Морская микроводоросль - продуцент бета-каротина, лютеина и иных каротиноидов Российский патент 2025 года по МПК C12N1/12 

Область техники

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения биологически активных веществ, прежде всего каротиноидов, особенно лютеина и бета-каротина, для использования в биологически активных добавках (БАД) и пищевых добавках для человека, а также в различных кормовых добавках, прежде всего для аквакультуры.

Предшествующий уровень техники

Каротиноиды необходимы растениям для регуляции фотосинтеза и используются ими прежде всего в качестве антиоксидантов. В организме животных каротиноиды чаще всего играют роль провитаминов, то есть как предшественники прежде всего ретиноидов (группа сходных по структуре соединений, включая Витамин А). Однако современные данные показывают, что спектр биологической активности каротиноидов в организме животных существенно больше, что хорошо видно на примере лютеина, из которого не могут быть получены ретиноиды. Современные исследования демонстрируют колоссальную роль каротиноидов в здоровье человека и животных на протяжении всей жизни, и их использование может существенно улучшить качество жизни конечного потребителя.

Каротиноиды широко используются в аквакультуре и в качестве кормовых добавок для животных и птицы. В последнее время спрос на каротиноиды существенно вырос. При этом химически синтезированные каротиноиды характеризуются крайне низкой растворимостью в водной среде и способностью образовывать крупные агрегаты. Это существенно уменьшает их биодоступность как для человека, так и для животных. В дополнение к этому, синтетические каротиноиды часто образуют различные пространственные E- и Z-изомеры с искривленной структурой, которые становятся неузнаваемыми для ферментов человека, поэтому затрудняется их выведение из организма при избытке. Это может привести к их накоплению в форме агрегатов и даже привести к патологиям зрения. Прямые сравнения синтетических каротиноидов с природными каротиноидами, находящимися в нативной среде (например, мука остатков крабов), показывают, что природные каротиноиды существенно лучше стимулируют рост мальков рыб, чем синтетические (Goda A.A. et al., Evaluation of Natural and Synthetic Carotenoid Supplementation on Growth, Survival, Total Carotenoid Content, Fatty Acids Profile and Stress Resistance of European Seabass, Dicentrarchus labrax // Aquaculture Studies 2018, 18(1), 27-39. https://doi.org/10.4194/2618-6381-v18_1_04). Поэтому «нативные» каротиноиды, полученные, например, в форме лиофилизированной биомассы микроводорослей являются наиболее подходящими и для пищевых и кормовых добавок.

Многие эукариотические микроводоросли способны накапливать в сотни и иногда даже тысячи раз больше каротиноидов, чем любые известные высшие растения, что связано с их порой экстремальными условиями жизни. Именно это свойство синтезировать гигантское количество каротиноидов стало использоваться для создания биологически активных пищевых и кормовых добавок. Промышленное культивирование микроводорослей используется сейчас уже во многих странах.

Известны разные микроводоросли, являющиеся продуцентами различных каротиноидов, например, штамм Mallomonas kalinae SX-1 ВКПМ Al-23 - продуцент фукоксантина (RU 2644260, публ. 08.02.2018), штамм Coelastrella sp. K1 (IPPAS С-2028) - продуцент смеси астаксантина и β-каротина (RU 2703420, публ. 16.10.2019). Некоторые представители микроводорослей рода Desmodesmus также известны как возможные продуценты каротиноидов. Так, например, известны штаммы Desmodesmus sp. (2-6) и Desmodesmus sp. (RUC-2), выделенные из пресноводных водоемов Швеции, способные продуцировать липиды и различные каротиноиды (Mehariya et al. Improving the content of high value compounds in Nordic Desmodesmus microalgal strains // Bioresour. Technol., 2022, 359, 127445. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2022.127445).

Несмотря на большое разнообразие микроорганизмов, способных продуцировать каротиноиды, все они обладают разной способностью к их продуцированию, а среди самих каротиноидов встречается колоссальное разнообразие (в настоящее время описано около 600 различных каротиноидов), при этом микроорганизмы имеют разные требования к условиям культивирования (во многих случаях не подходящих для промышленного применения по экологическим нормам и/или требующих непосредственной близости к морю). Кроме того, не все штаммы являются коммерчески доступными. В связи с этим поиск новых штаммов - продуцентов каротиноидов, является актуальной задачей.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема и задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в получении нового штамма микроводоросли с высоким уровнем накопления лютеина и β-каротина (бета-каротина).

Задача решается путем получения нового штамма Desmodesmus subspicartus (Chodat) E/Hegewald & A/W/F/Schmidt 2000 (Dia 5) - продуцента каротиноидов, с преимущественным накоплением лютеина и β-каротина. Штамм депонирован в Коллекции культур микроводорослей при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки - Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (далее Коллекция микроводорослей ИФН РАН, IPPAS) под номером IPPAS C-2072 (краткое название штамма - Desmodesmus subspicartus Dia 5).

Еще одним аспектом изобретения является получение каротиноидов, преимущественно лютеина и β-каротина, в процессе культивирования штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5.

Также аспектом изобретения является способ получения каротиноидов, преимущественно лютеина и β-каротина, путем культивирования штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5.

Предлагаемый штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 имеет ряд преимуществ, которые обеспечивают технический результат настоящего изобретения, заключающийся в следующем:

- новый штамм микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5 расширяет арсенал средств - источников каротиноидов, с преимущественным содержанием лютеина и β-каротина;

- штамм микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5 обладает способностью продуцировать смесь каротиноидов, включающую лютеин, α-каротин, β-каротин, неоксантин, виолаксантин и неолютеин В, с высоким уровнем их накопления (не менее 12.2 мг/г биомассы), при этом порядка 64% из них составляет лютеин и порядка 22% - β-каротин;

- биомасса микроводорослей Desmodesmus subspicartus штамма Dia 5 обладает хорошими органолептическими свойствами (приятный морской запах и приятный вкус), что является важным показателем и повышает перспективы и преимущества его использования как источника каротиноидов в производстве пищевых добавок, медицине и кормопроизводстве;

- штамм микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5 нетребователен к условиям культивирования: культивирование проводится одностадийно, при этом не требуется высокого содержания NaCl в среде для культивирования (достаточно содержания на уровне физраствора), что позволяет выращивать штамм вдали от морского побережья и не оказывает высокой нагрузки на окружающую среду при рециркуляции отработанной среды.

Штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 - потенциальный промышленный продуцент биологически активных веществ - каротиноидов, которые могут быть использованы в промышленности, здравоохранении, сельском хозяйстве, рыбоводстве и других отраслях.

Краткое описание рисунков

Фигура - клетки микроводорослей Desmodesmus subspicartus штамма Dia 5 (светлопольная микроскопия, камера Leica Flexacam C3).

Термины и определения

Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Термин «необязательный» или «необязательно» или «опциональный» или «опционально», используемый в данном документе, означает, что описываемое впоследствии событие или обстоятельство может, но не обязательно, произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых оно не происходит.

Под штаммом Desmodesmus subspicartus Dia 5 понимается как штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5, который был депонирован в Коллекции микроводорослей ИФН РАН, под номером IPPAS C-2072, так и мутантный штамм, полученный с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала, и сохраняющий все свойства исходного штамма, т.е. обладающий всеми определяющими штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 (идентифицирующими) характеристиками. В том, числе, по меньшей мере, пригодный для применения в получении каротиноидов, прежде всего лютеина и β-каротина. В частности, штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 имеет следующие идентифицируемые особенности, включающие 1) способность продуцировать каротиноиды, прежде всего лютеин и β-каротин; 2) наличие обязательных генов с идентичностью более 95%, более 96%, более 97%, более 98% или более 99% с обязательными генами Desmodesmus subspicartus Dia 5, которые могут использоваться для подтверждения того, что анализируемый вариант является Desmodesmus subspicartus Dia 5 (генетическая последовательность штамма зарегистрирована в GenBank под номером OR682197).

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Подробное описание изобретения

Штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 изолирован из прибрежных вод Азовского моря в районе станицы Должанская Краснодарского края.

Полное название штамма - Desmodesmus subspicartus (Chodat) E/Hegewald & A/W/F/Schmidt 2000 (Dia 5). Краткое название - Desmodesmus subspicartus Dia 5.

Штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 депонирован 25.12.2023 в Коллекции культур микроводорослей при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки - Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под номером IPPAS C-2072.

Генетическая последовательность микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5 зарегистрирована в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером OR682197.

Морфологические признаки: клетки шаровидной или широкоовальной формы, клеточная оболочка жесткая, содержит на своей поверхности короткие (до 1 мкм длиной) шипы. Пиреноид присутствует, размер клеток 4.5-8.5 мкм в диаметре. Хроматофор одиночный, пристенный, жгутик отсутствует. В цитоплазме присутствуют зерна запасных питательных веществ. Размножение автоспорами, преимущественно 4 автоспоры равного размера. Характер роста на среде хранения: на твердой среде зеленые колонии. Снимок светлопольной микроскопии, отражающий морфологию микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5, представлен на Фигуре.

Степень чистоты: альгологически чистая культура.

Физиологические свойства штамма. Оптимальные условия культивирования: возможно использование любой стерильной деионизованной воды, в частности, воды водопроводной, пропущенной через установку обратного осмоса без реминерализации. Используется классическая F/2 среда, но без биотина, а вместо NaH₂PO₄ используют KH₂PO₄. Дополнительные растворы солей: 200 г/л (или 20%) NaCl (стоковый 20× раствор), 0,5 моль/л (NH₄)₂SO₄ (стоковый 2000× раствор), 150 г/л NaNO₃ (стоковый 2000× раствор). Минимальная среда: F/2 + 1% NaCl, при этом pH в конце культивирования может повыситься. Также может расти на стандартной среде BG-11. Состав газо-воздушной смеси (ГВС): атмосферный воздух (барботирование атмосферным воздухом, пропускаемым через среду). Температура: 20-30°С. Освещение: день/ночь или круглосуточное.

Характеристика штамма: штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 является продуцентом каротиноидов (лютеин, α-каротин, β-каротин, неоксантин, виолаксантин и неолютеин В). Выход полезного продукта - не менее 12.2 мг на г сухой биомассы (из которых лютеин - порядка 64% и β-каротин - порядка 22%). Также в незначительном количестве продуцирует полиненасыщенные жирные кислоты, в том числе линоленовую кислоту (до 33.7% от всех жирных кислот).

Идентификация штамма была произведена морфологически методами микроскопии. Молекулярно-генетический анализ проводился методом ПЦР участка ITS1-5.8S-ITS2. Как показал проведенный анализ, штамм Dia 5 является представителем вида Desmodesmus subspicatus (Chlorophyceae, Chlorophyta), несмотря на отсутствие типичных для рода ценобиев в культуре. Верификация была проведена в том числе с привлечением «Альгологической коллекции ACSSI» Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН - обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук».

Предварительный таксономический диагноз ставили на основе морфологического анализа, выполненного с помощью микроскопирования подготовленного препарата. Препарат был приготовлен на предметном стекле с каплей воды, в которую помещали образец штамма микроводоросли. Световую микроскопию осуществляли с помощью лабораторного микроскопа Leica DM750 (Германия). Результаты наблюдений документировали цветной цифровой фотографией на камеру Leica Flexacam C3 (Германия) (см. Фигура).

Клетки штамма Dia 5 одиночные, широкоовальные или шаровидные, с одним пристенным хлоропластом и одним пиреноидом, размером 4.5-8.5 мкм, в цитоплазме присутствуют запасные питательные вещества. Клеточная оболочка жесткая, содержит на своей поверхности короткие (до 1 мкм длиной) шипы. Размножение (2)-4-(8) автоспорами. В культуре присутствуют «гигантские» клетки неправильной формы с несколькими пиреноидами, которые скорее всего представляют собой слившиеся автоспоры. Остатки материнских оболочек некоторое время сохраняются в культуре, ослизняются.

Род Desmodesmus (Chlorophyceae, Chlorophyta) выделен относительно недавно на основе анализа 18S рРНК и внутреннего транскрибируемого спейсера ITS2 (An et al., 1999). Морфологически представители Desmodesmus близки к представителям Scenedesmus. Традиционно они имеют удлиненные клетки различной формы, которые обычно расположены в плоских ценобиях от 2 до 32 клеток в один или два ряда (Komarek, Fott, 1983). При этом иногда в различных популяциях одного и того же вида, изолированных из одного и того же экотопа, соотношение одиночных клеток и ценобиев может сильно варьироваться. Так, популяции, представленные практически полностью одноклеточными организмами, могут соседствовать в одном водоеме с преимущественно ценобиальными популяциями (Hegewald et al., 2001). Также, еще одной характерной чертой этого рода является наличие четырехслойной клеточной стенки с субмикроскопическими структурами, которые часто видны под световым микроскопом в виде грануляций или ребер. Кроме того, у большинства видов Desmodesmus есть один или несколько шипов (Hegewald, 1978; An et al., 1999). Представители этого рода широко встречаются в пресных и солоноватых водах по всему земному шару (Fawley et al., 2013; Nguyen et al., 2023; Hegewald et al., 2001). Исследуемый штамм Dia 5 кластеризовался с представителями Desmodesmus subspicatus UTEX 2532 и SAG 54.80 с высокой статистической поддержкой (BP - 97%). Хотя для Desmodesmus subspicatus аутентичный штамм не назначен, именно штамм UTEX 2532 был использован Hegewald с соавт. (2001) для анализа связей внутри рода Desmodesmus на основании анализа гена 18S рРНК. Генетические дистанции между штаммом Dia 5 и сестринскими штаммами составляли 1.4-1.9%, c другими представителями рода - от 2.9% до 32.4%. Генетические дистанции между Desmodesmus protuberans и Desmodesmus pseudoprotuberans - 1%, однако, это единственное исключение. В остальных случаях межвидовые различия выше, например, генетические дистанции между Desmodesmus shmidtii и Desmodesmus protuberans - 2.4%.

Благодаря способности штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 продуцировать каротиноиды с высоким уровнем накопления лютеина и β-каротина, штамм может быть использован как источник этих биологически активных веществ. Каротиноиды выполняют функции антиоксидантов в организме человека и животных, представители каротиноидов также являются метаболическими предшественниками витамина A; наиболее важным среди них является β-каротин. Помимо провитаминной и антиоксидантной активности, каротиноиды могут стимулировать функции иммунных клеток и модулировать иммунную активность.

Штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 может быть использован как сублимированная биомасса для создания капсулированных биологически активных добавок к пище (БАД) или в виде порошка (в том числе спрессованного в виде таблеток), в качестве источника каротиноидов, как монодобавка или в комбинации с другими биологически активными веществами. Также может быть использован в качестве кормовых добавок для животных. Благодаря своим антиоксидантным свойствам каротиноиды привлекают особое внимание в борьбе за предотвращение таких хронических заболеваний, как сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет, болезни глаз, артрит, почечная недостаточность, остеопороз и даже когнитивные дисфункции. Витамин А входит в состав зрительного пигмента родопсина, что объясняет важную роль каротиноидов, особенно β-каротина. Лютеин является главным защитным компонентом макулярного пигментного пятна и предотвращает развитие оксидативного стресса, возникающего от избытка синего компонента света (Cristaldi M. et al. Comparative Efficiency of Lutein and Astaxanthin in the Protection of Human Corneal Epithelial Cells In Vitro from Blue-Violet Light Photo-Oxidative Damage // Applied Sciences 2022, 12(3):1268 https://doi.org:10.3390/app12031268). В качестве БАД штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 может быть использован для создания блюд с идеологией Окинавской диеты долголетия, то есть «лечение через питание» (Sho H. History and characteristics of Okinawan longevity food // Asia Pac. J. Clin. Nutr. 2001, 10, 159-64. https://doi.org/10.1111/j.1440-6047.2001.00235.x). Каротиноиды также применяются в технологии пищевых продуктов, как пищевые красители, а в последнее время также все больше с целью создания пищевых продуктов функционального назначения, обогащенных каротиноидами (Ачмиз А.Д. и др. Физиологическая роль каротиноидов и их применение в технологиях пищевых продуктов // Новые технологии, 2023, 19(1):14-25).

Наилучшее определение применения штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 как источника каротиноидов для аквакультуры рыб (например, таких как радужная форель, тилапия, морской окунь) и ракообразных (особенно креветок) е это «провитамины», то есть вещества, улучшающие конверсию корма, что способствует лучшему росту и развитию, укреплению их иммунной системы, что отражается на их лучшей выживаемости. Для аквакультуры личинок моллюсков (гребешки, мидии, устрицы) и трепангов (морские огурцы) применение штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 может быть основным кормом и лучшим кормом по сравнению с другими.

Каротиноиды также являются природными пигментами, участвуют в окраске перьев и кожных покровов животных, усиливают окраску представителей аквакультуры. Поэтому использование штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 в кормовых добавках может быть применимо не только в качестве источника биологически активных веществ, но и также с целью усиления окраски для усиления потребительской ценности продуктов (окраска желтков яиц, пигментация другой продукции птицеводства, а также продуктов животноводства и аквакультуры).

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1

Для культивирования штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 использовали классическую F/2 среду, но без биотина, а вместо NaH₂PO₄ использовали KH₂PO₄, в которую были внесены дополнительные растворы солей: 200 г/л (или 20%) NaCl (стоковый 20× раствор), 0,5 моль/л (NH₄)₂SO₄ (стоковый 2000× раствор), 150 г/л NaNO₃ (стоковый 2000× раствор). Для создания солености использовали NaCl 1% (конечная концентрация). В начале культивирование запускали на 1× или 2× среде, после достижения околомаксимальной оптической плотности были добавлены дополнительное количество среды F/2 (до 4-5×) и NaNO₃ и культивирование было продолжено. Уровень рН в начале культивирования был установлен на значении 7.0. Корректировка уровня pH проводилась с использованием 2М HCl или 2M NaOH.

Культивирование проводилось в сосудах объемом 20 л и 250 л при температуре от 20 до 30°С с использованием для барботирования атмосферного воздуха, пропускаемого через среду со скоростью 0.5-1 литра на литр среды в минуту. Для освещения использовали люминесцентные лампы, при этом проводилось постоянное освещение (24 часа в сутки), интенсивность освещенности поддерживалась на уровне 3.25-3.5 мкмоль/сек на литр (лампы помещены внутрь раствора).

Как показали проведенные исследования, продуктивность штамма по накоплению биомассы (сухой вес) составила до 0.5 г/л, со среднесуточной скоростью роста (μ) до 0.56. По количеству клеток наблюдаемый прирост составил примерно от 2× в начале до 0.2× в сутки в конце культивационного цикла. Плотность культуры в конце культивирования составляла 50-70 миллионов клеток в мл.

Анализ пигментного состава клеток проводили следующим образом. Пигменты экстрагировали 100% ацетоном. К осажденным клеткам добавляли 500 мкл 100% ацетона. Для полной экстракции пигментов клетки разрушали с помощью стеклянных шариков на вортексной мешалке и с использованием ультразвуковой ванны. Далее проводили центрифугирование со скоростью 10 000 об/мин. Супернатант сливали в чистую пробирку, а к осадку добавляли еще 500 мкл 100% ацетона. Процедуру повторяли 5 раз, собирая супернатанты каждого образца в одной пробирке. Концентрацию пигментов определяли спектрофотометрически. Пигментный анализ образцов проводили хроматографически на колонке с обращенной фазой Agilent Zorbax SB-C18 5 мкм 4.6×250 мм. Для разделения смеси пигментов использовались смесь 23% этилацетата и 77% раствора С в качестве раствора А, чистый этилацетат как раствор В и смесь 90% ацетонитрила и 10% воды как раствор С. Скорость подачи растворителей - 1 мл/мин. ВЭЖХ-система состояла из насоса Shimadzu LC-10ADVP с модулем FCV-10ALVP для создания градиента растворителя на стороне низкого давления, детектора SPD-M20A и термостата CTO-20AC.

Состав фотосинтетических пигментов (мг/г сухой массы) на стадии плато представлен в Табл. 1:

Образец Dia5, 250л Dia5, 20л Хлорофилл a 36.40 38.55 Хлорофилл b 12.541 13.42 Хлорофилл (a+b) 48.941 51.97 Каротиноиды 12.21 12.62

Как видно из Табл. 1, выход полезного продукта, каротиноидов, составил порядка 12.21-12.62 мг на г сухой биомассы.

Проведенный анализ каротиноидного состава водорослей показал, что штамм Desmodesmus subspicartus Dia 5 является продуцентом различных каротиноидов, таких как лютеин, α-каротин, β-каротин, неоксантин, виолаксантин и неолютеин В (моно-Z-изомер (all-E)-лютеина, состоящий из (9Z)- или (9'Z)-лютеина или их смеси). При этом среди продуцируемых штаммом каротиноидов максимальный уровень накопления составляют лютеин (около 64 %) и β-каротин (около 22%). Боле подробный анализ каротиноидного состава микроводорослей штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 приведен в Табл. 2:

Каротиноид Образец Dia5, 250л Dia5, 20л Неоксантин 4.6 4.2 Виолаксантин 4.6 3.9 Лютеин 63.7 64.9 Зеаксантин 0.0 0.0 Неолютеин В 2.0 2.5 α-каротин 3.0 2.9 β-каротин 22.1 21.6

Таким образом, проведенное исследование показало, что штамм микроводорослей Desmodesmus subspicartus Dia 5 обладает высоким уровнем накопления смеси натуральных каротиноидов (порядка 4.5 мг на г сухой биомассы), главным образом лютеина (порядка 64%) и β-каротина (более 50% на стадии роста, но с уменьшением до 22% на стадии плато).

Как известно, условия культивирования (такие как освещение, состав и рН среды и др.) могут оказывать существенное влияние на продуктивность микроводорослей (см., например Lichtenthaler H.K. et al. Chlorophylls and Carotenoids: Measurement and Characterization by UV-VIS Spectroscopy // Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001, F4.3.1- F4.3.8), поэтому очевидно, что создание оптимальных условий культивирования штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 обеспечит более высокий уровень продуцирования каротиноидов, в том числе их отдельных фракций.

Пример 2

Также было проведено исследование профиля жирных кислот, продуцируемых штаммом микроводорослей Desmodesmus subspicartus Dia 5. Анализ состава жирных кислот проводили следующим методом. Замороженные образцы (массой ~100 мг) в эппендорфах (вместимостью 2 мл) гомогенизировали в 1 мл раствора хлороформ/метанол (1:2) с добавлением ионола. Для повышения эффективности экстракции перемешивали образцы на вортексной мешалке с добавлением стеклянных шариков. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин и переносили супернатант в стеклянную пробирку с плотной крышкой. К осадку добавляли 1 мл раствора хлороформ/метанол (1:2) и 270 мкл 1% KCl, хорошо встряхивали (30 с) со стеклянными шариками. Для более полного разрушения клеток использовали ультразвуковую ванночку. Центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин и переносили супернатант в стеклянный флакон, содержащий супернатант, полученный на предыдущем этапе. К собранному супернатанту добавляли 670 мкл хлороформа и 0.4 мл 1% KCl, хорошо встряхивали, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Нижнюю фазу переносили в чистую стеклянную пробирку и высушивали в потоке азота. Метиловые эфиры жирных кислот получали добавлением 1 мл 8% (вес/объем) серной кислоты в метаноле. Образцы выдерживали при 90°C в течение 90 минут и охлаждали до комнатной температуры. Во флакон добавляли 1 мл 10% раствора хлорида натрия в воде и 250 мкл гексана, перемешивали, оставляли на рабочем столе на 10 минут, и переносили верхнюю фазу, содержащую метиловые эфиры жирных кислот, во флакон для газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Полученные эфиры жирных кислот анализировали методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии Идентификацию пиков на хроматограммах суммарных ионов проводили сравнением с Реестром масс-спектральных данных Wiley и хроматографического профиля образца с профилем стандартов жирных кислот Supelco 37 Component FAME Mix (Sigma-Aldrich). Площади пиков устанавливалась путем компьютеризированного интегрирования.

Жирнокислотный состав клеток микроводорослей штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 по результатам проведенного анализа приведен в Табл. 3:

Жирная кислота Содержание (моль % от общего количества) 16:0 18.6 ± 0.5 16:1Δ⁷ 5.3 ± 0.3 16:2Δ^7,10 2.2 ± 0.1 16:3Δ^7,10,13 2.6 ± 0.1 16:4Δ^4,7,10,13 18.7 ± 1.1 18:0 0.8 ± 0.6 18:1Δ⁹ 2.1 ± 0.3 18:2Δ^9,12 8.4 ± 0.3 18:3Δ^9,12,15 33.7 ± 0.8 18:3Δ^6,9,12 1.6 ± 0.1 18:4Δ^6,9,12,15 4.0 ± 0.2 20:0 - Другие 2.0 ± 0.1 Индекс ненасыщенности 2.46

Как показал проведенный анализ, несмотря на разнообразный состав жирных кислот, общее количество жирных кислот в сухой биомассе микроводорослей составляет всего около 20%, что делает нецелесообразным рассмотрение штамма Desmodesmus subspicartus Dia 5 как значимого источника жирных кислот для целей пищевой промышленности.

Таким образом, в результате изучения потенциала нового штамма микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5 было установлено, что штамм демонстрирует высокую способность к продуцированию каротиноидов, с накоплением преимущественно лютеина и β-каротина, продуцирование жирных кислот штаммом существенно менее значимо. Такие свойства штамма микроводорослей Desmodesmus subspicartus Dia 5 позволяют рассматривать его в первую очередь как источник бета-каротина и лютеина.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новому штамму микроводоросли Desmodesmus subspicartus Dia 5, депонированному в Коллекции микроводорослей ИФН РАН под номером IPPAS C-2072 – продуценту каротиноидов, особенно лютеина и бета-каротина. Продуцируемые вещества могут быть использованы в биологически активных добавках и пищевых добавках для человека, а также в различных кормовых добавках, прежде всего для аквакультуры. Новый штамм обладает способностью накопления высокого уровня одновременно лютеина и β-каротина, при этом биомасса штамма обладает хорошими органолептическими свойствами. Штамм нетребователен к условиям культивирования, в том числе не требует высокой концентрации NaCl в среде культивирования. 1 ил., 3 табл., 2 пр.

Штамм микроводоросли Desmodesmus subspicartus (Chodat) E/Hegewald & A/W/F/Schmidt 2000 (Dia 5), депонированный в Коллекции культур микроводорослей при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки – Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН под номером IPPAS C-2072, – продуцент каротиноидов с преимущественным накоплением лютеина и β-каротина.