Способ определения аденозинтрифосфорной кислоты в крови Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

1

Изобретение относится к технике определения аденозинтрифосфорной киспоты (АТФ) в крови и может быть использовано в биохимических анализах в научно-исследовательских и клинических лабораториях, преимущественно при изучении отдельных звеньев адениловой системы.

Наиболее близким решением к изобретению является способ определения АТФ в крови путем приготовления безбелкового центрифугата пробы с последукяцим добавлением в реакционную смесь гексокиназы. Точность известного способа 10-15% U.

Недостатком известного способа является его сложность, так как методика определения АТФ основана да многостадийности приемов и на многократном измерении оптических плотностей. Кроме того, для определения АТФ требуются дорогостоящие реактивы и оборудование.

Цель изобретения - упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения АТФ в крови путем приготовления безбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, в реакционной смеси определяют глюкозу ,глюкозооксидаз:шм методом после добавления гексокиназы и без ее добавления,- полученные образцы колорш трируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ определяют по формуле

,

ti

F

ст

где С - концентрация АТФ, мг.% , К - коэффициент пересчета АТФ; зКстинкция контрольной пробы Eg- экстинкция пробы после добавления гексокиназы. Е..- экстинкция стандартного раствора. Способ осуществляют следукяцим образом. Количественное определение ЛТФ проводится по уменьшению содержания глюкозы в эритроцитах, происходящее вследствие реакции глюкоза + АТФ - -у глюкозо-6-фосфат + АТФ. Процесс катализируется ферментом гексокиназой. Концентрацию АТФ вычисля эт по фор муле где С - количество АТФ, мг %, К - коэффициент пересчета АТФ} экстинкция контрольной пробы Е - экстинкция пробы после добавления гексокиназы; EL.- экстинкция стандартного ра створа Количество глюкозы определяют г козооксидазньм методом. Определение содержания АТФ в эр троцитах проводится следукщим образом. Взятую кровь переносят в охлажденную до 2-4С пробирку, содержащую 3-4 капли раствора гепарина. Ц трифугируют при 4-2°С Ш мин при 2500-3000 об/мин. Плазма отсасывается и выбрасывается. Пробирки пом щаются в ледяную баню. К уплотненн му осадку эритроцитов в пробирке добавляется двукратный объект 15%го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ. Через 0 мин вторично центрифугируют 10 мин при 3000 об/м Последукнцие этапы анализа проводят с надосадочной жидкостью. В опытную пробу берут 4 мл 0,05 М раство ра триэтаноламиновогоСТЭА буфера (рН 7,5-7,6), 0,35 мл 0,1 М раствора MgClj, 0,4 мл беэбелкового центрифугата. Содержимое пробирок доводят, до рН 7,4 1-2-мя кагшями 5 М раствора КлСО. Затем добавляют 0,05 мл I,О-1,5%-ного раствора гексокиназы. Аналогичную процедуру проводят с контрольной пробой, где вместо раствора гексокиназы берут 0,05 мл ТЭА-буфера. Контрольную и опытную пробу ставят в термостат на 20-30 мин при 37 С. Затем в пробах определяют со904 держание глюкозы. Для этого в две i пробирки (контроль и опыт) берут 4,5 мл дистиллированной воды, добавляют по 3 мл дианизидинового реактива (к 50 мл 0,4 М калий-фосфатного буфера при рН 5,9 приливают 1 мл }%-ного спиртового раствора 0-дианизидина и доводят водой до 100 мл, реактив готовится в день анализа), В контрольную и опытную пробирку приливают по 0,3 мл раствора из соответствующих пробирок предыдущего этапа анализа, добавляют по 0,1 мл свежеприготовленного 0,1%-ного раствора глюкозооксидазы, 0,1 мл свежеприготовленного 0,1%-ного раствора пероксидазы или 0,5%-ного раствора гемоглобина и инкубируют 30 мин при 45°С. После инкубации в пробирки добавляют по 2 мл 50%-ного раствора серной кислоты. Одновременно готовят стандартный раствор 4,7 мл дистиллированной воды, 3 мл дианизидинового реактива, 0,03 мл 100 мг%-ного раствора глюкозы, 0,1 мл 0,1%-ного раствора глюкозооксидазы,0,1 мл р,1%-ного раствора пероксидазы инкубируют 30 мин при 45С. После инкубации добавляется 2 мл 50%-ного раствора серной кислоты. После охлаждения содержимого пробирок до комнатной температуры измеряется экстинкция растворов на фотоэлектроколориметре в кювете с расстоянием между рабочими гранями 10мм. Измерение оптической плотности ведется против компенсационной жидкости, содержащей 5 мл воды, 3 мл дианизидинового реактива и 2 мл 50%-ного раствора серной кислоты, при ,зеленом светофильтре. Расчет содержания проводят по приведенной формуле, при этом минимальное содержание АТФ по предлагаемому способу равно 15% и точность определения АТФ 12-14%. По предлагаемому способу проведено 65 исследований содержания АТФ в эритроцитах крыс. Исследование проводилось с 13 здоровыми животными (контрольная группа) и с 52 крысами, отравленными свинцом. В контрольной группе получено следукяцее содержание АТФ в эритроцитах, мг%: 37,5; 44,5; 48,7; 50,5; 55,4; 60,8; 69,0; 70,9; 86,2; 94,0; 101,4; 111,5; 114,1. Среднее содержание АТФ 72,7 мг /%.

Средняя ошибка среднего арифметического ±7,4 мг %.

Среднеквадратическое отклонение ±26,5 мг %.

Коэффициент вариации 36,5%.

Отмеченную вариабельность следует отнести за счет индиврщуальных особенностей животного, в частности

за счет различного уровня обмена в эритроцитах на момент декатизации крыс,

Результаты определения содержания АТФ в зритроцитах у крыс, отравленных свинцом, в различные периоды после оконяания затравки приведены в таблице.

13 Примечани М - среднее арифметич ка среднего, арифметич квадратическое отклон Таким образом, концентрация АТФ в зритроцитах крыс контрольной группы составляет 77 мг %. В последние сроки развития свинцовой интоксикации уровень АТФ в эритроцитах белых крыс повьшается. Пример. Свежевзятую кровь лабораторного животного (крысы) 4-8 мл помещают в охлажденную до и смоченную гепарином пробирку. Для выделения эритроцитов пробу кро ви центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин. Отделившуюся в результате центрифугирования плазму отсасывают. Для осаждения белков зритро циты смешивают с предварительно охлажденным 15%-ным раствором ТХУ в соотношении 1:1 (1,5 мл эритроцитов и 1,5 мл ТХУ), и пробирку помещают на 10 мин в ледяную баню, после чего вторично центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин. Полученный безбелковый центрифугат собирают в чистую пробирку. Для проведения гексокиназной реaKiyiH в две пробирки (контроль и опыт) приливают реактивы. Затем обе пробирки помещают в термостат при 37 С на 20 мин. В результате до бавления раствора гексокиназы в опы ной пробирке протекает гексокина13

13 - число наблюдений; i m - средняя ошибо-, г - средне.. гексокиназа ная реакция: глюкоза + АТФ п-т-г люкозо-6-фосфат + АТФ, в результае которой расходуется глюкоза, соержащаяся в зритроцитах. В контрольт ой пробирке уровень глюкозы не измеяется, так как в реагирующей систее отсутствует гексокиназа. Используемый ТЭА-буфер (0,05 м, рН 7,5-7,6) готовят следующим образом. 4,65 г гидрохлорида триэтанол- амина растворяют в 200 мл дистиллированной воды и добавляют 11 мл 1н. раствора NaOH, затем полученный раствор доводят дистиллированной водой до 500 мл. После термостатирования определяют содержание глюкозы в контрольной и опытной пробирках глюкозооксидазным способом. Для этого из контрольной и опытной пробирок берут по 0,3 мл содержащегося в них раствора и приливают в пробирки, в которые предварительно внесено по 4,5 мл дистиллированной воды и 3,0 мл-дианизидинового реактива. Затем проверяют рН и при необходимости доводят до 5,9, и приливают в обе пробирки по О,1 мл 0,1%-ного раствора глюкс)зооксидазы и 0,1%-ного раствора пероксидазы. Одновременно