора Рингера из шприца. Закрывают резиновую пробку. Аккуратно перемешивают (либо аккуратно перемешивают стерильной пипеткой/пастеровской пипеткой).

Оставляют емкость с коллагеназой на 30 минут до полного растворения фермента.

Ставят в штатив 1 чистую пробирку на 50 мл.

Через 30 минут открывают крышку емкости и стерильной пипеткой/пастеровской пипеткой переносят 5 мл раствора коллагеназы в чистую пробирку на 50 мл.

Добавляют 45 мл раствора Рингера в 50 мл пробирку с раствором коллагеназы с помощью шприца. Перемешивают.

Ставят в штатив 1 чистую пробирку на 50 мл.

Шприцем на 20 мл отбирают раствор коллагеназы из пробирки, надевают на шприц фильтр-насадку 0,22 мкм, профильтровывают раствор коллагеназы в чистую пробирку на 50 мл путем надавливания на поршень шприца. Профильтровывают весь объем раствора коллагеназы.

Возможно осуществление способа во время операции для этого необходимо шприцы с жировой тканью обработать стерильной спиртовой салфеткой, установить в штатив в вертикальном положении для разделения фракций. Жировая ткань окажется в верхней части шприца, водная фракция - в нижней. Не меняя положения шприца, аккуратно снять защитный колпачок и удалить жидкость из шприца в емкость для слива путем нажатия на поршень. Жировая ткань остается в шприце.

Достать мешок для компонентов крови из упаковки, закрыть все порты на магистралях, присоединить шприц с декантированной жировой тканью через порт для шприца луер лок, открыть порт на магистрали и перенести жировую ткань в мешок путем надавливания на поршень шприца, закрыть порт. Перенести таким же способом жировую ткань из других шприцев.

Набрать в шприц луер лок 50 мл раствора Рингера. Перенести раствор Рингера через магистраль в мешок с жировой тканью, закрыть порт на магистрали. Перемешать содержимое мешка. Установить мешок в вертикальном положении и подождать разделение фракций. Открыть порт и удалить нижнюю жидкую фракцию через магистраль обратно в шприц, оттягивая поршень.

Повторить процедуру отмывки жировой ткани раствором Рингера (Набрать в шприц луер лок 50 мл раствора Рингера. Перенести раствор Рингера через магистраль в мешок с жировой тканью, закрыть порт на магистрали. Перемешать содержимое мешка. Установить мешок в вертикальном положении и подождать разделение фракций. Открыть порт и удалить нижнюю жидкую фракцию через магистраль обратно в шприц, оттягивая поршень) еще 1 раз.

Набрать в шприц луер лок 50 мл подготовленного заранее раствора коллагеназы. Добавить фермент через магистраль в мешок с отмытой жировой тканью, закрыть порт на магистрали. Перемешать содержимое мешка. Поместить мешок на водяную баню (в операционной или предоперационной), инкубировать 30 минут при 37°С.Перемешивать содержимое мешка 3-4 раза за все время инкубирования.

После окончания инкубирования достать мешок из водяной бани, протереть стерильной салфеткой. Добавить 100 мл раствор Рингера в мешок с ферментированной жировой тканью через магистраль, перемешать.

Установить в штатив 4 пробирки-сепаратора. Открыть крышки пробирок-сепараторов. Открыть порт на магистрали мешка и перенести через магистраль клеточную суспензию в пробирки-сепараторы. Плотно закрыть крышки пробирок-сепараторов.

Поместить 4 пробирки-сепаратора с клеточной суспензией в центрифугу. Центрифугировать в течение 7 минут при 400g.

Поставить в штатив 2 чистые пробирки на 50 мл.

После центрифугирования пробирки-сепараторы перенести из центрифуги в штатив. Для каждой пробирки-сепаратора выполнить следующие действия: открыть крышку пробирки-сепаратора и слить через край в емкость для слива надосадочную жидкость. Открутить верхнюю часть пробирки-сепаратора.

Из нижней части пробирки-сепаратора отобрать с помощью стерильной пипетки (пастеровской пипетки) клеточный осадок вместе с раствором в чистую 50 мл пробирку. Перемешать этой же пипеткой. В одну чистую 50 мл пробирку перенести клеточные осадки из двух пробирок-сепараторов. Получаем 2 пробирки с клеточными осадками. Довести объем раствора в каждой пробирки до 50 мл путем добавления раствора Рингера.

Поместить 2 пробирки с клеточными осадками в центрифугу. Центрифугировать в течение 7 минут при 400g.

Поставить в штатив 1 чистую пробирку на 50 мл.

После центрифугирования пробирки перенести из центрифуги в штатив. Открыть крышку каждой пробирки и аккуратно слить через край в емкость для слива надосадочную жидкость. В каждую пробирку добавить по 10 мл раствора Рингера. Новой стерильной пипеткой (пастеровской пипеткой) перенести клеточные осадок из двух пробирок в одну чистую стерильную пробирку на 50 мл.

Поместить пробирку с клеточным осадком в центрифугу. Предварительно подготовить равновес для пробирки. Центрифугировать в течение 7 минут при 400g.

После центрифугирования пробирку перенести из центрифуги в штатив. Открыть крышку пробирки с клеточным осадком и аккуратно слить через край в емкость для слива надосадочную жидкость.

К полученному клеточному осадку добавить 5 мл раствора Рингера. Перемещать стерильной пипеткой (пастеровской пипеткой) клеточный осадок.

Перенести содержимое пробирки в стерильный шприц.

Шприц с клеточным продуктом передать для дальнейшего применения пациенту.

В рамках испытаний заявленного способа были следующие данные, представленные в таблице 1

Экспериментальная проверка работоспособности образцов проводилась на территории Лаборатории клеточной терапии НКЦ №2 ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского». Результаты проверки признаны положительными и представлены в прилагаемых материалах. Выживаемость клеток была выше 95%, что подтвердило разработку способа выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса, который позволяет выделять стромально-васкулярную фракцию, сохраняя при этом ее клеточную целостность и функциональные свойства.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса. Вначале поступившие в лабораторию шприцы с жировой тканью обрабатывают 70% этиловым спитом. Затем проводят декантацию жировой ткани в шприцах. Далее подготавливают систему для отмывки и инкубирования жировой ткани - берут контейнер, предназначенный для присоединения к контейнеру с компонентами крови, полученными после центрифугирования, удаляют пластиковую иголку на конце магистрали контейнера, в полученное отверстие на конце магистрали контейнера вставляют шприц на 20 мл без поршня. Затем декантированную жировую ткань переносят в контейнер без верхнего слоя жировой ткани. Далее отмывают жировую ткань два раза раствором Рингера в соотношении 1:1 к жировой ткани, перемешивают в контейнере. Затем выстаивают до разделения фракций, удаляют нижнюю жидкую фракцию через магистраль обратно в шприц, затем к отмытой жировой ткани через магистраль добавляют 0,1% раствор коллагеназы II типа в соотношении 1:1 к жировой ткани, после чего перекрывают магистраль пластиковым зажимом. Далее инкубируют смесь жировой ткани с коллагеназой в шейкере-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут, после инкубирования разводят клеточную суспензию в контейнере раствором Рингера в соотношении 1:1, при этом раствор Рингера вводят через магистраль контейнера, после чего переносят клеточную суспензию из контейнера в тестовые пробирки с ситом далее центрифугируют тестовые пробирки с ситом и с суспензией клеток в течение 7 минут при 400g в центрифуге. После центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок с ситом путем слива через край пробирки, после чего в тестовые пробирки с ситом добавляют раствор Рингера, и центрифугируют тестовые пробирки с ситом и с суспензией клеток в течение 7 минут при 400g в центрифуге. После центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок с ситом путем слива через край пробирки. Затем откручивают дно тестовых пробирок, ресуспендируют стерильной пипеткой клеточный осадок и переносят клеточную суспензию в чистую пробирку, после чего автоматическим дозатором отбирают аликвоту для подсчета клеток в полученной стромально-васкулярной фракции и проводят подсчет клеток на автоматическом счетчике. Изобретение обеспечивает выделение стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса. 12 ил. 1 табл.

Способ выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани в тестовых пробирках в условиях стерильного бокса, в котором вначале поступившие в лабораторию шприцы с жировой тканью обрабатывают 70% этиловым спитом, затем проводят декантацию жировой ткани в шприцах, для чего удаляют нижнюю жидкую фракцию, далее подготавливают систему для отмывки и инкубирования жировой ткани, для чего берут контейнер, предназначенный для присоединения к контейнеру с компонентами крови, полученными после центрифугирования, удаляют пластиковую иголку на конце магистрали контейнера, в полученное отверстие на конце магистрали контейнера вставляют шприц на 20 мл без поршня, затем декантированную жировую ткань переносят в контейнер без верхнего слоя жировой ткани, далее отмывают жировую ткань два раза раствором Рингера, для чего в контейнер добавляют через магистраль раствор Рингера в соотношении 1:1 к жировой ткани, перемешивают в контейнере, затем выстаивают до разделения фракций, удаляют нижнюю жидкую фракцию через магистраль обратно в шприц, затем к отмытой жировой ткани через магистраль добавляют 0,1% раствор коллагеназы II типа в соотношении 1:1 к жировой ткани, после чего перекрывают магистраль пластиковым зажимом, далее инкубируют смесь жировой ткани с коллагеназой в шейкере-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут, после инкубирования разводят клеточную суспензию в контейнере раствором Рингера в соотношении 1:1, при этом раствор Рингера вводят через магистраль контейнера, после чего переносят клеточную суспензию из контейнера в тестовые пробирки с ситом далее центрифугируют тестовые пробирки с ситом и с суспензией клеток в течение 7 минут при 400 g в центрифуге после центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок с ситом путем слива через край пробирки, после чего в тестовые пробирки с ситом добавляют раствор Рингера, и центрифугируют тестовые пробирки с ситом и с суспензией клеток в течение 7 минут при 400 g в центрифуге, после центрифугирования удаляют супернатант из тестовых пробирок с ситом путем слива через край пробирки, затем откручивают дно тестовых пробирок, ресуспендируют стерильной пипеткой клеточный осадок и переносят клеточную суспензию в чистую пробирку, после чего автоматическим дозатором отбирают аликвоту для подсчета клеток в полученной стромально-васкулярной фракции и проводят подсчет клеток на автоматическом счетчике.