Способ дифференциальной диагностики хронического гепатита С и аутоиммунных заболеваний печени у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам лабораторной диагностики патологических состояний печени и может найти применение в клинико-лабораторных условиях для дифференциальной диагностики хронического гепатита С (ХГС) и аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП), включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени.

Хронические заболевания печени являются причиной примерно двух миллионов смертей в год во всем мире и представляют собой актуальную проблему глобального здравоохранения. К наиболее распространенными причинам этих заболеваний относятся вирусные - гепатит В и гепатит С, а также алкогольный и неалкогольный стеатогепатит, аутоиммунные и генетические заболевания печени. Для хронических заболеваний печени характерно развитие фиброза печени - патологического процесса при котором нормальная ткань печени замещается соединительной. При этом, развивающийся фиброз печени определяет ухудшение качества жизни, является основной причиной клинических осложнений и значимой причиной смертности во всем мире т.к. его степень коррелирует с функцией печени и представляет собой основной фактор риска развития гепатоцеллюлярной карциномы [Roehlen N., Crouchet Е., Baumert T.F., Liver Fibrosis: Mechanistic Concepts and Therapeutic Perspectives. Cells. 2020, 9, 875; doi:10.3390/cells9040875; Asrani, S.K.; Devarbhavi, H.; Eaton, J.; Kamath, P.S. Burden of liver diseases in the world. J. Hepatol. 2019, 70, 151-171. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.09.014; Llovet, J.M.; Zucman-Rossi, J.; Pikarsky, E.; Sangro, В.; Schwartz, M.; Sherman, M.; Gores, G. Hepatocellularcarcinoma. Nat. Rev. Dis. Primers 2016, 2, 16018. https://doi.org/10.1038/nrdp.2016.18].

В настоящее время диагностика фиброза печени, помимо компьютерной томографии и ультразвуковой эластографии, а также биопсии печени, включает оценку состояния печени по системе специальных тестов. Для их осуществления, проводят лабораторный анализ комплекса из десяти лабораторных и четырех антропометрических параметров (возраст, пол, вес и рост). В зависимости от необходимости, по этим данным могут быть рассчитаны значения для шкал следующих тестов - ФиброТеста, СтеатоТеста, АктиТеста (при вирусном гепатите С и В), НэшТеста (при ожирении, сахарном диабете) и ЭшТеста (при злоупотреблении алкоголем). Также существует комплексный тест, включающий в себя все вышеперечисленные - ФиброМакс [Morra R., Munteanu М., Imbert-Bismut F., Messous D., Ratziu V., Poynard Т. FibroMAX: towards a new universal biomarker of liver disease? Expert Rev. Mol. Diagn. 2007 Sep;7(5):481-90.doi: 10.1586/14737159.7.5.481]. Ультразвуковая эластография печени позволяет оценить наличие фиброза печени по результатам компьютерного анализа проницаемости ткани печени для ультразвуковых колебаний [Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т. Современные возможности эластометрии, Фибро- и АктиТеста в диагностике фиброза печени, «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии» 2008; 16 (4): 43-52.]. Исследование позволяет с высокой точностью дифференцировать выраженные и тяжелые степени фиброза или цирроз печени, но не обладает достаточной чувствительностью при определении и дифференцировании ранних стадий фиброза. В сложных клинических случаях выполняют пункционную биопсию печени. К сожалению, биопсия печени, оставаясь «золотым стандартом» определения стадии фиброза, является инвазивным методом с определенным процентом осложнений, проводится в госпитальных условиях, имеет ряд противопоказаний и трудностей трактовки результата. По итогам этих обследований устанавливается стадия фиброза по шкале METAVTR, отражающая тяжесть процесса и форму фиброзного поражения. Согласно этой шкале выделяют пять стадий фиброза (F0-4), где F0 соответствует отсутствию фиброза, a F4 - циррозу печени [Poynard Т., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups. Lancet. 1997; 349 (9055): 825-832, doi: 10.1016/s0140-6736(96)07642-8].

Аутоиммунные заболевания печени (АИЗП) представляют собой группу заболеваний, включающую аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз. Аутоиммунный гепатит - хроническое заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся перипортальным или более обширным воспалением и появлением в сыворотке широкого спектра аутоантител. Первичный билиарный цирроз - хронический негнойный деструктивный холангит неясной этиологии, поражающий главным образом мелкие внутрипеченочные желчные протоки [Шварц В.Я., Ногаллер A.M., Кольберг Б. Аутоиммунный гепатит КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА, 2013, №9: 57-61; Christen U., Hintermann Е., Immunopathogenic Mechanisms of Autoimmune Hepatitis: How Much Do We Know from Animal Models? Int. J. Mol. Sci. 2016 Dec 1;17(12):2007. doi: 10.3390/ijms17122007; Подымова С.Д. Перекрестные аутоиммунные синдромы в гепатологии ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ, 2013, №4: 3-12]. АИЗП поражают преимущественно лиц трудоспособного возраста и при отсутствии надлежащего лечения приводят к инвалидизации и высокому риску смерти больных, что определяет важность своевременной диагностики. Схожесть клинических, лабораторных и даже морфологических проявлений аутоиммунных заболеваний печени между собой и с другими видами гепатобилиарной патологии обусловливает сложности их дифференциальной диагностики.

Гепатит С - инфекционное заболевание печени, с гемоконтактным путем заражения, развивающееся в результате инфицирования вирусом гепатита С. Около 80% случаев заражения приводят к развитию хронической формы. Заболевание способно в течение длительного времени протекать бессимптомно, однако в течение нескольких лет, либо десятилетий может привести к развитию цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциномы. Кроме этого происходит значительное усиления влияния на функционирование печени других негативных факторов [Lauer G.M., Walker B.D. Hepatitis С virus infection. The New England Journal of Medicine. 2001;345(l):41-52].

Вирусные гепатиты В и С, а также аутоиммунные заболевания печени сопровождаются активацией собственных клеток печени, а также клеток иммунной системы, которые в случае вирусных гепатитов атакуют зараженные, а в случае аутоиммунных - здоровые клетки печени. Эти процессы сопровождаются взаимодействием различных клеточных групп, которое регулируется сложным сочетанием рецепторных и растворимых факторов. К основным растворимым факторам относятся цитокины - специальные регуляторные пептиды, обеспечивающие коммуникацию иммунных клеток между собой и с другими клетками организма [Ефремова Н.А., Грешнякова В.А., Горячева Л.Г. Современные представления о патогенетических механизмах фиброза печени, ЖУРНАЛ ИНФЕКТОЛОГИИ, 2023, Том 15, №1, DOI: 10.22625/2072-6732-2023-15-1-16-24; Pellicoro A, Ramachandran Р, Iredale JP, Fallowfield JA. Liver fibrosis and repair: immune regulation of wound healing in a solid organ. Nat Rev Immunol. 2014, 14:181-94. doi:10.1038/nri3623; Seki E, Schwabe RF. Hepatic inflammation and fibrosis: functional links and key pathways. Hepatology. 2015;61:1066-79. doi:10.1002/hep.27332; Krenkel O, Tacke F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nat Rev Immunol. 2017;17:306-21. doi: 10.1038/nri.2017.11]. При высокой интенсивности либо длительности локальных иммунных процессов, некоторые из цитокинов могут быть обнаружены в сыворотке или плазме крови. Благодаря этому, изменения уровней специфических цитокинов в периферической крови могут отражать степень активности различных процессов с участием иммунных клеток и, в том числе, интенсивность формирования фиброза печени, а сами цитокины - выступать в роли биомаркеров различных форм поражений печени [Семенов А.В., Арсентьева Н.А., Любимова Н.Е., Тюленев С.В., Басина В.В., Эсауленко Е.В., Тотолян А.А. Роль цитокинов и хемокинов в лабораторной диагностике хронического вирусного гепатита С, Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60 (8): 45-51; Li МН, Lu Y, Zhang L, Wang XY, Ran CP, Hao HX, Zhang D, Qu XJ, Shen G, Wu SL, Cao WH, Qi TL, Liu RY, Hu LP, Chang M, Hua WH, Liu SA, Wan G, Xie Y. Association of Cytokines with Alanine Aminotransferase, Hepatitis В Virus Surface Antigen and Hepatitis В Envelope Antigen Levels in Chronic Hepatitis B. Chin Med J (Engl). 2018 Aug 5;131(15):1813-1818. doi: 10.4103/0366-6999.237394].

Известен способ определения стадии фиброза печени у пациентов с хроническим гепатитом С, включающий проведение транзиентной эластометрии с помощью прибора «FibroScan» при помощи датчика М и датчика XL, чрескожной пункционной биопсии печени, а также соноэластографии сдвиговой волной в VI сегменте печени с применением УЗ сканера «Aixplorer» и дальнейший анализ с помощью метода «FibroTest». При этом полученные результаты, выраженные в баллах METAVIR, используют для расчета итогового показателя стадии фиброза [Способ определения стадии фиброза печени у пациентов с хроническим гепатитом С (RU 2726008 С1), опубликован 08.07.2020]. Способ позволяет определить степени выраженности фиброза печени при гепатите С, но не причину его развития.

Известен способ диагностики фиброза печени, включающий определение у пациента уровней экспрессии плазминогена урокиназного типа, матричной металлопротеиназы 9 и β2-микроглобулина и вычисление на их основании балльной оценки и постановку диагноза [Биомаркеры, пригодные при диагностике фиброза печени (RU 2505821 С2), опубликован 27.01.2014]. Способ также относится к малоинвазивным методам определения степени фиброза печени по биомаркерам в плазме крови, однако не позволяет определить причину его развития.

Наиболее близкими по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, являются способы дифференциальной диагностики для пациентов с фиброзом печени начального уровня по концентрациям нескольких цитокинов между ХГВ и АИЗП [Способ дифференциации фиброза печени при хроническом вирусном гепатите В и аутоиммунных поражениях печени (RU 2701723 С1), опубликован 01.10.2019] и между ХГВ и ХГС [Способ дифференциации причин развития фиброза печени начального уровня при хронических вирусных гепатитах В и С (RU 2759672 С2), опубликован 16.11.2021]. В первом случае, способ основан на определении в плазме крови пациентов трех цитокинов CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFNγ и сравнением с пороговыми значениями; во втором - CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ и сравнением с пороговыми значениями. Методы позволяют провести дифференциальную диагностику при определении причин развития фиброза начального уровня (F0-1 METAVIR), между ХГВ и АИЗП в первом случае и ХГВ и ХГС - во втором, но не позволяют определять эти заболевания одновременно. Также, методы предназначены для работы только с пациентами с фиброзом начального уровня, но не тяжелым или циррозом печени.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа дифференциальной диагностики хронического гепатита С и аутоиммунных заболеваний печени, включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-4), благодаря определению в плазме крови трех цитокинов - ИЛ-10, ИЛ-17А, ФНОα.

Изобретение позволит расширить арсенал средств, используемых для диагностики заболеваний печени.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фигуре 1 приведен алгоритм обработки результатов. Пороговые значения, получены авторами по результатам анализа образцов плазмы крови пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени и диагнозами ХГС и АИЗП.

Решение поставленной задачи достигается тем, что производится взятие образца периферической крови пациента с тяжелым фиброзом или циррозом печени и диагнозом ХГС или АИЗП, центрифугирование пробы с отделением плазмы с последующим диагностированием заболевания по содержанию белковых продуктов в плазме крови. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать цитокины ИЛ-10, ИЛ-17А, ФНОα. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркеров пороговым значениям предполагают в качестве диагноза хронический гепатит С или аутоиммунные заболевания печени.

Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров, для них был проведен анализ характеристических кривых (receiver operating characteristic curve - ROC) и определены значения площади под кривой - AUC (Area Under the Curve). Было установлено, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает максимальной чувствительностью и специфичностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. Далее был применен метод построения деревьев решений в программе STATISTICA 10, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров ИЛ-10, ИЛ-17А и ФНОα является достаточным для проведения дифференциальной диагностики ХГС и АИЗП. Значения AUC для трех цитокинов были более 0,96, что говорит о хорошем качестве выбранной модели.

В результате анализа были получены следующие пороговые значения для проведения дифференциальной диагностики ХГС и АИЗП: ИЛ-10 - 7,58 пг/мл, ИЛ-17А - 3,29 пг/мл и ФНОα - 41,32 пг/мл. Использование данного диагностического алгоритма позволяет достигнуть чувствительности 80,0% при специфичности 84,6% - для ХГС, чувствительности 84,6%, при специфичности 80,0% - для АИЗП.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фигуре 1 представлено дерево решений для дифференциальной диагностики хронического гепатита С и аутоиммунных заболеваний печени, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени.

Изобретение реализуется следующим способом.

Пример 1. Выбор порогового значения содержания цитокинов.

Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17А и ФНОα в группах больных с тяжелым фиброзом/циррозом печени. Образцы периферической крови забирали в вакуумную пробирку с антикоагулянтом K2 ЭДТА, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин для отделения плазмы, которую отбирали в пробирки типа «Эппендорф», замораживали и хранили при -80°С до проведения эксперимента. Для определения содержания цитокинов в плазме крови использовали технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили с применением программного пакета STATISTICA 10. Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов был применен метод построения деревьев решений, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров ИЛ-10, ИЛ-17А и ФНОα является максимально информативным для проведения дифференциальной диагностики ХГС и АИЗП.

Оценку проводят по следующему алгоритму: на первой стадии оценивают концентрацию ФНОα, значение которого более или равно 41,32 пг/мл - требует проведения второй стадии для этого пациента, значение менее 41,32 пг/мл - требует проведения третьей стадии для этого пациента, на второй стадии оценивают концентрацию ИЛ-10, значение менее 7,58 пг/мл указывает на диагноз ХГС, более или равно 7,58 пг/мл - на диагноз АИЗП, на третьей стадии оценивают концентрацию ИЛ-17А, значение более или равно 3,29 пг/мл указывает на диагноз АИЗП, менее 3,29 - на диагноз ХГС.

Пример 2. Диагностика

Больная Т., 57 лет.

Диагноз: первичный билиарный цирроз. Поступила 15 мая 2016 года в отделение терапии Городской клинической больницы №31, СпБ, в состоянии средней тяжести. Эластометрия печени - фиброз F3-4 по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации цитокинов в плазме крови: ИЛ-10 = 0,14 пг/мл, ИЛ-17А = 4,82 пг/мл, ФНОα = 12,59 пг/мл. Таким образом, у больной значение ФНОα < 41,32 пг/мл, а ИЛ-17А ≥ 3,29 пг/мл, что соответствует предполагаемому диагнозу АИЗП и совпадает с фактическим диагнозом заболевания.

Больная А., 62 года.

Диагноз: аутоиммунный гепатит в стадии цирроза печени. Поступила 15 декабря 2015 года в отделение терапии Городской клинической больницы №31, СпБ, в состоянии средней тяжести. Эластометрия печени - фиброз F4 по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации цитокинов в плазме крови: ИЛ-10 = 0,26 пг/мл, ИЛ-17А = 6,23 пг/мл, ФНОα = 7,65 пг/мл. Таким образом, у больной значение ФНОα< 41,32 пг/мл, что соответствует предполагаемому диагнозу АИЗП и совпадает с фактическим диагнозом заболевания.

Больной Е., 49 лет.

Диагноз: хронический вирусный гепатит С, цирротическая стадия. Поступил 6 ноября 2019 в 3-е инфекционное боксированное отделение КИБ им. С.П. Боткина, СпБ, в тяжелом состоянии. Эластометрия печени - цирроз печени. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации цитокинов в плазме крови: ИЛ-10 = 0,08 пг/мл, ИЛ-17А = 1,56 пг/мл, ФНОα = 7,52 пг/мл. Таким образом, у больного значение ФНОα <41,32 пг/мл, а ИЛ-17А <3,29 пг/мл что соответствует предполагаемому диагнозу ХГС и совпадает с фактическим диагнозом заболевания.

Таким образом, предложенный алгоритм может эффективно использоваться для дифференциальной диагностики хронического гепатита С и аутоиммунных заболеваний печени, включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-4).

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциальной диагностики хронического гепатита С (ХГС) и аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП) у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени. Проводят определение в плазме крови концентрации цитокинов ИЛ-10 в пг/мл, ИЛ-17А в пг/мл и ФНОα в пг/мл. Диагноз у пациента с тяжелым фиброзом и циррозом печени устанавливают путем сопоставления полученных значений с пороговыми: на первой стадии оценивают концентрацию ФНОα, значение которого более или равно 41,32 пг/мл требует проведения второй стадии для этого пациента, значение менее 41,32 пг/мл требует проведения третьей стадии для этого пациента. На второй стадии оценивают концентрацию ИЛ-10, при значении менее 7,58 пг/мл диагностируют ХГС, при значении более или равно 7,58 пг/мл диагностируют АИЗП. На третьей стадии оценивают концентрацию ИЛ-17А, при значении более или равно 3,29 пг/мл диагностируют АИЗП, при менее 3,29 диагностируют ХГС. Способ обеспечивает возможность дифференциальной диагностики хронического гепатита С и аутоиммунных заболеваний печени, включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-4), за счет определения в плазме крови трех цитокинов: ИЛ-10, ИЛ-17А, ФНОα. 1 ил., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики хронического гепатита С (ХГС) и аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП) у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени, включающий определение в плазме крови концентрации цитокинов ИЛ-10 в пг/мл, ИЛ-17А в пг/мл и ФНОα в пг/мл и характеризующийся тем, что диагноз у пациента с тяжелым фиброзом и циррозом печени устанавливают путем сопоставления полученных значений с пороговыми:

на первой стадии оценивают концентрацию ФНОα, значение которого более или равно 41,32 пг/мл требует проведения второй стадии для этого пациента, значение менее 41,32 пг/мл требует проведения третьей стадии для этого пациента, на второй стадии оценивают концентрацию ИЛ-10, при значении менее 7,58 пг/мл диагностируют ХГС, при значении более или равно 7,58 пг/мл диагностируют АИЗП, на третьей стадии оценивают концентрацию ИЛ-17А, при значении более или равно 3,29 пг/мл диагностируют АИЗП, при менее 3,29 диагностируют ХГС.