ВАКЦИНА ОВАК ПРОТИВ СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ-76 ПТИЦ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/12 C12N7/00 A61K39/235 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается создания новой вакцины для специфической профилактики синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76) птиц в угрожаемых и неблагополучных хозяйствах.

Известна вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц, включающая инактивированный формалином антиген из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц ВС-14 и масляный адъювант нераскрытого состава [1]
Недостатком данной вакцины является невысокая иммуногенность, и стабильность. Кроме того, использование для инактивации растворов формалина не обеспечивает отсутствие в ней остаточной инфекционности.

Известна также вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц, включающая инактивированный этилениминоэтилоксамидом антиген из штамма вируса снижения яйценокскости-76 птиц В8/78, солевой растворитель-стабилизатор и масляный адъювант на основе соевого масла, лецитина и сорбита [2]
Недостатком данной вакцины является также недостаточно высокая иммуногенность и стабильность, более высокая себестоимость при ее получении и более высокие трудозатраты при ее использовании.

Целью настоящего изобретения является увеличение иммуногенности вакцины, повышение ее стабильности, а также снижение себестоимости при ее получении и снижение трудозатрат при ее использовании.

Указанная цель достигается тем, что вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц содержит в качестве инактивированного антигена из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц инактивированный димерэтиленимином антиген из штамма вируса снижения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10^6,0-10^8,0 ЭИД_50/0,2 см³ и с активностью в РГА до и после инактивации 16-12 лог₂, в качестве солевого разбавителя-стабилизатора: фосфатно-буферный раствор с pH 7,2-7,4, либо раствор Хенкса или раствор Эрла и в качестве адъюванта 5% взвесь двуокиси кремния или 6% суспензия гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов (в мас.):
Инактивированный димерэтиленимином антиген из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93"-ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10^6,0-10^8,0 ЭИД_50/0,2см³ и с активностью в РГА до и после инактивации 16-12 лог₂ 16,6 33,2
Фосфатно-буферный раствор с pH 7,2-7,4, либо раствор Хенкса или раствор Эрла 66,4 82,8
5-ная взвесь двуокиси кремния или 6-ная суспензия гидроокиси алюминия - 0,4 0,6
Для изготовления вакцины используют штамм вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц "Б-93".

Вакцинный штамм "Б-93" выделено т больных кур и получен в результате адаптации к утиным эмбрионам.

Штамм вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц "Б-93" депонирован в коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, имеет регистрационный N 98.

Штамму вируса против ССЯ-76 ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП присущи следующие признаки и свойства.

Морфологические признаки. При электронно-скопическом исследовании штамм N 98 "Б-93" ВГНКИ представлен вирионами икосаэдрической формы, которые лишены суперкапсидной оболочки и не содержат липидов. Коэффициент седиментации 550.

Не установлено наличия вирионов морфологически отличных от вируса сем. Аденовирусов.

Культуральные свойства. Штамм N 98 "Б-93" ВГНКИ хорошо размножается в 10-12-дневных утиных эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость. Инфекционная активность штамма через 120 часов при температуре 37,5^oC составляет не менее 10^6,0 ЭИД_50/0,2 см³.

Штамм также культивируется в куриных эмбрионах и первичной культуре клеток утиных фибробластов, вызывая цитопатическое действие.

Гемагглютинирующие свойства. Штамм N 98 "Б-93" ВГНКИ обладает выраженными гемагглютинирующими свойствами. Агглютинирует эритроциты кур и уток, вызывая образование среднезернистой реакции гемагглютинации с предельным титром 12-16 лог₂.

Антигенные свойства. Через 14-21 день после заражения 120-дневных кур отмечают появление вируснейтрализующих и гемагглютинирующих антител. Титр антигемагглютинирующих антител составляет 7,0 лог₂ и более с последующим их возрастанием.

Инфекционные свойства. К штамму N 98 "Б-93" ВГНКИ восприимчивы куры, утки и гуси при интратрахеальном, оральном, внутримышечном заражениях. начиная с 14 дня после введения вируса 120-дневным цыплятам отмечают появление депигментированных и лишенных скорлупы яиц. В течение четырех недель процент яиц с мягкой скорлупой и бесскорлупных составляет около 30% и более.

Клинических признаков болезни при экспериментальном и естественном заражениях вирус не вызывает. Патологоанатомические изменения не выражены и определяются только гистологически в виде внутринуклеарных включений в клетках эпителия железистого желудка.

Устойчивость штамма. Штамм N 98 "Б-93" ВГНКИ стабилен при pH в пределах 6,0-9,0. Устойчив к жирорастворителям. Инактивируется при 56^oC.

Пример 1. Штамм вируса ССЯ-76 "Б-93" размножают на утиных эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость в дозе 2,0 3,0 лг ЭИД_50/0,2мл. Эмбрионы инкубируют в течение 96 120 ч при 37,0±0,5^oC. Через 120 ч эмбрионы охлаждают при температуре +4 +8^oC в течение 24-36 ч и используют для сбора вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости. Жидкость собирают во флаконы емкостью 200 500 см³. Из каждого флакона берут пробу по 0,8 см³ для проверки на стерильность, в объеме 0,2 см³ путем высева на питательные среды: МПА, МПБ, МППБ, под вазелиновым маслом и среду Сабуро (при наличии роста вируссодержащий материал уничтожают). После проверки на стерильность определяют инфекционную активность вируса методом титрования на 10-12 дневных утиных эмбрионах при температуре 37±0,5^oC в течение 120 ч. Устанавливают инфекционную активность равную 10^6,0 ЭИД_50/0,2 см³. Гемагглютинирующую активность определяют в РГА с 1,0% суспензией эритроцитов кур. Устанавливают ГА активность, равную 12 лог₂.

Для инактивации вируса в экстраэмбриональную вируссодержащую жидкость добавляют димерэтиленимин до конечной концентрации его в реакционной смеси 0,2% и инкубируют при температуре 37±0,5^oC в течение 4-5 сут. Затем остаточный инактиватор нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия до конечной концентрации в реакционной смеси 0,03 М. Смесь выдерживают в течение 2 ч при температуре 20-22^oC. Повторно контролируют гемагглютинирующую активность инактивированного вируса в РГА с 1% суспензией эритроцитов кур. При этом РГА-активность соответствует первоначальной и составляет 12 лог₂.

Проводят проверку полноты инактивации вируса на утиных эмбрионах 10 - 12-суточного возраста в течение 3 последовательных пассажей. При отсутствии специфической гибели эмбрионов и отрицательной РГА в экстраэмбриональной жидкости инактивированный вирус используют для приготовления стандартного вакцинного препарата. Для приготовления 1 л вакцины "ОВАК" против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц берут 332 см³ инактивированного димерэтиленимином антигена из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93"-ДЕП к которому добавляют 664 см³ разбавителя-стабилизатора (фосфатно-буферный раствор) с pH 7,2 7,4 и перемешивают. К полученной суспензии инактивированного вируса стандартной активности добавляют 4 см³ 5% взвеси двуокиси кремния и снова перемешивают до получения равномерной взвеси.

После проверки полноты адсорбции в РГА вакцину расфасовывают в стерильные флаконы объемом 500 см³, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.

Пример 2. Вакцину "ОВАК" против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц готовят аналогично примеру 1, используя для ее приготовления инактивированный димерэтиленимином антиген из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10^7,0 ЭИД_50/0,2 см³ и с активностью в РГА до и после инактивации 14 лог₂. Для приготовления 1 л вакцины берут 249 см³ инактивированного антигена к которому добавляют 746 см ³ разбавителя-стабилизатора раствор Хенкса и после перемешивания вносят 5 см³ 5% взвеси двуокиси кремния.

Пример 3. Вакцину "ОВАК" против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц готовят аналогично примеру 1, используя для ее приготовления инактивированный димерэтиленимином антиген из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10^8,0 ЭИД_50/0,2 см³ и с активностью в РГА до и после инактивации 16 лог₂. Для приготовления 1 л вакцины берут 166 см³ инактивированного антигена к которому добавляют 828 см³ разбавителя-стабилизатора раствор Эрла и после перемешивания вносят 6 см³ 6% суспензии гидроокиси алюминия.

Готовая вакцина представляет собой бесцветную жидкость с белым легко взбивающимся осадком.

Вакцина сохраняет свои биологические свойства в течение 12 мес при условии хранения в сухом, темном помещении при температуре -20^oC.

Пример 4. Формируют четыре группы цыплят 110-120-дневного возраста по 40 тыс. голов в каждой.

Цыплят 1-3 групп прививают вакциной "ОВАК" против ССЯ-76 птиц из штамма ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП, изготовленной по примерам 1,2 и 3. Четвертую группу цыплят прививают инактивированной масляной вакциной против ССЯ-76 из штамма "В8/78", изготовленной МГП "Вирион".

Вакцины вводят внутримышечно однократно в объеме 0,5 см³. Через 10, 13, 16, 23 и 29 дн и далее ежемесячно от цыплят каждой группы исследуют по 25 проб сыворотки крови на наличие поствакцинальных антител в РТГА.

В течение месячного продуктивного периода у птиц 1 и 4 групп проводят учет яйценоскости. Сравнительная антигенная активность образцов вакцин представлена в табл.1.

Результаты опытов свидетельствуют о более высокой антигенной активности вакцины "ОВАК" из штамма ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП.

Из данных табл. 1 видно, что через 10 дн после иммунизации уровень антител в группах цыплят, привитых вакциной "Овак", достигал значения 7,2 и более лог₂ с максимальным накоплением к 23 дню и сохранялся на уровне 5,23 лог₂ в течение периода наблюдения (6 мес).

В группе цыплят привитых вакциной против ССЯ-76 из штамма "В8-78" уровень антител через 10 дней после вакцинации был на 2,8 лог ниже. К 23 дню разница уменьшилась до 0,52 лог₂ и через 6 месяцев сохранялся на уровне 5,00 лог₂.

Показатели яичной продуктивности подопытных групп птиц представлены в табл.2.

Как видно из табл. 2, среднее количество яиц, полученных от кур, привитых вакциной против ССЯ-76 из штамма "В8/78", было на 76 тыс. штук меньше, чем в группе, иммунизированной вакциной "Овак" против ССЯ-76 из штамма ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП (по примеру 1). В процентном выражении разница показателей составляет 8,6% в пользу вакцины "Овак".

Пример 5. Формируют две группы цыплят 110-120 дневного возраста. Первую группу цыплят (34 тыс. голов) прививают вакциной "Овак" против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц из штамма ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП, по примеру 2, внутримышечно, однократно в объеме 0,5 см³. Вторая группа цыплят (6 тыс. голов) непривитые, служит контролем. В период с 5 до 15 месячного возраста осуществляют ежемесячно учет яйценоскости кур несушек в обеих группах.

Показатели яичной продуктивности привитой и непривитой птицы представлены в табл.3.

Данные табл. 3 свидетельствуют о повышении яичной продуктивности кур, привитых вакциной "Овак" за период с 5 до 15-месячного возраста, по сравнению с непривитым поголовьем кур.

Предлагаемая вакцина "ОВАК" против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц из штамма ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП по сравнению с имеющимися вакцинами обладает следующими преимуществами:
имеет более высокую антигенную и иммуногенную активности;
быстро формирует надежный иммунитет;
полная инактивация вируса в вакцине позволяет исключить возможность распространения заболевания в птицеводческих хозяйствах при проведении профилактических прививок;
используемый адъювант способствует сохранению высокой стабильности и иммуногенной активности вакцины.

Применение вакцины "ОВАК" в птицехозяйствах показало достоверное увеличение яйценоскости на курицу-несушку за продуктивный период на 27, 2 яйца и уменьшение количества снесенных бесскорлупных яиц на 5,5%
Использование вакцины "ОВАК" против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц из штамма ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП в ветеринарной практике позволит расширить арсенал высокоэффективных биопрепаратов против указанного заболевания птиц и снизить затраты на проведение профилакических мероприятий.

Использование: биотехнология, ветеринарная вирусология, специфическая профилактика, вакцина против синдрома снижения яйценоскости - 76 птиц. Сущность изобретения: вакцина ОВАК содержит инактивированный антиген из штамма вируса снижения яйценоскости - 76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10^6,0-10^8,0 ЭИД_50/0,2см³ и с активностью в РГА до и после инактивации 16 - 12 лог₂, солевой разбавитель-стабилизатор: фосфатно-буферный раствор с pH 7,2 - 7,4, либо раствор Хенкса либо раствор Эрла и адъювант - двуокись кремния или гидроокись алюминия. Для инактивации вируса использован димерэтиленимин, а для его нейтрализации тиосульфат натрия. Препарат применяют внутримышечно, однократно цыплятам 110 - 120-дневного возраста в объеме 0,5 см³. Применение вакцины в птицехозяйствах способствует повышению яйценоскости кур несушек (на 27,2 яйца за продуктивный период) и уменьшению количества снесенных бесскорлупных яиц (на 5,5%). 3 табл.

Вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц, включающая инактивированный антиген из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц, солевой разбавитель-стабилизатор и адъювант, отличающаяся тем, что она содержит в качестве инактивированного антигена из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц инактивированный димерэтиленимином антиген из штамма вируса синдрома синжения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б-93" ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10⁶ 10⁸ ЭИД_50/0,2см3 и с активностью в РГА до и после инактивации 16 12 лог₂, в качестве солевого разбавителя-стабилизатора фосфатно-буферный раствор с pH 7,2 7,4, либо раствор Хенкса, или раствор Эрла, в качестве адъюванта 5%-ную взвесь двуокиси кремния или 6%-ную суспензию гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.

Инактивированный димерэтиленимином антиген из штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц ВГНКИ N 98 "Б 93" ДЕП с титром инфекционной активности до инактивации 10⁶ 10⁸ ЭИД_50/0,2см3 и с активностью в РГА до и после инактивации 16 12 лог₂ 16,6 33,2
Фосфатно-буферный раствор с pH 7,2 7,4, либо раствор Хенкса, или раствор Эрла 66,4 82,8
5%-ная Взвесь двуокиси кремния или 6%-ная суспензия гидроокси алюминия - 0,4 0,6а