Морская микроводоросль - продуцент лютеина и иных каротиноидов Российский патент 2025 года по МПК C12N1/12 

Область техники

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения биологически активных веществ, прежде всего каротиноидов, особенно лютеина, для использования в биологически активных добавках (БАД) и пищевых добавках для человека, а также в различных кормовых добавках, прежде всего для аквакультуры.

Предшествующий уровень техники

Каротиноиды необходимы растениям для регуляции фотосинтеза и используются ими прежде всего в качестве антиоксидантов. В организме животных каротиноиды чаще всего играют роль провитаминов, то есть как предшественников прежде всего ретиноидов (группа сходных по структуре соединений, включая Витамин А). Однако современные данные показывают, что спектр биологической активности каротиноидов в организме животных существенно больше, что хорошо видно на примере лютеина, из которого не могут быть получены ретиноиды. Известно, что лютеин называемый макулярным пигментом, поддерживает зрительные функции и в том числе играет важную роль в облегчении возрастной макулярной дегенерации и пролиферативной диабетической ретинопатии - заболеваний, связанных с избыточным уровнем фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в тканях глаза. Показано, что лютеин накапливается в тканях глаза и является основным протектором развития этих заболеваний, подавляя VEGF-сигнал (Gurunathan S. et al. Lutein downregulates retinal vascular endothelial growth factor possibly via hypoxia inducible factor 1 alpha and X-box binding protein 1 expression in streptozotocin induced diabetic rats // Journal of Functional Foods, 2017, 31:97-103). Современные исследования демонстрируют колоссальную роль каротиноидов в здоровье человека и животных на протяжении всей жизни, и их использование может существенно улучшить качество жизни конечного потребителя.

Каротиноиды широко используются в аквакультуре и в качестве кормовых добавок для животных и птицы. В последнее время спрос на «нативные» (природные) каротиноиды существенно вырос. При этом химически синтезированные каротиноиды характеризуются крайне низкой растворимостью в водной среде и способностью образовывать крупные агрегаты, что существенно уменьшает их биодоступность как для человека, так и для животных. В дополнение к этому, синтетические каротиноиды часто образуют различные пространственные E- и Z- изомеры с искривлённой структурой, которые становятся неузнаваемыми для ферментов человека, поэтому затрудняется их выведение из организма при их избытке. Это может привести к их накоплению в форме агрегатов и даже привести к патологиям зрения. Прямые сравнения синтетических каротиноидов с природными каротиноидами, находящимися в нативной среде (например, мука из остатков крабов), показывают, что природные каротиноиды существенно лучше стимулируют рост мальков рыб, чем синтетические (Goda A.A. et al. Evaluation of Natural and Synthetic Carotenoid Supplementation on Growth, Survival, Total Carotenoid Content, Fatty Acids Profile and Stress Resistance of European Seabass, Dicentrarchus labrax // Aquaculture Studies 2018, 18(1):27-39 https://doi.org/10.4194/2618-6381-v18_1_04). Поэтому нативные каротиноиды, полученные, например, в форме лиофилизированной биомассы микроводорослей, являются наиболее подходящими и для пищевых и кормовых добавок.

Многие эукариотические микроводоросли способны накапливать в сотни и иногда даже в тысячи раз больше каротиноидов, чем любые известные высшие растения, что связано с их порой экстремальными условиями жизни. Именно это свойство синтезировать гигантское количество каротиноидов в последние годы стало использоваться для создания биологически активных пищевых и кормовых добавок. Промышленное культивирование микроводорослей используется сейчас уже во многих странах.

Известны разные микроводоросли, являющиеся продуцентами различных каротиноидов, например, штамм Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 - продуцент фукоксантина (RU2644260, публикация 08.02.2018), штамм Coelastrella sp. K1 (IPPAS С-2028) - продуцент смеси астаксантина и β-каротина (RU2703420, публикация 16.10.2019). Представители рода Chlorella, а также представители некоторых других родов из кладов Хлореллы (Parachlorella, Auxenochlorella) также известны как продуценты каротиноидов. Ряд из них известен как продуценты лютеина: так, например известен штамм Parachlorella kessleri HY1, депонированный в Институте ботаники Чешской республики, Тршебонь (CZ 2019776A3, публикация 27.01.2021), штамм Chlorella sorokiniana (SAG 211-32), депонированный в коллекции культур Геттингенского университета (Германия) (EP 21571676 публикация 28.09.2011), штамм Chlorella minutissima MCC-27, депонированный в коллекции CCUBGA (Индия) (Dineshkumar R. et al. Development of an optimal light-feeding strategy coupled with semi-continuous reactor operation for simultaneous improvement of microalgal photosynthetic efficiency, lutein production and CO₂ sequestration // Biochemical Engineering Journal, 2016, 113: 47-56).

Несмотря на большое разнообразие микроорганизмов, способных продуцировать каротиноиды, среди самих каротиноидов встречается колоссальное разнообразие (в настоящее время описано около 600 различных каротиноидов), при этом штаммы микроорганизмов имеют разные требования к условиям культивирования, во многих случаях не подходящих для промышленного применения по экологическим нормам и/или требующих непосредственной близости к морю. Кроме того, не все штаммы являются коммерчески доступными. В связи с этим поиск новых штаммов - продуцентов каротиноидов, является актуальной задачей.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема и задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в получении нового штамма микроводоросли с высоким уровнем накопления лютеина.

Задача решается путем получения нового штамма Parachlorella sp. Nanno 1 - продуцента каротиноидов, преимущественно лютеина. Штамм депонирован в Коллекции культур микроводорослей при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки - Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (далее Коллекция микроводорослей ИФН РАН, IPPAS) под номером IPPAS C-2073.

Ещё одним аспектом изобретения является получение каротиноидов с высоким содержанием лютеина, в процессе культивирования штамма Parachlorella sp. Nanno 1.

Также аспектом изобретения является способ получения каротиноидов, преимущественно лютеина, путем культивирования штамма Parachlorella sp. Nanno 1.

Предлагаемый штамм Parachlorella sp. Nanno 1 имеет ряд преимуществ, которые обеспечивают технический результат настоящего изобретения, заключающийся в следующем:

- новый штамм микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1 расширяет арсенал средств - источников каротиноидов, преимущественно лютеина;

- штамм Parachlorella sp. Nanno 1 обладает высокой продуктивностью по биомассе, а также по каротиноидам (порядка 1.4% сухих веществ);

- штамм микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1 обладает способностью продуцировать смесь каротиноидов, включающую лютеин, α-каротин, β-каротин неоксантин, виолаксантин, зеаксантин и неолютеин B, при их высоком содержании; при этом лютеин составляет порядка 2/3 от всех продуцируемых каротиноидов;

- штамм Parachlorella sp. Nanno 1 имеет высокую скорость роста с быстрым накоплением пигментов, простой протокол культивирования с легким масштабированием;

- биомасса микроводорослей Parachlorella sp. штамма Nanno 1 обладает хорошими органолептическими свойствами (приятный морской запах и приятный вкус), что является важным показателем и повышает перспективы и преимущества его использования как источника каротиноидов в производстве пищевых добавок, медицине и кормопроизводстве.

Штамм Parachlorella sp. Nanno 1 - потенциальный промышленный продуцент биологически активных веществ - каротиноидов, которые могут быть использованы в промышленности, здравоохранении, сельском хозяйстве, рыбоводстве и других отраслях.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - клетки микроводорослей Parachlorella sp. штамма Nanno 1 (светлопольная микроскопия, камера Leica Flexacam C3).

Термины и определения

Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Под штаммом Parachlorella sp. Nanno 1 понимается как штамм Parachlorella sp. Nanno 1, который был депонирован в Коллекции микроводорослей ИФН РАН, под номером IPPAS C-2073, так и мутантный штамм, полученный с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала, и сохраняющий все свойства исходного штамма, т.е. обладающий всеми определяющими штамм Parachlorella sp. Nanno 1 (идентифицирующими) характеристиками. В том числе, по меньшей мере, пригодный для применения в получении каротиноидов, прежде всего лютеина. В частности, штамм Parachlorella sp. Nanno 1 имеет следующие идентифицируемые особенности, включающие 1) способность продуцировать каротиноиды, прежде всего лютеин; 2) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами Parachlorella sp. Nanno 1, которые могут использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является Parachlorella sp. Nanno 1 (генетическая последовательность штамма зарегистрирована в GenBank под номером OR682196).

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное описание изобретения

Штамм Parachlorella sp. Nanno 1 выделен из смешанной культуры микроводорослей, относящихся к нескольким разным родам.

Штамм Parachlorella sp. Nanno 1 депонирован 25.12.2023 в Коллекции культур микроводорослей при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки - Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под номером IPPAS C-2073.

Идентификация штамма проводилась по результатам морфологического и молекулярно-генетического анализа, включая полногеномное секвенирование. Генетическая последовательность микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1 зарегистрирована в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером OR 682196.

Морфологические признаки: клетки одиночные, в общей слизи, шаровидные, 5-10 мкм в диаметре, с одним пристенным хлоропластом и с одним пиреноидом (редко двумя). Цитоплазма вакуолизирована, клеточная оболочка гладкая. Размножение 2-4 автоспорами. Снимок светлопольной микроскопии, отражающий морфологию микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1, представлен на Фиг. 1.

Степень чистоты: альгологически чистая культура.

Физиологические свойства штамма. Для культивирования возможно использование любой стерильной деионизованной воды, в частности, воды водопроводной, пропущенной через установку обратного осмоса без реминерализации. Оптимальная среда культивирования: классическая среда F/2, только вместо NaH₂PO₄ используется KH₂PO₄ + 2% NaCl + 75 мг/литр NaNO₃ + 0,25 ммоль/литр (NH₄)₂SO₄. Кратность среды F/2 можно повысить вплоть до 6х, как и добавление NaNO₃ до 6х (сульфат аммония повышать необязательно). Минимальная среда: F/2 + 2% NaCl + 0,25 ммоль/л (NH₄)₂SO₄. Состав газо-воздушной смеси (ГВС): атмосферный воздух (барботирование атмосферным воздухом, пропускаемым через среду). Температура: 25°С. Освещение: день/ночь при подращивании или круглосуточное для оптимального роста.

Характеристика штамма: штамм Parachlorella sp. Nanno 1 является продуцентом смеси каротиноидов (лютеин, α-каротин, β-каротин, неоксантин, виолаксантин, зеаксантин и неолютеин B) при их высоком содержании - порядка 14 мг/г сухого вещества, при этом порядка 2/3 продуцируемых каротиноидов составляет лютеин.

Идентификация штамма была произведена морфологически методами микроскопии. Молекулярно-генетический анализ проводился методом ПЦР участка ITS1-5.8S-ITS2, кроме того, ввиду невозможности однозначной идентификации методом ПЦР, дополнительно был проведен полногеномный анализ. В результате проведенных исследований штамм Nanno 1 был идентифицирован как кандидат на новый ранее не описанный род с Chlorella-подобной морфологией из Parachlorella-клады (Trebouxiophyceae, Chlorophyta). Верификация была проведена в том числе с привлечением «Альгологической коллекцией ACSSI» Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН - обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук».

Предварительный таксономический диагноз ставили на основе морфологического анализа, выполненного с помощью микроскопирования подготовленного препарата. Препарат был приготовлен на предметном стекле с каплей воды, в которую помещали образец штамма микроводоросли. Световую микроскопию осуществляли с помощью лабораторного микроскопа Leica DM750 (Германия). Результаты наблюдений документировали цветной цифровой фотографией на камеру Leica Flexacam C3 (Германия) (см. Фиг. 1). Было установлено, что клетки штамма Nanno 1 одиночные, в общей слизи, шаровидные, 5-10 мкм в диаметре, с одним пристенным хлоропластом и с одним пиреноидом (редко двумя). Цитоплазма вакуолизирована, клеточная оболочка гладкая. Размножение 2-4 автоспорами. В слизи некоторое время сохраняются остатки материнских оболочек. Предварительно штамм Nanno 1 по морфологическим признакам был определен как Chlorella sp., однако дальнейший молекулярно-генетический анализ показал, что это не верно.

Выделение ДНК штамма для анализа методом ПЦР проводили при помощи DNeasy (QIAGEN, США). Анализ гена 18S рРНК штамма в 1%-ном агарозном геле показал, что ампликоны стабильно были невысокого качества, несмотря на различные способы модификации протокола, что не позволило провести однозначную идентификацию. В связи с этим для проведения идентификации был использован другой ДНК-баркод - внутренний транскрибируемый спейсер 2 (ITS2). Для амплификации 18S pPHK и ITS2 использовали типовые праймеры.

По результату молекулярно-генетической идентификации исследуемый штамм микроводоросли Nanno 1 вошел в состав Parachlorella-клады (Trebouxiophyceae, Chlorophyta). Данная клада, сестринская кладе Chlorella, была выделена в 2004 году и впоследствии это разделение было подтверждено Yamamoto с соавт. (2005) на основании анализа ультраструктуры клеточных стенок автоспор. Представители клады широко распространены в пресноводных и соленых водоемах, могут быть обнаружены также в составе биопленок и в почве (Krivina et al., 2021; Song et al., 2018).

Представителей Parachlorella-клады можно разделить в 4 типа в зависимости от их морфологии, и штамм Nanno 1 вполне морфологически походит на Chlorella-подобные их виды, однако объединенные общей слизью. Анализируемый штамм Nanno 1 кластеризовался со штаммами Auxenochlorella pyrenoidosa strain 820 и Auxenochlorella pyrenoidosa isolate N с максимальной статистической поддержкой. Данный кластер формировал независимую филогенетическую линию в рамках Parachlorella-клады. При этом перечисленные штаммы не кластеризовались с представителями рода Auxenochlorella, в т.ч. с аутентичным штаммом типового вида Auxenochlorella protothecoides CCAP 211/7A. Генетические дистанции между штаммом Nanno 1 и сестринскими штаммами составили 1.1-2.8% (внутривидовой уровень). Для сравнения, внутри рода Parachlorella уровень генетических различий составлял 3.6-6.6%. Генетические дистанции между штаммами Nanno 1, strain 820, isolate N и другими представителями клады варьировали от 16.9% до 35.5%. Подобные значения соответствуют межвидовому и межродовому уровням. Так, генетические различия между родами Dictyosphaerium и Kalenjinia - 13.8-15.2%. Таким образом, штамм Nanno и сестринские ему штаммы strain 820 и isolate N являются представителями нового неописанного вида и, вероятно, рода в рамках Parachlorella-клады.

Для дополнительного подтверждения результатов молекулярно-генетического анализа было произведено полногеномное секвенирование штамма Nanno 1 на секвенаторе Illumina Novaseq 6000. Оценка покрытия генома осуществлялась с помощью программы Jellyfish v2.2.10. Анализ распределения k-меров (при k=23) показал среднее покрытие генома для образца ×60. Такие показатели свидетельствуют о достаточной глубине прочтения, хорошей покрывающей способности и, следовательно, высоком качестве секвенирования. Оценка качества исходных данных осуществлялась с помощью программы FastQC. Анализ прочтений демонстрирует отличное качество - такие показатели, как среднее качество по каждому нуклеотиду, длина прочтений, содержание адаптеров, наличие высокопредставленных последовательностей и т.д., соответствуют стандартам нормы. Для сборки использовался de novo сборщик SPAdes v.3.15.4. Оценка качества сборки генома осуществлялось с помощью программ QUAST и BUSCO. Результат анализа показал, что в сборке содержатся более 85% одноколейных ортологов таксономической группы Chlorophyta, что также подтверждает высокое качество сборки. Для сборки участка 18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S, по которому и проводился филогенетический анализ, использовался массив данных из более 3000 гомологичных rRNA-кодирующих участков по таксону 3041 из базы данных NCBI. Использовался метод таргетной сборки участка с использованием ридов, имеющих гомологию к последовательностям из массива. Итоговый участок имеет длину 4712 пар нуклеотидов (п. н.), из них 18S - 1798 п. н., ITS1 - 267 п. н., 5.8S - 154 п. н., ITS2 - 285 п. н., 28S (частичная) - 2206 п. н. Выравнивание последовательностей было произведено алгоритмом ClustalW, программа BioEdit. Построение укоренённого филогенетического дерева производилось в веб-сервере IQ-TREE со следующими параметрами: модель TIM2+I+G, gamma categories = 4, bootstrap alignments = 1000, остальные настройки - стандартные. Как показал проведенный анализ, анализируемая последовательность занимает уникальное филогенетическое положение, которое соответствует родовому уровню клады Parachlorella. Ближайшим родом является Parachlorella. В базе данных NCBI были найдены два вида, идентичные региону rRNA исследуемого организма и образующие с ним единую стабильную кладу: EU038290 и KJ868082. Их таксономическая принадлежность описана как Chlorella (или Auxenochlorella) pyrenoidosa, что, вероятно, неверно.

Анализ биотехнологических характеристик штамма Parachlorella sp. Nanno 1 показал, что он имеет высокую скорость роста с быстрым накоплением пигментов, что видно даже невооруженным глазом (при выходе на стадию плато, микроводоросль приобретает тёмно-зелёный, или даже практически чёрный цвет), а также является продуцентом смеси каротиноидов при их высоком содержании -порядка 14 мг/г сухого вещества, при этом порядка 2/3 продуцируемых каротиноидов составляет лютеин. Общее количество каротиноидов штамма Parachlorella sp. Nanno 1 может составлять до 1.4% от сухого веса, что можно сравнить с такими «чемпионами» по производству каротиноидов как Phaeodactylum trcornutum (1.02%), Isochrysis galbana (1.76%) (Di Lena et al., 2019) и Haematococcus pluvialis (2%) (Liu et al., 2016).

Благодаря способности штамма Parachlorella sp. Nanno 1 продуцировать каротиноиды с высоким уровнем накопления лютеина, штамм может быть использован как источник этих биологически активных веществ. Каротиноиды выполняют функции антиоксидантов в организме человека и животных, представители каротиноидов также являются метаболическими предшественниками витамина A.

Штамм Parachlorella sp. Nanno 1 может быть использован как сублимированная биомасса для создания капсулированных биологически активных добавок к пище (БАД) или в виде порошка (в том числе спрессованного в виде таблеток), в качестве источника каротиноидов, как монодобавка или в комбинации с другими биологически активными веществами. Также может быть использован в качестве кормовых добавок для животных. Благодаря своим антиоксидантным свойствам каротиноиды привлекают особое внимание в борьбе за предотвращение таких хронических заболеваний, как сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, болезни глаз, артрит, почечная недостаточность, остеопороз и даже когнитивные дисфункции. Витамин А входит в состав зрительного пигмента родопсина, что объясняет важную роль каротиноидов. Лютеин является главным защитным компонентом макулярного пигментного пятна и предотвращает развитие оксидативного стресса, возникающего от избытка синего компонента света (Cristaldi M. et al. Comparative Efficiency of Lutein and Astaxanthin in the Protection of Human Corneal Epithelial Cells In Vitro from Blue-Violet Light Photo-Oxidative Damage // Applied Sciences 2022, 12(3): 1268 https://doi.org:10.3390/app12031268). В качестве БАД штамм Parachlorella sp. Nanno 1 может быть использован для создания блюд с идеологией Окинавской диеты долголетия, то есть «лечение через питание» (Sho H. History and characteristics of Okinawan longevity food // Asia Pac. J. Clin. Nutr. 2001, 10, 159-64. https://doi.org/10.1111/j.1440-6047.2001.00235.x).

Наилучшее определение применения штамма Parachlorella sp. Nanno 1 как источника каротиноидов для аквакультуры рыб (например, таких как радужная форель, тилапия, морской окунь) и ракообразных (особенно креветок) - это «провитамины», то есть вещества, улучшающие конверсию корма, что способствует лучшему росту и развитию, укреплению их иммунной системы, что отражается на их лучшей выживаемости. Для аквакультуры личинок моллюсков (гребешки, мидии, устрицы) и трепангов (морские огурцы) применение штамма Parachlorella sp. Nanno 1 может быть основным кормом и лучшим кормом по сравнению с другими.

Каротиноиды, особенно лютеин, также являются природными пигментами, участвуют в окраске перьев и кожных покровов животных, усиливают окраску представителей аквакультуры. Таким образом, использование штамма Parachlorella sp. Nanno 1 в кормовых добавках может быть применимо не только в качестве источника биологически активных веществ, но и также с целью усиления окраски для усиления потребительской ценности продуктов (окраска желтков яиц, пигментация другой продукции птицеводства, а также продуктов животноводства и аквакультуры). Кроме того, лютеин может использоваться в качестве пищевого красителя, а также использоваться для окрашивания фармацевтических препаратов и косметики.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1

Для культивирования штамма Parachlorella sp. Nanno 1 использовали классическую F/2 среду, но без биотина, а вместо NaH₂PO₄ использовали KH₂PO₄, в которую были внесены дополнительные растворы солей: 200 г/л (или 20%) NaCl (стоковый 20× раствор), 0.5 моль/л (NH₄)₂SO₄ (стоковый 2000× раствор), 150 г/л NaNO₃ (стоковый 2000× раствор), витамины В1 и В12. Уровень рН в начале культивирования был установлен на значении 7.0. Корректировка уровня pH проводилась с использованием 2М HCl или 2M NaOH.

Культивирование проводилось в сосудах объемом 20 л и 250 л при температуре 25°С с использованием для барботирования атмосферного воздуха, пропускаемого через среду со скоростью 0.ю5-1 литра на литр среды в минуту. Для освещения использовали люминесцентные лампы, при этом при подращивании проводилось световая фаза 24 часа в сутки, интенсивность освещённости поддерживалась на уровне 200-240 люмен на литр (используются погружные лампы).

Как показали проведенные исследования, продуктивность штамма по накоплению биомассы (сухой вес) составила до 0.5 г/л, со среднесуточной скоростью роста (μ) до 0.69. По количеству клеток наблюдаемый прирост составил примерно от 2× в начале до 0.2× в сутки в конце культивационного цикла. Плотность культуры в конце культивирования составляла 50-90 миллионов клеток в мл. Поскольку штамм продуцирует большое количество пигментов (хлорофилл и различные каротиноиды), в конце культивационного цикла культура стала темно-зелёной, практически чёрной.

Анализ пигментного состава клеток проводили следующим образом. Пигменты экстрагировали 100% ацетоном. К осажденным клеткам добавляли 500 мкл 100% ацетона. Для полной экстракции пигментов клетки разрушали с помощью стеклянных шариков на вортексной мешалке и с использованием ультразвуковой ванны. Далее проводили центрифугирование со скоростью 10000 об/мин. Супернатант сливали в чистую пробирку, а к осадку добавляли еще 500 мкл 100% ацетона. Процедуру повторяли 5 раз, собирая супернатанты каждого образца в одной пробирке. Концентрацию пигментов определяли спектрофотометрически. Пигментный анализ образцов проводили хроматографически на колонке с обращенной фазой Agilent Zorbax SB-C18 5 мкм 4.6×250 мм. Для разделения смеси пигментов использовались смесь 23% этилацетата и 77% раствора С в качестве раствора А, чистый этилацетат как раствор В и смесь 90% ацетонитрила и 10% воды как раствор С. Скорость подачи растворителей - 1 мл/мин. ВЭЖХ-система состояла из насоса Shimadzu LC-10ADVP с модулем FCV-10ALVP для создания градиента растворителя на стороне низкого давления, детектора SPD-M20A и термостата CTO-20AC.

Состав фотосинтетических пигментов (мг/г сухой массы) на стадии плато представлен в Табл. 1:

Образец Nanno1, 250 л Nanno1, 20 л Хлорофилл a 41.84 35.85 Хлорофилл b 14.584 12.58 Хлорофилл (a+b) 56.424 48.43 Каротиноиды 14.07 10.83

Как видно из Табл. 1, выход полезного продукта, каротиноидов, составил более 14 мг на г сухой биомассы за культивационный цикл.

Проведенный анализ каротиноидного состава водорослей показал, что штамм Parachlorella sp. Nanno 1 является продуцентом различных каротиноидов, таких как: лютеин, α-каротин, β-каротин, неоксантин, виолаксантин, зеаксантин, и неолютеин-В (моно-Z-изомер (all-E)-лютеина, состоящий из (9Z)- или (9'Z)-лютеина или их смеси). При этом среди продуцируемых штаммом каротиноидов максимальный уровень накопления составляет лютеин (более 60%). Более подробный анализ каротиноидного состава микроводорослей штамма Parachlorella sp. Nanno 1 приведен в Табл. 2:

Каротиноид Образец Nanno1, 250 л Nanno1, 20 л Неоксантин 5.1 2.9 Виолаксантин 6.3 2.2 Лютеин 67.1 63.5 Зеаксантин 0.1 0.0 Неолютеин В 1.9 0.9 α-каротин 2.1 3.1 β-каротин 17.4 27.4

Таким образом, проведенное исследование показало, что штамм микроводорослей Parachlorella sp. Nanno 1 обладает высоким уровнем накопления смеси натуральных каротиноидов (14.07 мг на г сухой биомассы), главным образом лютеина (более 67%, т.е. около 2/3 от всех продуцируемых каротиноидов), что существенно превышает продуктивность многих известных продуцентов каротиноидов.

Как известно, условия культивирования (такие как освещение, состав и рН среды и др.) могут оказывать существенное влияние на продуктивность микроводорослей (см., например Lichtenthaler H.K. et al. Chlorophylls and Carotenoids: Measurement and Characterization by UV-VIS Spectroscopy // Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001, F4.3.1-F4.3.8), поэтому очевидно, что создание оптимальных условий культивирования штамма Parachlorella sp. Nanno 1 обеспечит более высокий уровень продуцирования каротиноидов, в том числе их отдельных фракций. Так, культивирование штамма Parachlorella sp. Nanno 1 в сосуде объемом 250 литров и освещением около 48 000 люмен показало содержание каротиноидов на стадии плато 14.07 мг/г сухой массы с содержанием лютеина 67.1%. Дальнейшая оптимизация условий выращивания будет способствовать еще большей продуктивности штамма.

Пример 2

Также было проведено исследование профиля жирных кислот, продуцируемых штаммом микроводорослей Parachlorella sp. Nanno 1. Анализ состава жирных кислот проводили следующим методом. Замороженные образцы (массой ~100 мг) в эппендорфах (вместимостью 2 мл) гомогенизировали в 1 мл раствора хлороформ/метанол (1:2) с добавлением ионола. Для повышения эффективности экстракции перемешивали образцы на вортексной мешалке с добавлением стеклянных шариков. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин и переносили супернатант в стеклянную пробирку с плотной крышкой. К осадку добавляли 1 мл раствора хлороформ/метанол (1:2) и 270 мкл 1% KCl, хорошо встряхивали (30 с) со стеклянными шариками. Для более полного разрушения клеток использовали ультразвуковую ванночку. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин и переносили супернатант в стеклянный флакон, содержащий супернатант, полученный на предыдущем этапе. К собранному супернатанту добавляли 670 мкл хлороформа и 0.4 мл 1% KCl, хорошо встряхивали, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Нижнюю фазу переносили в чистую стеклянную пробирку и высушивали в потоке азота. Метиловые эфиры жирных кислот получали добавлением 1 мл 8% (вес/объем) серной кислоты в метаноле. Образцы выдерживали при 90°C в течение 90 минут и охлаждали до комнатной температуры. Во флакон добавляли 1 мл 10% раствора хлорида натрия в воде и 250 мкл гексана, перемешивали, оставляли на рабочем столе на 10 минут, и переносили верхнюю фазу, содержащую метиловые эфиры жирных кислот, во флакон для газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Полученные эфиры жирных кислот анализировали методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии Идентификацию пиков на хроматограммах суммарных ионов проводили сравнением с Реестром масс-спектральных данных Wiley и хроматографического профиля образца с профилем стандартов жирных кислот Supelco 37 Component FAME Mix (Sigma-Aldrich). Площади пиков устанавливалась путем компьютеризированного интегрирования.

Жирнокислотный состав клеток микроводорослей штамма Parachlorella sp. Nanno 1 на стадии роста по результатам проведенного анализа приведен в Табл. 3:

Жирная кислота Содержание (моль % от общего количества) 16:0 17.2 ± 0.3 16:1Δ⁷ 5.0 ± 0.7 16:2Δ^7,10 15.7 ± 0.8 16:3Δ^7,10,13 14.2 ± 0.1 16:4Δ^4,7,10,13 - 18:0 1.3 ± 0.03 18:1Δ⁹ - 18:2Δ^9,12 20.0 ± 1.5 18:3Δ^9,12,15 22.8 ± 0.1 18:3Δ^6,9,12 - 18:4Δ^6,9,12,15 - 20:0 2.5 ± 0.2 Другие 1.3 ± 0.4 Индекс ненасыщенности 2.05

Как показал проведенный анализ, несмотря на разнообразный состав жирных кислот, общее количество жирных кислот в сухой биомассе микроводорослей невысокое, что делает нецелесообразным рассмотрение штамма Parachlorella sp. Nanno 1 как значимого источника жирных кислот для целей пищевой промышленности.

Таким образом, в результате изучения потенциала нового штамма микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1 было установлено, что штамм демонстрирует высокую способность к продуцированию каротиноидов, с накоплением преимущественно лютеина; продуцирование жирных кислот штаммом существенно менее значимо. Такие свойства штамма микроводорослей Parachlorella sp. Nanno 1 позволяют рассматривать его в первую очередь как источник лютеина.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новому штамму микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1, депонированному в Коллекции микроводорослей ИФН РАН под номером IPPAS C-2073 - продуценту каротиноидов, особенно лютеина. Продуцируемые вещества могут быть использованы в биологически активных добавках и пищевых добавках для человека, а также в различных кормовых добавках, прежде всего для аквакультуры. Новый штамм обладает способностью накопления высокого уровня каротиноидов с преимущественным накоплением лютеина, который составляет порядка 2/3, при этом биомасса штамма обладает хорошими органолептическими свойствами. Штамм имеет высокую скорость роста с быстрым накоплением пигментов, а также простой протокол культивирования с легким масштабированием. 1 ил., 3 табл., 2 пр.

Штамм микроводоросли Parachlorella sp. Nanno 1, депонированный в Коллекции культур микроводорослей при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки - Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под номером IPPAS C-2073, - продуцент каротиноидов с преимущественным накоплением лютеина.