Способ диагностики in vitro болезни Шегрена Российский патент 2025 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине и диагностике in vitro, в частности к ревматологии, и может быть использовано в клинической практике для диагностики болезни Шегрена.

Болезнь Шегрена - системное аутоиммунное заболевание, для которого характерно развитие воспаления в экзокринных железах, преимущественно в слюнных и слезных, а также слизистых носа, верхних дыхательных путей, носоглотки и влагалища у женщин (Sjögren syndrome / P. Brito-Zerón, C. Baldini, H. Bootsma [et al.] // Nature reviews. Disease primers. - 2016. - Vol. 2. - P. 16047). В соответствии с классификационными критериями Американской коллегии ревматологов и Европейской лиги против ревматологических заболеваний для болезни Шегрена 2016 года, диагноз этой нозологической формы основан на объективных признаках сухого синдрома, выявлении анти-SSA/Ro антител и результатах гистологического исследования малой слюнной железы (2016 American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism Classification Criteria for Primary Sjögren's Syndrome: A Consensus and Data-Driven Methodology Involving Three International Patient Cohorts / C.H. Shiboski, S.C. Shiboski, R. Seror [et al.] // Arthritis & rheumatology (Hoboken, N.J.). - 2017. - Vol. 69, №1. - P. 35-45).

Проявления сухого синдрома могут отсутствовать на ранних стадиях заболевания. Проведение офтальмологического обследования с целью оценки конъюктивы и роговицы на амбулаторном этапе возможно только в условиях специализированных центров. На результаты оценивающих ксерофтальмию (тест Ширмера) и ксеростомию (скорость нестимулированной саливации) тестов влияют время суток, особенности образа жизни пациента, принимаемые лекарственные препараты. В 30% случаев в сыворотке крови пациентов с болезнью Шегрена не выявляются анти-SSA/Ro антитела, что не позволяет использовать лабораторный критерий для установления диагноза (Influence of the age at diagnosis in the disease expression of primary Sjögren syndrome. Analysis of 12,753 patients from the Sjögren Big Data Consortium / S. Retamozo, N. Acar-Denizli, I.F. Horváth [et al.] // Clinical and experimental rheumatology. - 2021. - Vol. 39 Suppl 133, №6. - P. 166-174). Биопсия малой слюнной железы - инвазивная процедура с рисками осложнений. Приготовление микропрепаратов из биопсийного материала длится несколько дней и для их оценки необходимо привлечения опытного морфолога (2016 American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism Classification Criteria for Primary Sjögren's Syndrome: A Consensus and Data-Driven Methodology Involving Three International Patient Cohorts / C.H. Shiboski, S.C. Shiboski, R. Seror [et al.] // Arthritis & rheumatology (Hoboken, N.J.). - 2017. - Vol. 69, №1. - P. 35-45). В 30% случаев морфологическая картина в малой слюнной железе у пациентов с болезнью Шегрена не соответствует критериям этого заболевания (Influence of the age at diagnosis in the disease expression of primary Sjögren syndrome. Analysis of 12,753 patients from the Sjögren Big Data Consortium / S. Retamozo, N. Acar-Denizli, I.F. Horváth [et al.] // Clinical and experimental rheumatology. - 2021. - Vol. 39 Suppl 133, №6. - P. 166-174).

В связи с встречаемостью в клинической практике больных болезнью Шегрена, не советующих критериям заболевания на момент проведения обследования, необходимы дополнительные параметры для установления этого диагноза. Было показано, что у пациентов с болезнью болезнь Шегрена изменяется качественный состав CD8+T-клеток крови. Согласно результатам научных исследований, количество активированных CD8+ T-клеток (CD38+ HLA-DR+ CD8+) и CX3CR1+CD8 Т-клеток у пациентов с болезнь Шегрена было больше в сравнении со здоровыми добровольцами (Akiyama, M. Significant association of CX3CR1+CD8 T cells with aging and distinct clinical features in Sjögren's syndrome and IgG4-related disease / M. Akiyama, K. Yoshimoto, Y. Kaneko // Clinical and experimental rheumatology. - 2023. - Vol. 41, №12. - P. 2409-2417; Alterations of CD8+ T cells in the blood and salivary glands of patients with primary Sjögren's syndrome / H. Li, Y. Zhou, P. Wang [et al.] // Clinical rheumatology. - 2023. - Vol. 42, №5. - P. 1327-1338). В другом опубликованном исследовании было показано уменьшение относительного и абсолютного числа субпопуляций Т-лимфоцитов Tc1 и Tc17.1 клеток при увеличении количества Tc2 и Tc17 клеток Т-лимфоцитов в крови пациентов с этим заболеванием (Circulating CD8+ T Cell Subsets in Primary Sjögren's Syndrome / I. Kudryavtsev, S. Benevolenskaya, M. Serebriakova [et al.] // Biomedicines. - 2023. - Vol. 11, №10).

Однако полученные в вышеуказанных исследованиях данные не могут быть использованы в клинической практике из-за отсутствия параметров диагностического теста необходимых для принятия решения об установлении диагноза.

Техническим результатом изобретения является повышение точности диагностики болезни Шегрена, снижение времени на диагностику и постановку диагноза в реальной клинической практике.

Заявленный технический результат достигается в способе диагностики болезни Шегрена, согласно которому в периферической крови пациента определяют относительное количество клеток субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов, при этом диагностируется болезнь Шегрена, если относительное количество клеток субпопуляции CD162dimTcyt > 25% и/ или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimTc2 > 30%; в противоположном случае проводится дополнительный анализ на определение относительного количества субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови пациента и болезнь Шегрена диагностируется, если относительное количество клеток субпопуляции CD162dimTc1 > 24% и/или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimTc17.1 > 22%.

Применение результатов иммунофенотипирования CD8+ Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов позволяет повысить точность диагностики болезни Шегрена, а также персонифицировать тактику лечения, повысить эффективность и безопасность проводимой терапии.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

У пациентов с подозрением на болезнь Шегрена проводится забор венозной крови путем пункции периферической вены с использованием вакуумных пробирок с содержанием K₃ЭДТА.

Для определения относительных значений CD8+ Т-лимфоцитов периферической крови используются антитела против CD3 и CD8 (Tcyt). Для анализа распределения Т-лимфоцитов по основным субпопуляциям применяют антитела против рецепторов CCR6 и CXCR3, с помощью которых выявляются следующие субпопуляции:

• Tc1 (фенотип CCR6-CXCR3+),

• Tc2 (фенотип CCR6-CXCR3-),

• Tc17 (фенотип CCR6+CXCR3-),

• Tc17.1 (фенотип CCR6+CXCR3+).

Далее путем использования антител против адгезионной молекулы CD162 выявляется пул клеток, способных к миграции в ткани с аутоимунным воспалением. В результате проведенного анализа выявляются субпопуляции CD162dimTcyt, CD162dimTc2, CD162dimTc17.1, CD162dimTc1 со сниженной экспрессией CD162.

Анализ проводят на проточном цитофлуориметре, например, «Navios™» («Beckman Coulter», США). Обработку цитофлуориметрических данных проводят при помощи программ, например, «Navios Software v.1.2» и «Kaluza™ v.1.3» («Beckman Coulter», США).

Количество CD162dimTc1, CD162dimTcyt, CD162dimTc2, CD162dimTc17.1 клеток выражается в виде процента от популяции Тс1, Тс17, Тс2, Тс17.1 лимфоцитов, соответственно. При значениях CD162dimTcyt > 25% или CD162dimTc2 > 30% или CD162dimTc17.1 > 22% или CD162dimTc1 > 24% диагностируется болезнь Шегрена.

Количественные значения, указанные для маркеров CD162dimТс1, CD162dimТсyt, CD162dimТс2, CD162dimТс17.1, следует понимать как «больше». Таким образом, если для маркера CD162dimТс1 приведено значение «от 24%», это значит, что значимым является содержание относительного количества клеток этой субпопуляции 24% и выше, например, 26%, 27,5% и так далее. То же самое действует в отношении CD162dimТс2, и значимым является относительное количество клеток этой субпопуляции от 30%, т.е. 35%, 38,3% и т.д. Значимым для диагностики является содержание CD162dimТсyt в образце от 25%, т.е. 26%, 30% и т.д. Значимым для диагностики является содержание CD162dimТс17.1 в образце от 22%, т.е. 25, 31% и т.д.

Все анализы крови на указанные показатели могут быть приведены традиционными или известными методами фенотипирования лимфоцитов, в частности, например, с помощью иммунофенотипирования и последующего использования метода проточной цитометрии.

Далее изобретение будет проиллюстрировано клиническими примерами, которые не ограничивают объем изобретения в какой-либо мере.

Пример 1

Пациентка Н., 66 лет, поступила в ФГБЦ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России с жалобами на периодическое появление артралгий мелких суставов кистей, коленных суставов, ощущение сухости в полости рта.

Из анамнеза заболевания, что с 2018 г. Наблюдается периодическое появление артралгий, артритов мелких суставов кистей, коленных суставов. В декабре 2020 г. Была проконсультирована ревматологом, было проведено дообследование, включающее лабораторный контроль антинуклеарного фактора. При лабораторном контроле титр антинуклеарного фактора (АНФ) составил 1:20480, была рекомендована терапия нестероидными противоспалительными препаратами (НПВС) по требованию. В дальнейшем отмечалось периодическое появление артралгий, артритов 1 раз в 3-4 месяца, которые разрешались на фоне приема НПВС. Весной 2023 г. появился неспецифический генерализованный болевой синдром, было отмечено немотивированное снижение массы тела, субфебрилитета. В связи с чем пациентка самостоятельно принимала НПВС - с временным положительным эффектом. С августа 2023 г. появилась общая, немотивированная слабость. Пациента была проконсультирована ревматологом, проведено дообследование, а иммено: тест Шимера, скорость нестимулированной саливации, СОЭ, С реактивный белок, скрининговый иммуноблоь. Были получены следующие результаты:

• Тест Ширмера: правый глаз < 5 мм, левый глаз - норма;

• Скорость нестимулированной саливации в норме;

• При лабораторном контроле скорость оседания эритроцитов (СОЭ) 77 мм/ч, С-реактивный белок 25,64 => 9,86 мг/л;

• В скрининговом иммуноблоте антинуклеарных антител выявлены антитела к двуспиральной ДНК (АТ к дДНК).

Согласно полученным результатам анализа была рекомендована терапия гидроксихлорохином 600 мг/сут с последующим уменьшением дозы до 400 мг/сут, так как было подозрение о системной красной волчанке или болезни Шегрена, но точный диагноз не был поставлен. С октября 2023 г. пациентка отмечала разрешение генерализованного болевого синдрома, уменьшение общей слабости при сохранении эпизодов болей в суставах, повышенных значений СРБ, СОЭ. В январе 2024 г. было проведено обследование с целью уточнения диагноза. Были получены следующие результаты:

• Тест Ширмера: правый глаз - 7 мм, левый глаз - 6 мм;

• Скорость нестимулированной саливации в норме;

• СОЭ 120 мм/ч;

• СРБ 9,6 мг/л;

• АНФ 1:1000;

• В скрининговом иммуноблоте антинуклеарных антител выявлены антитела к Nucleosomes 2+, AMA-M2 3+, АТ к дДНК в пределах нормы.

Также была выполнена биопсия малой слюнной железы, при гистологическом исследовании малой слюнной железы были выявлены изменения, которые соответствовали изменениям, наблюдающимся при болезни Шегрена.

Таким образом, у пациентки имеются клинические, лабораторные, гистологические признаки характерные для болезни Шегрена. Однако в соответствии с критериями ACR/EULAR 2016 года для этого заболевания диагноз болезни Шегрена не может быть установлен.

Методом проточной цитометрии периферической крови было проведено определение относительного количества клеточных субпопуляций Т-лимфоцитов, а именно CD162dimТс1, CD162dimТс2, CD162dimТсyt, CD162dimТс17.1. Были получены следующие результаты:

• CD162dimТсyt - 61,23%,

• CD162dimTc2 - 78,84%,

• CD162dimTc17.1 - 44,71%,

• CD162dimTc1 - 52,54%.

Согласно всем полученным результатам пациента был поставлен диагноз болезнь Шегрена и было назначено лечение упадацитинибом 15 мг/сут, на фоне регулярного приема которого в течение 2-3 месяцев отмечено разрешение болей в суставах, нормализация СОЭ, СРБ.

Пример 2

Пациентка Б, 29 лет, поступила в ФГБЦ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России с жалобами на боли в суставах, общую, немотивированную слабость.

Из анамнеза заболевания известно, что в январе 2023 г. начались боли в суставах, появилась общая, немотивированная слабость. В сентябре 2023 г. появились ощущения сухости в глазах, сухости кожи, а в ноябре 2023 г. - ощущения сухости в полости рта. В январе 2024 г. проведено обследование. Были получены следующие результаты:

• Тест Ширмера правый глаз - норма, левый глаз - норма;

• Скорость нестимулированной саливации в норме;

• Титр АНФ равен 1:640;

• В скрининговом иммуноблоте антинуклеарных антител выявлены антитела к SS-A (52 кДа) 3+, антитела к SS-A (60 кДа) 3+.

Методом проточной цитометрии периферической крови было проведено определение относительного количества клеточных субпопуляций Т-лимфоцитов, а именно CD162dimТс1, CD162dimТс2, CD162Тсyt, CD162dimТс17.1. Были получены следующие результаты:

• CD162dimТсyt - 37,65%,

• CD162dimTc2 - 48,7%,

• CD162dimTc17.1 - 22,3%,

• CD162dimTc1 - 36,29%.

На основании полученных данных пациентке был поставлен диагноз болезнь Шегрена в соответствии с критериями ACR/EULAR 2016 года для этого заболевания и предложенным способом диагностики.

Пациентке было назначено лечение лефлуномидом 20 мг/сут, гидроксихлорохином 200 мг/сут, на фоне регулярного приема которых пациентка отметила отсутствие болей в суставах, уменьшение общей слабости, ощущения сухости в глазах, кожи.

Пример 3

Пациентка Р., 71 год, поступила в ФГБЦ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России с жалобами на сухость слизистых оболочек.

Из анамнеза заболевания известно, что в 2015 г. появились артрит голеностопных суставов, продолжительная утренняя скованность в суставах, трёхфазный синдром Рейно. Пациентке был поставлен диагноз ревматоидный артрит, рекомендована терапия преднизолоном 20 мг/сут, азатиоприном, на фоне чего наблюдалось отсутствие проявлений суставного синдрома. Через 1 месяц приема азатиоприн был отменен. В 2016 г. пациентка отмечает постепенное увеличение площади эритематозных высыпаний на коже спины, сопровождаемых жжением. Была выполнена биопсия высыпного элемента. Со слов пациентки, при гистологическом исследовании биопсийного материала выявлены признаки, характерные для системной красной волчанки. После консультации с ревматологом диагноз был скорректирован с ревматоидного артрита на красную волчанку, была назначена терапия гидроксихлорохиином, с постепенным уменьшением дозы преднизолона. На фоне приема преднизолона 10 мг/сут, гидроксихлорохина 400 мг/сут в течение длительного времени состояние без отрицательной динамики.

Был произведен лабораторный контроль 22.03.2022 г., и получены следующие результаты:

• Титр АНФ составил 1:20480;

• АТ к дДНК - 155 Ед/мл при норме до 25;

• АТ к кардиолипину IgM - 49,8 MPL-U/ml.

В мае 2024 г. было проведено обследование, и получены следующие результаты:

• Тест Ширмера: правый глаз - 7 мм, левый глаз - 5 мм;

• Скорость нестимулированной саливации - 0,06 мл/мин;

• Титр АНФ составил 1:3200;

• В скрининговом иммуноблоте антинуклеарных антител выявлены антитела к SS-A (52 кДа) 2+, АТ к дДНК - норма, АТ к бета-2-гликопротеину I (IgA, IgM, IgG) - 47,41 Е/мл, АТ к кардиолипину IgM - 66,42 Е/мл, концентрация С4 фракции комплемента - 0,03 г/л.

Методом проточной цитометрии периферической крови было проведено определение относительного количества клеточных субпопуляций Т-лимфоцитов, а именно CD162dimТс1, CD162dimТс2, CD162dimТсyt, CD162dimТс17.1. Были получены следующие результаты:

• CD162dimТcyt - 22,66%,

• CD162dimTc2 - 34,82%,

• CD162dimTc17.1 - 17,78%,

• CD162dimTc1 - 22,58%.

В соответствие с проведенным обследованием и полученными результатами и на основании критериев ACR/EULAR 2016 года и предложенного способа диагностики диагноз пациентки был изменен на болезнь Шегрена.

В связи с пересмотром диагноза, разными подходами к терапии пациентке было рекомендовано начать постепенное уменьшение дозы преднизолона с целью уменьшения рисков побочных эффектов этой терапии. На фоне уменьшения дозы глюкокортикостероидов состояние пациентки отмечается как без ухудшения.

Изобретение относится к медицине и касается диагностики in vitro болезни Шегрена. Проводят анализ периферической крови пациента и определяют относительное количество клеток субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов: CD162dimТс2, CD162dimТсyt, CD162dimТс1, CD162dimТс17.1. Болезнь Шегрена диагностируют, если относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТс2 > 30%, и/ или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТсyt > 25%, и/или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТс1 > 24%, и/или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТс17.1 > 22%. Изобретение обеспечивает повышение точности диагностики болезни Шегрена, снижение времени на диагностику и постановку диагноза в реальной клинической практике. 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ диагностики in vitro болезни Шегрена, заключающийся в том, что проводят анализ периферической крови пациента и определяют относительное количество клеток субпопуляций CD8+ Т-лимфоцитов: CD162dimТс2, CD162dimТсyt, CD162dimТс1, CD162dimТс17.1, болезнь Шегрена диагностируют, если относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТс2 > 30%, и/ или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТсyt > 25%, и/или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТс1 > 24%, и/или относительное количество клеток субпопуляции CD162dimТс17.1 > 22%.

2. Способ диагностики in vitro болезни Шегрена по п.1, который проводят в автоматическом режиме, предпочтительно с применением проточного цитофлуориметра.