Способ диагностики атерогенных нарушений у детей при помощи циркулирующих микроРНК Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/6886 G01N33/49 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к диагностическим методам, позволяющим диагностировать развитие атерогенных нарушений у детей при помощи анализа микроРНК в образце плазмы крови.

МикроРНК (miRNA, miR, microRNA) представляют собой малые некодирующие последовательности, в среднем 18-25 нуклеотидов, которые являются одним из механизмов эпигенетической регуляции, в частности, на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Известны с 1993 г., когда впервые были обнаружены при исследовании мутантных линий нематод. Эти молекулы регулируют экспрессию, как минимум, половины транскриптома человека путем ингибирования трансляции или запуская процессы деградации мРНК.

Хорошо известно, что микро-РНК профиль отражает ряд молекулярно-генетических процессов, протекающих в органах и тканях, в связи с чем их пытаются задействовать в диагностических и терапевтических целях при различных нозологиях, прежде всего, в качестве биомаркеров онкологических процессов. В ряде исследований показана важность микроРНК в регуляции ключевых сигнальных путей и липидного гомеостаза, которые контролируют баланс прогрессии атеросклеротических бляшек и регрессии.

Патогенез образования атеросклеротических повреждений до сих пор полностью не изучен, ясно лишь, что в этот процесс вовлечено множество компонентов. Исследование роли микроРНК играет важное значение, так как есть возможность анализировать количество микроРНК в крови, что повышает потенциал для их использования в качестве биомаркеров для диагностики, прогноза, или оценки ответа на терапию. Кроме того, последние разработки показывают, что микроРНК могут быть использованы как терапевтическая мишень.

Гомеостаз холестерина имеет важное значение для клеточной физиологии, и изменение уровня клеточного или системного холестерина связаны с метаболическими заболеваниями. Недавние открытия микроРНК, которые контролируют липопротеины высокой и низкой плотности значительно расширили понимание регуляции плазменных уровней липопротеинов.

Так, микроРНК-122 вовлечена в метаболизм липопротеинов, и она сильно экспрессирована в печени. Однако, по-видимому, основная роль микроРНК-122, связана с экспрессией конкретных генов гепатоцитов, а не специфическое нацеливание на пути липидного обмена. МикроРНК-223 и микроРНК-27b участвуют в регулировании генов холестерина и метаболизма липопротеинов. МикроРНК-223 подавляет гены участвующие в биосинтезе холестерина (HMGS1, SC4MOL) и поглощении ЛПВП (SRB1). МикроРНК-27b является холестеринреагирующей печеночной микроРНК, которая подавляет несколько целей (PPARG, глицерол-3-фосфат - ацилтрансферазу, митохондриальную [GPAM], ангиопоэтин 3 [ANGPTL3], и N-дэацетилазу / N-сульфотрансферазу [NDST1]), участвующие в метаболизме липидов и липопротеинов. МикроРНК-30С воздействует на производство апоВ содержащих липопротеидов (ЛПОНП и ЛПНП). Избыточная экспрессия микроРНК-30С у мышей уменьшает сборку и секрецию апоВ липопротеинов, приводит к снижению в плазме уровней общего холестерина и ЛПНП. Кроме того, исследования в апоЕ-дефицитных (АРОЕ -/-) мышей показали, что микроРНК-30С суперэкспрессия смягчает атеросклероз, не вызывая стеатоз.

Два недавних исследования идентифицировали микроРНК-148а в качестве отрицательного регулятора экспрессии рецепторы ЛПНП, и показали, что ингибирование микроРНК-148а у мышей может увеличить клиренс циркулирующего ЛПНП и снижение в плазме уровней ЛПНП.

Другие 3 микроРНК нацеленные на рецепторы ЛПНП: MIR-128-1, микроРНК-130b, и микроРНК-301b. Подобно микроРНК-148а, при ингибировании микроРНК-128-1 заблокированными антисмысловыми олигонуклеотидами в печени увеличилась экспрессия ЛПНП рецепторов и клиренс ЛПНП у мышей. В дополнение к ЛПНП рецепторам, MIR-148a и MIR-128-1 также ориентированы на дополнительные гены, вовлеченные в липидный и энергетический метаболизм (MTR-148a: АТФ-связывающий транспортер A1 [АВСА1], 5' аденозинмонофосфата-активированный протеин a1 - киназы [AMPKa1], карнитин палмитойлтрансфераза 1a [CPT1a], и соль-индуцируемых киназа 1 [SIK1]; микроРНК-128-1: АВСА1, Sirtuin 1 [SIRT1] и субстрат инсулинового рецептора 1), предполагая важную роль для этих микроРНК в регуляции метаболических путей.

МикроРНК также участвуют в регуляции ЛПВП и выведении холестерина. Эти пути контролируют уровни ЛПВП в плазме и обратный транспорт холестерина, через который избыток холестерина удаляется в печень для выведения. АТФ-связывающий транспортер, АВСА1, играет центральную роль в этих процессах, контролируя отток холестерина через клеточную мембрану. Многие микроРНК были идентифицированы, как нацеленные на АВСА1, в том числе MIR-33, микроРНК-758, микроРНК-26, микроРНК-106, микроРНК-144, а также вышеупомянутый микроРНК-128-1 и микроРНК-148а. Ингибирование микроРНК-33, микроРНК-144, микроРНК-128-1 и микроРНК-148а приводит к увеличению концентрации в плазме ЛПВП у мышей или обезьян. Циркулирующие уровни ЛПВП также регулируются через рецептор BI, который является мишенью микроРНК-223, микроРНК-455-5р, микроРНК-96, микроРНК-185, и микроРНК-125а. Тем не менее, только воздействие на микроРНК-223 показали изменение уровней HDL-C.

МикроРНК-33а и микроРНК-33b являются интронными микроРНК, которые коэкспрессируются с их генами, SREBF2 и SREBF1, которые кодируют факторы транскрипции, регулирующие уровень холестерина. Ингибирование микроРНК-33 с использованием модифицированных антисмысловых или заблокированных олигонуклеотидов увеличивает экспрессию АВСА1 в печени и плазменные уровни ЛПВП у мышей и обезьян на 40% до 50%, и вызывает повышение транспорта холестерина из макрофагов в плазму, печень и кал >80%. Это увеличение обратного транспорта холестерина, скорее всего, совокупный эффект дерепрессии АВСА1 и дополнительных целей микроРНК-33а / микроРНК-33b, таких как Abcb11 и Atp8b1, которые способствуют экскреции холестерина в желчи.

Из уровня техники известен способ обнаружения микроРНК для оценки состояния сосудов и сердца [WO 2016205461 A1, 16.06.2016], где микроРНК выделяют из плазмы крови, полученной путем центрифугирования образца цельной крови.

Вышеприведенный метод основан на исследовании следующих микроРНК iso-miR-10b, iso-miR-30d, iso-miR-93, iso-miR-143, iso-miR-181a, iso-miR-182, iso-miR-744.

Недостатком данного способа является то, что оценка состояния сосудов, происходит по уровням нескольких отдельных микроРНК, но не сочетания уровней микроРНК, выраженных единым коэффициентом, кроме того, использованные микроРНК только частично отражают информацию о патологических процесса. Также, в виду специфики молекулярно-биологических процессов в детском возрасте, не известно, позволяет ли данный способ выявлять нарушения у детей.

Техническим результатом заявленного способа является возможность диагностики атерогенных нарушений у детей по изменению профиля экспрессии следующих микроРНК выделенных из плазмы крови: микроРНК-let-7a, микроРНК-lеt-7b, микроРНК-21, микроРНК-24, микроРНК-125, микроРНК-126, микроРНК-145 и микроРНК-222.

Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что заявленный способ включает следующие стадии: забор периферической венозной крови (не менее 0,5 мл) в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА; центрифугировании не позднее чем через 45 минут после взятия крови при 3000 g 15 минут, при комнатной температуре; отбор плазмы крови в чистую пробирку; выделение микроРНК методом преципитации на колонках; постановку реакции ПНР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием атерогенных нарушений: MHKpoPHK-let-7a, микроРНК-let-7b, микроРНК-21, микроРНК-24, микроРНК-125, микроРНК-126, микроРНК-145 и микроРНК-222; расчет коэффициента, диагностирующего развитие атерогенных нарушений по формуле (1) «Расчет коэффициента развития атерагенных нарушений».

Перерасчет концентраций микроРНК, включаемый в расчет, осуществляется в соответствии с поправочными коэффициентами (см. таблицу 1)

Диагностика развития атерогенных нарушений осуществляется по цифровому показателю коэффициента R: когда R ниже 1, это свидетельствует о отсутствии атерогенных нарушений, когда R выше 1, это свидетельствует о наличие атерогенных нарушений, когда R=1, это свидетельствует о пограничном состоянии.

Формула 1 «Расчет коэффициента развития атерагенных нарушений», описывающей способ расчета коэффициента, в соответствии с которым возможно диагностировать развитие атерогенных нарушений,

Таблица 1 «Значения поправочных коэффициентов микроРНК», содержащая в себе значение поправочных коэффициентов для каждой микроРНК,

Таблица 2 «Уровни экспрессии микроРНК в плазме крови здоровых доноров», содержащая в себе значения уровней экспрессии микроРНК в плазме крови здоровых доноров,

Таблица 3 «Уровни экспрессии микроРНК в плазме крови пациентов с атерогенными нарушениями», содержащая в себе значения уровней экспрессии микроРНК в плазме крови пациентов с атерогенными нарушениями,

Таблица 4 «Коэффициенты атерогенности полученные по уровням микроРНК из плазмы крови здоровых доноров», содержащая в себе числовые коэффициенты развития атерогенных нарушений у здоровых доноров,

Таблица 5 «Коэффициенты атерогенности полученные по уровням микроРНК из плазмы крови пациентов с атерогенными нарушениями», содержащая в себе числовые коэффициенты развития атерагенных нарушений у пациентов с атерогенными нарушениями

Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими примерами:

Пример 1: у 17 здоровых доноров (возраст 1-15 лет, 9 мальчиков, 8 девочек) в амбулаторных условиях произвели забор 1 мл крови в пробирку ЭДТА К2. Кровь в течение 45 минут после забора центрифугировали в течение 15 минут при 3000 g, плазму отбирали в чистую пробирку. Аналогичным образом произвели забор материала у 17 пациентов (10 мальчиков, 7 девочек, возраст 1-15 лет) с атерогенными нарушениями.

Далее приступали к выделению свободных микроРНК: к плазме крови добавили 5 мкл протеиназы К, инкубировали при 56°С в течение 1 часа, далее провели выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy serum/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: нанесли на колонку Exiqon, после чего провели центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промыли 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводили центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку нанесли 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставили на 10 минут при комнатной температуре, затем провели центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего провели реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.

Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК провели полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени с использованием наборов "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием атерогенных нарушений: микроРНК-let-7а, MmcpoPHK-let-7b, микроРНК-21, микроРНК-24, микроРНК-125, микроРНК-126, микроРНК-145 и микроРНК-222.

Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016), вычислили количество каждой из исследуемых микроРНК.

Затем произвели расчет поправочных коэффициентов для каждой микроРНК. Значения поправочных коэффициентов отображены в табл. №1.

Расчет коэффициента, отражающего развитие атерогенных нарушений, произвели по формуле 1.

Значения уровней экспрессии микроРНК отражены в таблицах №2 и №3.

Полученные коэффициенты, определяющие развитие атерогенных нарушений отражены в таблицах №4 и №5.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к диагностическим методам, позволяющим диагностировать развитие атерогенных нарушений у детей при помощи анализа микроРНК в образце плазмы крови. Способ заключается в определении коэффициента, диагностирующего развитие атерогенных нарушений, включает забор венозной крови в пробирку с антикоагулянтом, центрифугирование, отбор плазмы, выделение микроРНК, постановку реакции ПЦР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием атерогенных нарушений: микроРНК-let-7а, микроРНК-let-7b, микроРНК-21, микроРНК-24, микроРНК-125, микроРНК-126, микроРНК-145 и микроРНК-222, при определенных условиях, далее проводят расчет коэффициента (R), диагностирующего развитие атерогенных нарушений, по эмпирической формуле (1), диагностику развития атерогенных нарушений в соответствии с полученными числовыми значениями, а именно по цифровому показателю коэффициента R: когда R ниже 1, это свидетельствует об отсутствии атерогенных нарушений, когда R выше 1, это свидетельствует о наличие атерогенных нарушений, когда R=1, это свидетельствует о пограничном состоянии. Способ позволяет диагностировать развитие атерогенных нарушений у детей. 5 табл., 1 пр.

Способ диагностики атерогенных нарушений у детей, включающий следующие стадии: забор периферической венозной крови не менее 0,5 мл в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА; центрифугирование не позднее чем через 45 минут после взятия крови при 3000 g 15 минут, при комнатной температуре; отбор плазмы крови в чистую пробирку; выделение микроРНК методом преципитации на колонках; постановку реакции ПЦР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием атерогенных нарушений: микpoPHK-let-7a (let-7a), микроРНК-lеt-7b (lеt-7b), микроРНК-21 (mir-21), микроРНК-24 (mir-24), микроРНК-125 (mir-125), микроРНК-126 (mir-126), микроРНК-145 (mir-145) и микроРНК-222 (mir-222); расчет коэффициента, диагностирующего развитие атерогенных нарушений, по формуле:

где R - коэффициент вероятности развития у пациента атерогенных нарушений, С - значения уровня экспрессии микроРНК, и диагностику развития атерогенных нарушений в соответствии с полученными числовыми значениями, а именно по цифровому показателю коэффициента R: когда R ниже 1, это свидетельствует об отсутствии атерогенных нарушений, когда R выше 1, это свидетельствует о наличие атерогенных нарушений, когда R=1, это свидетельствует о пограничном состоянии.