Способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 C12N5/00 C12N5/78 

Изобретение относится к области медицины, а именно хирургии и регенеративной медицине, и может быть использовано для получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани для инъекции с целью повышения регенерации и трофики кожи и мягких тканей, лечения суставов и заболеваний опорно-двигательной системы за счет потенцирования регенеративных процессов.

Известен способ получения стромально-васкулярной фракции, при котором жировую ткань получают методом липоаспирации. Так, 10 граммов липоаспирата подвергают ферментативной обработке либо эмульгируют механическим способом, затем центрифугируют, удаляют супернатант, а оставшуюся часть ресуспендируют, и именно в ней определяется стромально-васкулярная фракция (Chaput В, Bertheuil N, Escubes М, Grolleau JL, Garrido I, Laloze J, Espagnolle N, Casteilla L, Sensebé L, Varin A. Mechanically Isolated Stromal Vascular Fraction Provides a Valid and Useful Collagenase-Free Alternative Technique: A Comparative Study. Plast Reconstr Surg. 2016 Oct;138(4):807-819. doi: 10.1097/PRS.0000000000002494. PMID: 27307342). Однако при данном способе невозможно полноценно удалить супернатант, содержащий адипоциты и масляную фракцию, так как его липкие частицы оседают на стенках емкости с липоаспиратом и смешиваются со стромально-васкулярной фракцией при ее извлечении.

Технический результат: получение очищенной стромально-васкулярной фракции жировой ткани с сохранением количества клеток в конечном продукте путем исключения смешивания компонентов; простота применения.

Указанный результат достигается путем установки в емкость инъекционной иглы перед центрифугированием липоаспирата таким образом, чтобы кончик иглы доходил до дна емкости, а канюля иглы находилась выше верхнего края емкости; ресуспендированием осадка после первого центрифугирования путем добавления 2 мл физиологического раствора натрия хлорида в емкость через предустановленную иглу, а также аспирированием стромально-васкулярной фракции после второго центрифугирования из нижней части емкости через иглу, соединенную со шприцом.

Способ осуществляют следующим образом: в пустую стерильную емкость, например, в пробирку, устанавливают инъекционную иглу, так чтобы кончик иглы доходил до дна емкости, а канюля иглы находилась выше верхнего края емкости, затем в эту емкость помещают эмульгированный механическим либо ферментативным способом липоаспират в объеме 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугируют при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут с помощью лабораторной центрифуги 80-2S Apex Lab (Китай). После первого цикла центрифугирования проводят ресуспендирование осадка путем добавления через предустановленную иглу в емкость с липоаспиратом 2 мл физиологического раствора натрия хлорида для перемешивания компонентов нижней части липоаспирата. Объемы липоаспирата и физиологического раствора натрия хлорида соотносятся как 2:1 и были подобраны эмпирическим путем. Далее производят второй цикл центрифугирования при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут с помощью лабораторной центрифуги 80-2S Apex Lab (Китай).

На фиг. 1 представлен результат повторного центрифугирования. В верхней части пробирки располагается жировая фракция, в ее дне - стромально-васкулярная фракция, которая не смешивается с жировой фракцией и легко достижима для аспирации предустановленной в пробирку иглой.

После окончания повторного центрифугирования стромально-васкулярную фракцию аспирируют через предустановленную иглу из нижней части емкости через иглу, соединив ее со шприцом.

Данная методика позволяет получить очищенную стромально-васкулярную фракцию из емкости с липоаспиратом, исключив смешивание компонентов липоаспирата, сохранив максимально возможное количество клеток стромально-васкулярной фракции в конечном продукте.

Примеры конкретного выполнения:

Пример 1. Липоаспират отмыли физиологическим раствором натрия хлорида от клеток крови. Затем провели его ферментативную обработку раствором коллагеназы. В стерильную вакуумную пробирку без наполнителя (ПЭТФ, 13×100 мм, тип пробки SCA) объемом 6 мл была установлена инъекционная игла (В. Braun Sterican, игла одноразовая стерильная 21G (0,8×120 мм)), кончик которой доходил до дна пробирки. В пробирку в анаэробных асептических условиях поместили отфильтрованный липоаспират объемом 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования липоаспират разделился на 3 основные фракции, в верхней части - адипоциты в виде конгломератов с соединительно-тканными перемычками, в средней - физиологический раствор с клетками крови, в нижней части - стромально-васкулярная фракция с обилием эритроцитов. Затем осадок ресуспендировали, то есть через иглу, находящуюся в пробирке, ввели 2 мл физиологического раствора натрия хлорида, осадок тщательно перемешали вращательными движениями иглы, не открывая пробирки. После этого липоаспират вновь центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Микроскопия мазков полученной стромально-васкулярной фракции с окраской по Май Грюнвальду показала, что адипоцитов в полученных мазках не наблюдалось, что говорит об отсутствии жировой примеси в полученной стромально-васкулярной фракции, то есть ее чистоте. Всего в 50 мкл жидкости было получено около 8500 клеток, имеющих морфологию фибробласта, то есть 170 фибробластоподобных, то есть потенциально мезенхимальных стромальных, клеток на 1 мл фракции, а объем полученной стромально-васкулярной фракции составил 0,1 мл с 1 мл жировой эмульсии.

Пример 2. Липоаспират отмыли физиологическим раствором натрия хлорида от клеток крови. Затем провели его фильтрацию анаэробными клеточными трансферами с внутренним диаметром отверстий 1,4 мм и 1,2 мм поочередно, затем эмульгирующим сетчатым клеточным фильтром с диаметром отверстий 0,5 мм, с помощью 30 пассажей липоаспирата через каждый клеточный фильтр. В стерильную вакуумную пробирку без наполнителя (ПЭТФ, 13×100 мм, тип пробки SCA) объемом 9 мл была установлена инъекционная игла (В. Braun Sterican, игла одноразовая стерильная 21G (0,8×120 мм)), кончик которой доходил до дна пробирки. В пробирку в анаэробных асептических условиях поместили отфильтрованный липоаспират объемом 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования липоаспират разделился на 3 основные фракции, в верхней части - адипоциты в виде конгломератов с соединительно-тканными перемычками, в средней - физиологического раствора натрия хлорида с клетками крови, в нижней части - стромально-васкулярная фракция с обилием эритроцитов. Затем осадок ресуспендировали, то есть через иглу, находящуюся в пробирке, ввели 2 мл физиологического раствора натрия хлорида, осадок тщательно перемешали вращательными движениями иглы, не открывая пробирки. После этого липоаспират вновь центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут. После центрифугирования на дне пробирки осели белые хлопья, которые при помощи иглы забрали шприцом объемом 5 мл через предустановленную иглу. Для примерного подсчета количества фибробластоподобных клеток жидкость нанесли на предметное стекло в объеме 50 мкл и фиксировали формалином. Далее мазки окрасили по Май Грюнвальду и произвели подсчет всех клеток, имеющих морфологию фибробласта. Фибробластоподобные клетки находились в основном группой в количестве 30-50 штук и были связаны между собой небольшими соединительнотканными перемычками, что говорит о выделении также и остатков соединительной ткани. Адипоцитов в полученных мазках не наблюдалось, что говорит об отсутствии жировой примеси в полученной стромально-васкулярной фракции, то есть ее чистоте. Всего определялось примерно 150 фибробластоподобных, то есть потенциально мезенхимальных стромальных, клеток на 1 мл полученной стромально-васкулярной фракции, а объем полученной стромально-васкулярной фракции составил 0,1 мл с 1 мл жировой эмульсии.

Пример 3. Липоаспират отмыли физиологическим раствором натрия хлорида от клеток крови. Затем провели его фильтрацию анаэробными клеточными трансферами с внутренним диаметром отверстий 1,4 мм и 1,2 мм поочередно с помощью 30 пассажей липоаспирата через каждый, затем эмульгирующим сетчатым клеточным фильтром с диаметром отверстий 0,5 мм с помощью 10 пассажей. В стерильную вакуумную пробирку без наполнителя (ПЭТФ, 13×100 мм, тип пробки SCA) объемом 9 мл была установлена инъекционная игла (В. Braun Sterican, игла одноразовая стерильная 21G (0,8×120 мм)), кончик которой доходил до дна пробирки. В пробирку в анаэробных асептических условиях поместили отфильтрованный липоаспират объемом 4 мл. Далее емкость с липоаспиратом центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования липоаспират разделился на 3 основные фракции, в верхней части - адипоциты в виде конгломератов с соединительно-тканными перемычками, в средней - физиологического раствора натрия хлорида с клетками крови, в нижней части - стромально-васкулярная фракция с обилием эритроцитов и частицами фрагментированных соединительнотканных волокон. Затем осадок ресуспендировали, то есть через иглу, находящуюся в пробирке, ввели 2 мл физиологического раствора натрия хлорида, осадок тщательно перемешали вращательными движениями иглы, не открывая пробирки. После этого липоаспират вновь центрифугировали при 2000 оборотах в минуту в течение 15 минут. После центрифугирования на дне пробирки осели белые хлопья, которые при помощи иглы забрали шприцом объемом 5 мл через предустановленную иглу. Для примерного подсчета количества фибробластоподобных клеток жидкость нанесли на предметное стекло в объеме 50 мкл и фиксировали формалином. Далее мазки окрасили по Май Грюнвальду и произвели подсчет всех клеток, имеющих морфологию фибробласта. Фибробластоподобные клетки находились в основном группой в количестве 40-50 штук и были связаны между собой небольшими соединительнотканными перемычками, что говорит о выделении также и остатков соединительной ткани. Адипоцитов в полученных мазках не наблюдалось, что говорит об отсутствии жировой примеси в полученной стромально-васкулярной фракции, то есть ее чистоте. Всего определялось примерно 160 фибробластоподобных, то есть потенциально мезенхимальных стромальных, клеток на 1 мл полученной стромально-васкулярной фракции, а объем полученной стромально-васкулярной фракции составил 0,1 мл с 1 мл жировой эмульсии.

Таким образом, предлагаемый способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани является применимым в области практического здравоохранения, так как может быть воспроизведен неоднократно, позволяет получить стромально-васкулярную фракцию без использования ферментов и иных реактивов, повышая доступность и снижая себестоимость процедуры. Полученная механическим способом стромально-васкулярная фракция может быть использована в регенеративной медицине для ускорения репарации кожи и мягких тканей, усиления регенерации хрящей и суставных поверхностей, при лечении заболеваний опорно-двигательной системы.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани путем забора липоаспирата, его эмульгирования и двойного центрифугирования. Изобретение позволяет получать очищенную стромально-васкулярную фракцию жировой ткани с сохранением количества клеток в конечном продукте. 1 ил., 3 пр.

Способ получения стромально-васкулярной фракции жировой ткани путем забора липоаспирата, эмульгирования его механическим способом, двойного центрифугирования, ресуспендирования нижней части липоаспирата, отличающийся тем, что перед центрифугированием в пустую емкость устанавливают инъекционную иглу таким образом, чтобы кончик иглы доходил до ее дна, а канюля иглы находилась выше верхнего края емкости, затем в емкость помещают липоаспират в объеме 4 мл; после первого центрифугирования осадок ресуспендируют путем добавления 2 мл физиологического раствора натрия хлорида в емкость через иглу, после второго центрифугирования аспирируют стромально-васкулярную фракцию из нижней части емкости через иглу, соединив ее со шприцом.