СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ МОЗГА Российский патент 2025 года по МПК A61B5/26 A61B5/275 

Изобретение относится к медицине и нейрофизиологии и может быть использовано для оценки факта и размеров повреждения головного мозга крыс в условиях экспериментального моделирования ишемического поражения мозга с использованием технологии нейровизуализации в режиме реального времени под постоянным контролем распределения температуры исследуемой поверхности.

В связи с высокой распространенностью цереброваскулярной патологии, проблема ишемического инсульта приобретает все большую значимость ввиду высокой степени летальности, частоты инвалидизации и социальной дезадаптации среди работоспособного населения. В патогенезе нарушения мозгового кровообращения центральным патогенетическим звеном является снижение реологических свойств крови, что, в свою очередь, вызывая дисциркуляторные нарушения, стаз, нарушения транспортировки кислорода, приводит к гипоксии и формированию зоны ишемии.

Сегодня существует несколько способов оценки объема гипоксического-ишемического повреждения мозга.

Известен способ нейровизуализации для оценки повреждения головного мозга с использованием магнитно-резонансной и компьютерной томографии [Barrefelt A.A., Brisma, Т.В., Egri G. et al. Multimodality imaging using SPECT/CT and MRI and ligand functionalized 99mTc-labeled magnetic microbubbles. EJNMMI. 2013, 3, 12. https://doi.org/10.1186/2191-219X-3-12]. Несмотря на широкое распространение в экспериментальной практике данных методов, у них есть ряд существенных недостатков. В первую очередь низкая разрешающая способность формирует недостаточно четкое изображение структур головного мозга крыс, ввиду маленького объема органа. Также для применения данных методов необходимы дорогостоящее оборудование, обученный и высококвалифицированный персонал, для получения результатов требуется длительная наркотизация животного, что в случае исследования нейрофизиологических процессов гипоксии-ишемии, может самостоятельно изменить степень повреждения мозговых структур.

Следующим известным методом диагностики повреждения головного мозга является морфологическая оценка повреждения [Krasnov I., Gulevskaja Т., Morgunov V. Histological study of brain in the rats exposed to 93-days' tail-suspension. J Gravit Physiol. 2002, 9(1):Р35-6]. При однозначно высокой точности и высокой валидности очевидный существенный недостаток способа - посмертность реализации, что делает невозможным применение морфологического исследования головного мозга крыс с целью оценки динамики поражения. Также для осуществления данного метода необходим высококвалифицированный и обученный персонал, специализированная аппаратура для изготовления качественных срезов, а также микроскопы с высокой разрешающей способностью.

Еще одним методом, широко вошедшим в экспериментальную практику для оценки степени повреждения головного мозга, является применение различных когнитивных тестов [Schaar K.L., Brenneman М.М., Savitz S.I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp and Trans Stroke Med. 2010, 2, 13. https://doi.org/10.1186/2040-7378-2-13]. Свое-широкое распространение они получили благодаря дешевизне применения и простоте реализации. Однако принципиальные недостатки ограничивают их применение в качестве единственного метода диагностики ишемического повреждения головного мозга. Так, достоверность полученных данных достаточно низкая, поскольку когнитивные тесты указывают на наличие и степень повреждения мозга без диагностики генеза поражения. Необходимость сбора данных, повторные тестирования в течение исследования также ограничивают их применения в рамках острого эксперимента.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ оценки микроциркуляции в условиях экспериментальной модели ишемического повреждения мозга с помощью лазерной-спекл-контрастной визуализации с применением RWD Laser Speckle Contrast Imaging System (RWD Life Science, Китай), который устанавливают на расстоянии 10 см от головного мозга. Метод основан на фиксации случайной спекл-интерференционной картины, формирующейся на фотоприемнике, который осуществляет собирание света, обратно рассеянного от поверхности, освященной когерентным лазерным излучением ткани. Для получения информации о движении рассеивающих частиц используется временная и пространственная статистика структурой спекла [Режим доступа: https://www.rwdstco.com Дата доступа 01.07.2024].

Существенным недостатком прототипа является недостаточно приемлемый температурный диапазон работы. Прибор функционирует в режиме температур от 15 до 35°С, что при работе с мозговой тканью при моделировании ишемического повреждения головного мозга у живых крыс является недопустимым условием воспроизведения методики. Также отсутствие оптимальных возможностей поддержания температурного режима между оптическим прибором и тканью в технических параметрах прибора, значительно затрудняет воспроизведение и валидацию моделей ишемии головного мозга.

Задача изобретения - разработка способа проведения исследования для ранней оценки объема церебральной гипоксии при экспериментальном моделировании ишемического повреждения головного мозга.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности исследования и достоверности оценки степени тяжести повреждения головного мозга.

Предлагаемый способ проведения исследования для оценки объема церебральной гипоксии в условиях экспериментальной модели ишемического повреждения мозга осуществляется следующим образом. Проводят оценку скорости кровотока в режиме реального времени при помощи лазерной-спекл-контрастной визуализации с применением RWD Laser Speckle Contrast Imaging System (RWD Life Science, Китай), работающего в диапазоне температурных режимов от 15 до 35°С, который устанавливают на расстоянии 10 см от головного мозга. Для поддержания постоянства температуры исследуемой области 37°С применяют воздушный теплообогреватель, например STINGRAY ST-FH1053B, Китай. Необходимость в данном температурном режиме обусловлена исключением снижения периферического кровообращения, что при оценке объема повреждения головного мозга после экспериментального моделирования ишемии-гипоксии, может негативно повлиять на валидацию методики, кроме того, подогрев не только непосредственно тела, но и пространства между лазерной установкой, позволяет устранить негативное влияние феномена воздушной подушки между подогреваемой тканью и холодной окружающей средой. Для оценки распределения температуры исследуемой области используют тепловизорную камеру, например портативную тепловизорную камеру UNI-T UTI165K, Китай, которую устанавливают на расстоянии 30 см от исследуемой области.

Вся экспериментальная работа в условиях in vivo выполнена на 30 белых беспородных половозрелых крысах-самцах (225,7±22,4 г) в соответствии с международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных в лабораторных условиях, Правилами проведения лабораторных доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96, ГОСТ 50258-92) и приказом Минздравсоцразвития России №708н (23.08.2010) "Об утверждении правил проведения лабораторных исследований" (GLP). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Директива 2010/63/EU) и Руководством по содержанию и уходу за лабораторными животными (ГОСТ 33215-2014). Животные были разделены на 2 группы: 1 группа -интактные животные; 2 группа - экспериментальная (двусторонняя перевязка сонных артерий). В асептических условиях животных наркотизировали золетил-ксилазиновым наркозом по следующей схеме: золетил 0,3 мг в/м («Virbac», Франция), ксиланит 0,8 мг в/м (ЗАО «НИТА-ФАРМ», Россия, г. Саратов) из расчета на 100 г массы тела животного. Наркоз верифицировали по угнетению роговичного рефлекса и исчезновению реакции на болевые раздражители. Моделирование ишемического повреждения головного мозга проводили посредством выделения общих сонных артерий с последующей их перевязкой нерассасывающимся шовным материалом. Рану послойно ушивали. Половине экспериментальной группы животных проводили оценку размеров ишемизированного очага и скорости кровотока в средней мозговой артерии (СМА) лазерной спекл-контрастной визуализацией на 1 сутки после эксперимента. Доступ к СМА осуществляли через трепанационное отверстие в проекции корковой ветви левой СМА при температуре 37°С под постоянным контролем температуры исследуемой области и окружающей площади между тканью и лазерной установкой при помощи тепловизора. Производился V-образный разрез кожных покровов, основание лоскута которого обращено к нижней челюсти. Височная мышца удалялась после вскрытия фасции. В верхнем каудальном углу операционного поля накладывались 3 фрезевых отверстия в форме треугольника, размером 2x2x2 мм. Выделенную часть черепа удаляли. При помощи вспомогательных инструментов лазера, выделяли область СМА (область интереса, ROI), где проводилась оценка скорости кровотока в режиме реального времени (мм /сек).

Другая половина экспериментальной группы животных после моделирования нарушения мозгового кровообращения подвергалась оценке размеров ишемизированного очага на 1 сутки эксперимента при помощи компьютерной и магнитно-резонансной томографии.

После каждого летального случая, а также по окончании эксперимента осуществляли забор мозга крыс с последующим окрашиванием трифенилтетразолийхлоридом. Далее материал подвергали фиксации 10% нейтральным раствором формалина.

Результаты исследования были обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США).

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1 представлены результаты исследования объема ишемизированной области ткани головного мозга крыс на 1 сутки эксперимента лазерной спекл-контрастной визуализацией; на фиг. 2 - результаты исследования объема ишемизированной области ткани головного мозга крыс на 1 сутки эксперимента компьютерной и магнитно-резонансной томографией; на фиг. 3 - микрофото поперечного среза структуры головного мозга, слева -модель без перевязки сонных артерий, справа - с перевязкой сонных артерий (окр. гематоксилин-эозин., ув. х10); на фиг. 4 иммуногистохимическое исследование ткани полушарий головного мозга.

Пример 1. Лазерная-спекл визуализация ишемизированного очага головного мозга крыс в сравнении с компьютерной и магнитно-резонансной томографией.

Из фиг. 1 и фиг. 2 видно, что на 1 сутки после эксперимента оценка степени ишемизации посредством компьютерной и магнитно-резонансной томографии не представляется возможной ввиду низкой разрешающей способности для небольших размеров органов крыс, когда как лазерная спекл-контрастная визуализация показала обширные ишемизированные очаги, а также значительное снижение кровотока в СМА.

Пример 2. Оценка повреждения структуры головного мозга микроскопическим методом.

После стандартной проводки тканей головного мозга стеклопрепараты окрашивались гематоксилин-эозином.

Иммуногистохимическими методами выявлялся глиофибриллярный кислый протеин (GFAP), являющийся специфическим белком филаментов астроцитов. Широко применяется в диагностических целях и экспериментальных моделях при исследовании функции нервной системы. В качестве первичных антител использовались Glial Fibrillary Acidic Protein (клон EP672Y), система детекции Elabscience 2 step plus (Poly-HRp anti Rabbit/mouse IgG with DAB solution cat. No E-IR-R213) на иммунигистостейнере Autostainer Epredia 360 (Thermo Fisher Scientific, USA).

При стандартных методах окраски грубых повреждений структуры полушария выявлено не было. Отмечается отечность коры полушарий (фиг. 3). Для более точного анализа выполнялось иммуногистохимическое исследование с выявлением экспрессии глиальных белков в структурах полушарий головного мозга (фиг. 4).

В модели с перевязкой сонных артерий отмечается зоновая потеря экспрессии глиофибриллярного протеина в коре полушарий, гипоталамусе и паравентрикулярной зоне, что может свидетельствовать о ранних ишемических повреждениях.

Таким образом, заявляемый способ проведения исследования для оценки церебральной ишемии позволяет идентифицировать церебральную ишемию интраоперационно и оказывается эффективнее признанных способов нейровизуализации, не уступая морфологическим исследованиям.

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрофизиологии, и может быть использовано для оценки факта и размеров повреждения головного мозга крыс. Проводят оценку скорости кровотока в режиме реального времени при помощи лазерной спекл-контрастной визуализации с применением RWD Laser Speckle Contrast Imaging System, который устанавливают на расстоянии 10 см от головного мозга. Для поддержания постоянства температуры исследуемой области 37 °С применяют воздушный теплообогреватель STINGRAY ST-FH1053B. Для оценки распределения температуры исследуемой области используют портативную тепловизорную камеру UNI-T UTI165K, которую устанавливают на расстоянии 30 см от исследуемой области. Способ обеспечивает повышение точности исследования и достоверности оценки степени тяжести повреждения головного мозга за счет оценки скорости кровотока в режиме реального времени при помощи лазерной спекл-контрастной визуализации. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

1. Способ проведения исследования для оценки церебральной гипоксии в условиях экспериментальной модели ишемического повреждения путем оценки скорости кровотока в режиме реального времени при помощи лазерной-спекл-контрастной визуализации с применением лазера RWD Laser Speckle Contrast Imaging System, который устанавливают на расстоянии 10 см от головного мозга, отличающийся тем, что поддерживают постоянство температуры исследуемой области 37 °С при помощи воздушного теплообогревателя, а для оценки температуры исследуемой области устанавливают тепловизорную камеру на расстоянии 30 см от исследуемой области.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют воздушный теплообогреватель STINGRAY ST-FH1053B и портативную тепловизорную камеру UNI-T UTI165K.