ЭКЗОСОМА, ВЫДЕЛЕННАЯ ИЗ СЕПТАЛЬНОГО ХРЯЩА, ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/77 A61K35/28 A61K47/36 A61K47/10 A61P19/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к композиции, которая используется для получения хряща и продуцируется микровезикулами, которые высвобождаются клетками, выделенными из септального хряща, в среду.

Уровень техники

Хрящ представляет собой гибкую, твердую и белую ткань, которая выполняет функцию кости в некоторых органах. У большинства примитивных и развитых позвоночных скелет эмбриона состоит из хряща. В организме взрослого человека имеются хрящевые участки в носу, гортани и ушах. Хрящ также служит в качестве «подкладки», покрывающей поверхности костей, которые образуют сустав, обращенные друг к другу. Суставной хрящ может повреждаться и разрушаться различными путями. Это приводит к развитию дегенеративного заболевания суставов, называемого остеоартритом или артрозом [1]. Остеоартрит представляет собой невоспалительное, хроническое и дегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующим разрушением хряща, образованием остеофитов и субхондральным склерозом, особенно в несущих нагрузку суставах. При этом заболевании, которое также называют дегенеративным артритом, остеоартрозом или гипертрофическим артритом, происходит постепенная потеря суставного хряща [2].

В отличие от кости, для хряща не требуется вступать в прямой контакт с костью, чтобы оставаться жизнеспособным. Когда тканевые жидкости достигают фиброзного матрикса хряща, то хондробласты получают питание и, в отличие от аллопластических имплантатов, им не нужно встраиваться в ткани. Таким образом, его можно легко использовать в области носового гребня и даже в субэпителиальных карманах. Для этой цели можно использовать готовые к применению хрящи или септальный, конхальный или реберный хрящ. Хрящу можно легко придать форму, и его можно использовать как в качестве опоры, так и в качестве заполняющего материала для мелких дефектов и неровностей краев носа за счет его гибкой структуры. Большинство используемых хрящевых трансплантатов являются аутологичными. Свежие или хранящиеся гомологичные хрящи и подвергшиеся облучению гетерологичные хрящи использовались в течение многих лет, но их применение сократилось, поскольку со временем они подвергаются рассасыванию [3]. Септальный хрящ, аваскулярный и реберный хрящ широко используются при дефектах мягких тканей в области головы и шеи и для замены в процедурах реконструкции носа.

В исследованиях по тканевой инженерии предпринимались попытки получить хрящ in vitro и in vivo посредством посева подходящих клеток на подходящие каркасы из резорбированного биоматериала. Кроме того, тканевая инженерия септального хряща человека для замещения мягких тканей в области головы-шеи потенциально может принести клиническую пользу в ближайшем будущем [4].

При потере хряща способность ткани к самовосстановлению очень ограничена. Несмотря на то, что имеет место ограниченное восстановление, образовавшаяся ткань представляет собой волокнистый хрящ, который не обладает теми же биомеханическими свойствами, что и первоначальный суставной хрящ. Следовательно, цель тканевой инженерии хрящевой ткани состоит в том, чтобы полученный искусственный хрящ имел те же биомеханические свойства, что и нормальный суставной хрящ [5]. Результаты проведенных клинических испытаний показали, что способы, используемые для восстановления хряща, дают краткосрочные и среднесрочные результаты. В настоящее время проводятся обширные исследования в области тканевой инженерии второго поколения для восстановления хрящевой ткани. Исследуются различные подходы и новые способы, которые обеспечат артроскопическую имплантацию клеток и, таким образом, снизят заболеваемость. С использованием ни одного из многочисленных способов, доступных на сегодня, невозможно стабильно воспроизвести нормальный гиалиновый хрящ, и наилучшее долгосрочное лечение все еще остается неизвестным [6]. Результаты биомеханических испытаний доказали, что биомеханические свойства тканеинженерного хряща сопоставимы со свойствами нормального септального хряща [4, 7].

Современные способы лечения дефектов хряща включают хирургические вмешательства (например, микротрещины, мозаичную пластику, тканевую инженерию, включая усовершенствованные каркасы и каркасы из биоматериалов миметиков), трансплантацию клеток (имплантаты стволовых клеток или хондроцитов), таргетную терапию и терапию, модифицирующую заболевание (противовоспалительные средства) [8].

Проблемы, встречающиеся на предшествующем уровне техники, можно обобщить следующим образом:

- воспаление и иммунный ответ на материалы, которые используются в получении хряща, тканевой инженерии, терапевтических исследованиях и эстетической трансплантации хряща, образовании хряща и заполнении хряща, которые возникают в организме и клетках, ограничивают применение этих материалов;

- недостаточная активность этих материалов в образовании хряща;

- в исследованиях, в которых проводится клеточная терапия, последующие осложнения, которые будут вызваны клетками, остаются неизвестными;

- краткосрочные эффекты лечения неадекватны в долгосрочной перспективе.

В заявке на Европейский патент под номером EP2551342 (одна из заявок предшествующего уровня) раскрывается способ индукции дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток нижней носовой раковины человека в хрящевые клетки, костные клетки, нервные клетки или жировые клетки. Способ по настоящему изобретению представляет собой способ выделения и культивирования хрящевых клеток.

В заявке на Европейский патент под номером под номером EP3145514 (одна из заявок предшествующего уровня) раскрывается композиция для регенерации костей, хрящей, зубов и пародонта. Посредством введения композиции, разработанной в указанном изобретении, стимулируется/стимулируются рост костей и/или хрящей для лечения переломов костей и повреждения хряща. В экспериментальном исследовании, проведенном для разработки изобретения, стволовые клетки, выделенные из пульпы зуба, культивируют на чашках Петри в культуральной среде DMEM.

В заявке на Европейский патент под номером EP1926507 (одна из заявок предшествующего уровня) раскрывается имплантат для восстановления дефектов хряща и способ получения указанного имплантата. Имплант представляет собой тело имплантата из естественной хрящевой ткани, покрытое аутологичными клетками, обладающими хондрогенным потенциалом. Эти клетки получают посредством пролиферации клеток in vitro, начиная с хондроцитов, выделенных при биопсии хряща.

В заявке на патент США под номером US2017296590 (одна из заявок предшествующего уровня) раскрывается композиция для индукции дифференцировки хондроцитов или регенерации хрящевой ткани. Композиция по указанному изобретению включает экзосомы, полученные из стволовых клеток, дифференцирующихся в хондроциты. В указанном изобретении жировые стволовые клетки дифференцируются в хондроциты, и экзосомы выделяют из хондроцитов.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является индукция образования хряща из экзосом, выделенных из септального хряща, для применения в эстетических и терапевтических целях.

Другой целью настоящего изобретения является получение хряща, который не вызывает иммунного ответа, воспаления, токсичности и раздражения в организме и клетках благодаря своим противовоспалительным свойствам.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение хрящевой ткани, используемой для лечения дефектов хрящевой ткани, таких как остеоартрит или артроз, из экзосомы, выделенной из септального хряща, поскольку она индуцирует образование хряща, а также подавляет воспалительную реакцию.

Подробное описание изобретения

«Экзосома, выделенная из септального хряща, использованная для получения хрящевой ткани», разработанная для достижения целей настоящего изобретения, показана на прилагаемых фигурах.

На фиг. 1 приведено графическое представление оценки влияния введения экзосом, полученных из септальных клеток, в стволовые клетки в различных концентрациях в течение 24, 48 и 72 ч, на жизнеспособность клеток с использованием МТТ-теста.

На фиг. 2 приведено графическое представление оценки влияния экзосом, полученных из септальных клеток и среды для дифференцировки хряща, на уровни экспрессии генов CD44 (a) и SOX9 (b) введением в различных концентрациях в стволовые клетки.

На фиг. 3 приведено графическое представление оценки апоптотического эффекта экзосом, полученных из септальных клеток, на клетки введением в различных концентрациях в стволовые клетки (a1 - введение только экзосом, полученных из септальных клеток (100%), a2 - введение только экзосом, полученных из септальных клеток (50%), a3 - введение только экзосом, полученных из септальных клеток (25%), a4 - клетки, культивированные только при введении клеточной среды, b- графическое представление a1, a2, a3, a4 (фиг. 3).

На фиг. 4 показана экзосома из септальной клетки (а), смесь экзосомы/среды для дифференцировки хряща (1:1) (b), изображение окрашивания альциановым синим клеток, обработанных средой для дифференцировки хряща, в течение 10 суток (c) и вариант с использованием контроля (d) с помощью светового микроскопа.

На фиг. 5 приведено графическое представление влияния экзосомы из септальных клеток на лейкоциты, активированные аллергеном пыльцы (а) и аллергеном клещей (b) по предлагаемому изобретению (график определения CD4 хелперных T-лимфоцитов, CD8 T-лимфоцитов, CD19 B-лимфоцитов и CD56 естественных клеток-киллеров с антителами, которые являются поверхностными маркерами, с помощью устройства для проточной цитометрии).

На фиг. 6 приведено графическое представление влияния экзосомы из септальных клеток на лейкоциты, активированные IL2 (a) и PHA (b), по предлагаемому изобретению (график определения CD4 хелперных T-лимфоцитов, CD8 T-лимфоцитов, CD19 B-лимфоцитов и CD56 естественных клеток-киллеров с антителами, которые являются поверхностными маркерами, с помощью устройства для проточной цитометрии).

Предлагаемое изобретение относится к разработке композиции, продуцированной микровезикулами, которые высвобождаются клетками, выделенными из септального хряща, для получения хрящевой ткани. При осуществлении изобретения используются стволовые клетки септального хряща. Установлено, что микровезикулы, полученные из хрящевых клеток, оказывают влияние на дифференцировку хрящевых стволовых клеток. Эффективный диапазон этих микровезикул определяется как 5-100% по объему. Микровезикулы можно растворить в растворе из dH2O, EtOH, среды для культивирования клеток, PBS, ДМСО и их смесей. Выделение этих экзосом из клетки, полученной из хряща, придает таким экзосомам способность образовывать хрящ, который также обладает свойством стволовых клеток подавлять воспаление. Следовательно, тот факт, что эти экзосомы усиливают образование хряща и подавляют воспаление, был экспериментально доказан и показан на фигурах. Благодаря таким свойствам эти экзосомы можно использовать в лечении повреждений хряща и заболеваний, связанных с иммунной системой.

Одним из отличий композиции по настоящему изобретению относительно предшествующего уровня техники является применение клеток, выделенных из септального хряща, и это существенное отличие, как с точки зрения того, откуда они выделены, так и с точки зрения применения специфически других типов клеток. Кроме того, в рамках настоящего изобретения, используются экзосомы, которые представляют собой специфический компонент этих клеток. Эти экзосомы представляют собой только часть химических веществ, которые выделяются клетками за пределы клетки. В рамках настоящего изобретения применение экзосом из септальных клеток усиливает образование хрящевой ткани и не вызывает какого-либо воспаления, даже если они не являются аутологичными. Такие экзосомы, полученные из стволовых клеток, обладающих свойством стволовых клеток подавлять иммунитет, не вызывают воспаления, хотя они не являются аутологичными, и также подавляют возникающее воспаление (фиг. 5 и 6). В рамках настоящего изобретения, выделяют экзосомы, высвобождаемые в среду недифференцированными септальными клетками, которые не подвергаются воздействию каких-либо химических веществ.

Экзосомы, выделенные из септального хряща, индуцируют образование хрящевой ткани для применения в лечении дефектов хрящевой ткани, таких как остеоартрит, воспаление реберно-хрящевого сустава, синдром Титце или артроз; и благодаря своим противовоспалительным свойствам они способствуют образованию хрящевой ткани, которая не вызывает иммунного ответа, воспаления, токсичности и раздражающего эффекта в организме и клетках. Способ получения хрящевой ткани из таких экзосом, выделенных из септального хряща, по настоящему изобретению включает стадии:

- культивирование хрящевых клеток в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, обедненной экзосомами (Invitrogen) и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль) в инкубаторах для культивирования клеток при температуре 37°C с 5% CO₂;

- использование раствора для выделения экзосом, содержащего двухфазную систему ПЭГ-декстран, для выделения микровезикул из клеток в культуральную среду;

- центрифугирование среды, собранной из культуральной среды, при 300 g в течение 10 мин для удаления отработанных клеток;

- перенос супернатанта в новую пробирку и центрифугирование при 14000 g в течение 30 мин для удаления возможных клеточных компонентов;

- перенос супернатанта в новую пробирку, добавление в нее раствора ПЭГ-декстран в объемном соотношении 1/1, центрифугирование при 1000 g в течение 10 мин, и затем сбор экзосом, оставшихся в нижней фазе;

- введение раствора для дифференцировки хряща в экзосому из септального хряща через день в течение 10 суток;

- получение хрящевой ткани в результате дифференцировки.

Экспериментальные исследования

1. Токсичность

После того, как клетки высеяли в 96-луночные культуральные планшеты (Corning Glasswork, Corning, NY) из расчета 5000 клеток/лунку в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, обедненной экзосомами (Invitrogen), и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль) в культуральной среде, на сутки 1, 2 и 3 определяли уровень жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток определяли с использованием МТТ-теста с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил))-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолием (CellTiter96 A WaterOne Solution; Promega, Southapton, Великобритания). 10 мкл раствора МТТ добавляли к клеткам в 100 мкл среды и инкубировали при 37ºC в темноте в течение 2 ч. После процесса инкубации оценивали жизнеспособность клеток измерением оптической плотности с помощью микропланшетного ридера для ELISA (Biotek, Winooski, VT) при длине волны 490 нм.

2. Дифференцировка хряща

Клетки высевали в 6-луночные культуральные планшеты (Corning Glasswork, Corning, NY) из расчета 50000 клеток/лунку в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, обедненной экзосомами (Invitrogen), и 1% PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Израиль) в культуральной среде. На следующие сутки экзосомы из септального хряща и раствор для дифференцировки, известный по литературным данным как используемый для дифференцировки хряща, вводили через день в течение 10 суток.

Сравнивали влияние среды, использованной для дифференцировки хряща, и экзосом, полученных из септальных клеток, на дифференцировку хряща, и было показано, что экзосомы являются более эффективными (фиг. 3, 4 и 5).

3. ПЦР в режиме реального времени

Культивированные клетки могут терять свои свойства и приобретать новые свойства. Эти свойства могут проявляться как на морфологическом уровне, так и на уровне экспрессии генов. Для установления изменений уровня экспрессии генов использовали метод ПЦР в режиме реального времени. Выделяли общую РНК и синтезировали кДНК из клеток, которые высевали в 6-луночные культуральные планшеты (Corning Glasswork, Corning, NY) из расчета 50000 клеток/лунку в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM). Синтезированные кДНК смешивали с праймерами в смеси Fermentas Maxima SYBR Green таким образом, чтобы конечный объем составлял 20 мкл, и анализировали уровни экспрессии генов с использованием устройства BIO-RAD.

Преимущества способа по предлагаемому изобретению для получения хрящевой ткани из экзосом, выделенных из септального хряща, можно обобщить следующим образом:

Стимулирует образование хряща.

Имеет свойство подавлять воспаление.

Не вызывает воспаления.

Не вызывает токсичности в клетках.

Может метаболизироваться в клетке после использования.

Может использоваться в лечении остеоартроза и артроза.

Может использоваться в лечении дефектов хрящевой ткани.

Может использоваться при реконструкции носа.

Обладает высоким потенциалом к образованию хрящевой ткани в эстетических и терапевтических целях.

Может использоваться в качестве эффективного средства в тканевой инженерии.

Не вызывает иммунного ответа в организме и клетках, воспаления, токсичности и раздражающего эффекта за счет своих противовоспалительных свойств.

Может использоваться при аутоиммунных заболеваниях за счет своей иммуносупрессорной активности.

Может использоваться при лечении ревматоидного артрита благодаря своим свойствам, способствующим образованию хряща и подавлению воспалительной реакции.

Ссылки

1. Deans R. J. & Moseley, A. B. (2000). Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental hematology, 28(8), 875-884.

2. Doral M. N., Dönmez G., Atay Ö. A., Bozkurt M., Leblebicioğlu G., Üzümcügil A., & Aydoğ, T. 2007. “Dejeneratif eklem hastalıkları”, TOTBİD dergisi, 6, 56-65.

3. Dağlı A. Ş., Özdem C., Akalın Y., Ensari S. 1993. “Rinoplastide Biyomateryeller”, K.B.B. ve Baş Boyun Cerrahisi Dergisi, Cilt: l Sayı: 2.

4. Rotter N., Bonassar L. J., Tobias G., Lebl M., Roy A. K., Vacanti C. A. 2002. “Age dependence of biochemical and biomechanical properties of tissue-engineered human septal cartilage”, Biomaterials, 23(15), 3087-3094.

5. Şenköylü A., & Korkusuz, F. 2004. “Kıkırdak Onarımında Doku Mühendisliği Uygulamaları”, TOTBİD (Türk Ortopedi ve Travmatoloji Birliği Derneği) Dergisi, 3, 3-4.

6. Smith G. D., Knutsen G., & Richardson J. B. 2005. “A clinical review of cartilage repair techniques”, Bone & Joint Journal, 87(4), 445-449.

7. Haisch A., Duda G. N., Schroeder D., Gröger, A., Gebert C., Leder K., & Sittinger M. 2005. “The morphology and biomechanical characteristics of subcutaneously implanted tissue-engineered human septal cartilage”, European Archives of Oto-Rhino-Laryngology and Head & Neck, 262(12), 993-997.

8. Li M. H., Xiao R., Li J. B., & Zhu Q. 2017. “Regenerative approaches for cartilage repair in the treatment of osteoarthritis”, Osteoarthritis and cartilage, 25(10), 1577-1587.

Изобретение относится к тканевой инженерии, а именно к способу получения хрящевой ткани из экзосом, выделенных из стволовых клеток септального хряща. Культивируют хрящевые клетки в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, обедненной экзосомами, и 1% PSA в инкубаторах для клеточных культур. Для выделения экзосом используют раствор, содержащий двухфазную систему ПЭГ-декстран. Центрифугируют среду для удаления отработанных клеток и возможных клеточных компонентов. Собирают экзосомы. Экзосомы вводят в стволовые клетки вместе с раствором для дифференцировки хряща через день в течение 10 суток. Получают хрящевую ткань. Изобретение позволяет получать хрящ, который можно использовать для лечения дефектов хрящевой ткани, таких как остеоартрит или артроз, поскольку он вызывает образование хряща, а также подавляет воспалительную реакцию. 1 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ получения хрящевой ткани из экзосом, выделенных из стволовых клеток септального хряща, включающий стадии:

- культивирование хрящевых клеток в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, обедненной экзосомами, и 1% PSA в инкубаторах для клеточных культур;

- использование раствора для выделения экзосом, содержащего двухфазную систему ПЭГ-декстран, для выделения микровезикул из клеток септального хряща в культуральной среде;

- центрифугирование среды, собранной из культуральной среды, при 300g в течение 10 мин для удаления отработанных клеток;

- перенос супернатанта в новую пробирку и центрифугирование при 14000g в течение 30 мин для удаления возможных клеточных компонентов;

- перенос супернатанта в новую пробирку, добавление в нее раствора ПЭГ-декстран в объемном соотношении 1/1, центрифугирование при 1000g в течение 10 мин и затем сбор экзосом, оставшихся в нижней фазе;

- введение в стволовые клетки раствора для дифференцировки хряща и экзосомы, выделенной из стволовых клеток септального хряща, через день в течение 10 суток;

- получение хрящевой ткани в результате дифференцировки.

2. Способ по п. 1, где хрящевые клетки культивируют в инкубаторах для клеточных культур при температуре 37°C с 5% CO₂.