СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КОЛОВРАТОК BRACHIONUS PLICATILIS MULLER Российский патент 2025 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к гидробиологии и рыбоводству и может быть использовано для получения живого корма для личинок рыб. Живые корма являются естественной пищей для личинок рыб. В аквакультуре особо ценными при выращивании лососевых, осетровых, кефалевых и камбаловых рыб, до достижения личинками массы 60 мг, являются коловратки, науплии артемии салины, моины и дафнии (Колмаков В.И., Колмакова А.А. Аминокислоты в перспективных кормах для аквакультуры рыб: обзор экспериментальных данных // Журн. Сиб. федер. ун-та. Биология. 2020. 13(4). С. 424-442; Патент 2548106 С1 МПК А01К 61/00, заявка 2014150176/93, 30.10.2014, авторы: Ханайченко A.M., Гирагосов В.Е., Ельников Д.В., Рауен Т.В.).

Живые корма предпочтительно культивировать в накопительном режиме в обеззараженной воде и затем вносить в выростные емкости. Механическую очистку воды осуществляют пропусканием через песчано-ракушечный фильтр и систему микрофильтрации, обеспечивающей размер взвешенных в воде частиц не более 3 мкм, при этом обеззараживание воды проводят путем ультрафиолетового облучения (патент RU 2073432 С1 МПК А01К 61/00, заявка №93003040/13, 18.01.1993, авторы: Маслова О.Н., Бурлаченко И.В.).

Однако воздействие ультрафиолетового излучения кратковременно и не имеет высокой производительности. Основными проблемами использования УФ-излучения являются частая замена ламп, возобновление роста микробов после обработки и неэффективная мутная и окрашенная вода.

Известен способ культивирования коловратки Brachionus plicatilis на основе рационов питания, включающих пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и морские микроводоросли Tetraselmis (=Platymonas) suecica и Isochrysis galbana в виде смешанных или простых композиций (Planas М., Estevez A. Effects of diet on population development of the rotifer Brachionus plicatilis in culture // Helgolander Meeresunters. 1989.43. pp. 171-181).

Методами непрерывного и полунепрерывного («прореживание культуры») культивирования обеспечивается высокая плотность коловраток путем введения в корм пекарских дрожжей и микроводорослей, в качестве культуры микроводорослей вносили в корм пресноводную водоросль Chlorella vulgaris (Yoshimatsu Т., Hossain М.А. Recent advances in the high-density rotifer culture in Japan. Aquacult Int. 2014. DOI 10.1007/s10499-014-9767-5).

Недостатком способа является снижение концентрации кислорода в культуре при использовании дрожжей, ухудшение качества воды, что отрицательно влияет на плодовитость зоопланктона. Кроме того, для непрерывного культивирования автоматическая система должна быть снабжена блоками фильтрации, культивирования и сбора урожая, требующими технических решений.

Известен способ получения живых кормов для личинок морских рыб, где в качестве корма для эвригалинных коловраток Brachionus plicatilis в среду культивирования за несколько суток до использования вводят динофлагелляты Prorocentrum cordatum и Prorocentrum micaus (5×10⁴ кл./мл), что позволяет обогатить корм докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислотами (патент RU 2717990 С1 МПК А01К 61/00, заявка №2019107325, заявл. 14.03.2019, автор: Ханайченко А.Н.), т.е. критерием оценивания полученного корма авторами выбрано содержание ПНЖК в липидах коловраток. В другой работе показано как путем изменения микроводорослевого питания культивируемого растительноядного зоопланктона можно управлять и аминокислотным составом живого корма (Balachandar S., Rajaram R. Influence of different diets on the growth, survival, fecundity and proximate composition of brine shrimp Artemia franciscana (Kellog, 1906) // Aquaculture Research. 2019. 50(2). pp. 376-389).

Наиболее близким к заявленному является способ полунепрерывного культивирования морского планктона в поликультуре, в частности инфузорий Euplotes charon Muller, 1786 и коловраток Brachionus plicatilis Muller, 1786, с помощью введения многокомпонентной питательной смеси, содержащей карбамид, картофельный крахмал, кормовые витамины группы В, моносахарид, незаменимые аминокислоты лизин (Lys) и метионин (Met), конский навоз, сено, куриный желток, эмульгированный кукурузным маслом и коровьим молоком (Новоселова Н.В., Каниева Н.А. Культивирование морского зоопланктона в поликультуре // Вестник Астраханского государственного технического университета. Серия: Рыбное хозяйство. 2020. №1. c. 118-130).

К недостаткам способа можно отнести громоздкость состава смеси, обилие органики, ухудшающей качество воды. Незаменимые аминокислоты в состав питательной смеси вводятся в соотношении 1:1 (по 10 мг/м³), в то же время наиболее сбалансированным считается соотношение, в котором концентрация лизина превышает таковую у метионина в 2-3 раза (Калинин О.В. Специфические функции незаменимых аминокислот // Молодежь и наука. 2016. 1. С. 2.; Колмаков В.И., Колмакова А.А. Аминокислоты в перспективных кормах для аквакультуры рыб: обзор экспериментальных данных // Журн. Сиб. федер. ун-та. Биология. 2020. 13(4). С. 424-442.; Dietary protein quality evaluation in human nutrition: Report of an FAO Expert Consultation. Rome: FAO, 2013. 66 p.).

Целью изобретения является повышение продуктивности культуры эвригалинных коловраток Brachionus plicatilis Muller, 1786.

Технический результат достигается способом накопительного культивирования эвригалинных коловраток Brachionus plicatilis Muller, характеризующимся тем, что морскую воду пропускают через песчано-ракушечный фильтр и систему микрофильтрации, обеззараживают с помощью обработки гидродинамической кавитацией и аэрируют, вносят культуру коловраток, культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri, незаменимые аминокислоты метионин, лизин в соотношении 1:2 соответственно. Культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri вносят в концентрации 6⋅10⁶ кл./мл. Культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri вносят в концентрации 3,0⋅10⁶ кл./мл и совместно вносят культуру морских микроводорослей Tetraselmis viridis в концентрации 0,4⋅10⁶ кл./мл. Дополнительно вносят глутатион при соотношении метионин, лизин, глутатион 1:2:1,5 соответственно.

В культуральную среду помещают маточную культуру коловраток плотностью 1,0⋅10⁵ экз./м³ (0,1 экз./мл).

Для обеззараживания морской воды применен способ гидрокавитационной обработки, характеризующийся повышенной скоростью массопереноса, усиленной диффузией, вызванной турбулентностью на микроскопическом уровне, а также образованием высокореактивных свободных радикалов и связанное с ними разрушение клеток. Кроме того, кавитация является экологически чистой передовой технологией, поскольку в ней не используются внешние химические вещества, не образуются вредные побочные продукты, она является энергоэффективной и экономичной (для обеззараживания одинакового количества воды УФ-системы будут затрачивать на 11,25% больше энергии, чем при гидродинамической кавитации).

Следует отметить, что кавитационное воздействие на морскую воду имеет пролонгированный эффект по отношению к организмам планктона. Через 24 часа в пробах, отобранных после обработки 15 мин, наблюдалось заметное снижение количества подвижных микроорганизмов. При 30 мин воздействии гидрокавитации через 24 часа обнаруживались единичные устойчивые виды. Однако уже через 48 часов в морской воде полностью отсутствовало наблюдаемое ранее движение микроорганизмов (Уколов А.И., Малько СВ., Семенова А.Д. Влияние гидродинамической обработки морской воды на устойчивость планктонных микроорганизмов // Вестник Керченского государственного морского технологического университета. 2023. 2. С. 137-146; Pandit А.В., Mukherjee А.С., Sangave P.P. Water treatment Using Hydrodynamic cavitation // Indian J. Geo-MarineSci. 2014. Vol. 43. Iss. 11. pp. 2033-2041).

В состав среды культивирования вносится Diacronema (=Pavlova, =Monochrysis) lutheri (Droop) Bendif & Véron, 2011 - жгутиковая подвижная микроводоросль, отличающаяся липидной направленностью биосинтеза, особенно способностью к образованию ПНЖК (с преобладанием 16:1ω9, 18:1ω9, 18:2ω6, 18:3ω3_(ALA), 20:5ω3, 22:6ω3). В сухом веществе клеток D. lutheri в зависимости от условий выращивания может содержаться от 22 до 40% липидов и до 30% белковых веществ (Meireles L.A. Lipid Class Composition of the Microalga Pavlova lutheri: Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003. 51(8). pp. 2237-2241; Донченко Л.В., Битютская О.E., Сокол H.B., Були Л.И., Есина Л.М., Мазалова Н.Ф., Никитенко О.В. Применение микроводорослей в технологии пищевых композиций функциональной направленности // Рыбное хозяйство. 2022. 6. С. 87-89).

Следует отметить более мелкие размеры клетки D. lutheri (длина - d, (высота) - h (высота): 3,0-2,1 мкм, объем клетки - (13,8±4,2) мкм³) по сравнению с микроводорослями, указанными в способах аналогах, приведенных выше: для Tetraselmis suecica (d-h: 11,5-8,3 мкм, объем клетки - (505,3±14,7) мкм³; Tetraselmis viridis (d-h: 8,5-7,6 мкм, объем клетки - (214,4±21,1) мкм³; Isochrysis galbana (d-h: 5,9-4,4 мкм, объем клетки - (39,2±5,2) мкм³; Prorocentrum cordatum (d-h: 8-24 - 4-20 мкм) и Prorocentrum micaus (d-h: 55-70 - 20-50 мкм), что свидетельствует о максимальной кормовой доступности D. lutheri для зоопланктона на разных этапах развития жизненного цикла.

В состав корма вместе с D. lutheri вводили еще один вид морских зеленых жгутиковых микроводорослей - Tetraselmis viridis (Rouchijajnen) (R.E. Norris, Hori & Chihara, 1980). Водоросль богата белком и высокомолекулярными жирными кислотами (18:1ω9, 18:2ω6, 18:3ω3_(ALA), 18:3ω6_(GLA), 20:4ω6, 20:5ω3), витамином С и β-каротином. В составе жирных кислот у Tetraselmis присутствует только эйкозапентаеновая кислота, докозагексаеновая отсутствует, поэтому выбранные виды микроводорослей хорошо дополняют друг друга. На основе биомассы Т. viridis разработана БАД, установлена антиоксидантаная активность, обусловленная наличием β-каротина, витамина С, хлорофилла и органических кислот в микроводорослях (Adarme-Vega Т.С., Thomas-Hall S.R., Lim D.K. and Schenk P.M. Effects of long chain fatty acid synthesis and associated gene expression in microalga Tetraselmis sp. // Mar. Drugs. 2014. 12. pp. 3381-3398; Кузнецова E.A., Гаврилина B.A., Климова E.B., Бриндза Я., Бороздых А.А., Боровков А.Б., Гудвилович И.Н., Жондарева Я.Д. Разработка препарата биологически активной добавки на основе биомассы водоросли Tetraselmis viridis// Технология и товароведение инновационных пищевых продуктов. 2021. №3. С. 46-50).

Введение в корм коловраток незаменимых аминокислот лизина и метионина и трипептида глутатиона позволяют обогатить среду доступными питательными веществами. Подтверждение позитивного эффекта влияния аминокислот и стеринов в рационе коловраток Brachionus calyciflorus на темпы роста их популяции приведены в работе A. Wacker и D. Martin-Creuzburg (Wacker A. and Martin-Creuzburg D. Biochemical nutrient requirements of the rotifer Brachionus calyciflorus: co-limitation by sterols and amino acids // Ersch. in: Functional Ecology. 2012. 26(5). S. 1135-1143.).

Дефицит лизина, большое количество которого содержится в ядерных белках - протаминах и гистонах, вызывает задержку процессов биосинтеза белка. Метионин является универсальным донатором метильных групп и, таким образом, участвует в синтезе холина, тимина, др., источником серы при биосинтезе цистеина (Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И. Жеребцов Н.А. Химия пищи. Кн. 1. Белки: структура, функции, роль в питании. М.: Колос, 2000. 384 с.; Зверев С.В., Карпов В.И., Никитина М.А. Оптимизация пищевых композиций по профилю идеального белка // Пищевые системы. 2021. 4(1). С. 4-11). Значение глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин) в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. Глутатион не только защищает клетку от токсичных, но и в целом определяет окислительно-восстановительные характеристики внутриклеточной среды. Глутатион также является субстратом реакций конъюгации и восстановления, катализируемых глутатион-S-трансферазой в цитозоле, микросомах и в митохондриях.

Варианты примеров накопительного культивирования коловраток В. plicatilis при разных режимах и условиях среды представлены в таблицах 1-4 (усредненные данные 3-х измерений из 2-х параллельных аквариумов).

В примерах 1-4 варьирует показатель длительности кавитационной обработки морской воды от 15 до 25 мин при постоянном давлении равном 0,4 атм и последующей аэрации в течение 15 мин. В качестве корма в рацион питания вводится D. lutheri в концентрации 6⋅10⁶ кл./мл, поддерживаемой на всем протяжении эксперимента (10 суток). Наиболее эффективными параметрами гидрокавитационной обработки морской воды для дальнейшего культивирования коловраток определено время 20 и 25 мин, для примеров 4-16 оптимальным принята длительность обработки морской воды в течение 20 мин (пример 3) - среднесуточная продуктивность составляла 22 экз./мл ⋅ сут.

В примерах 5-8 в подготовленную морскую воду (пример 2), кроме D. lutheri в концентрации 6⋅10⁶ кл./мл, вводятся незаменимые аминокислоты Met:Lys в соотношениях: 1:1 (как в прототипе: Met/Lys из расчета по 10 мг/м³), 1:1,5, 1:2 и 1:2,5. Начиная с 3-х суток эксперимента численность популяции коловраток при соотношении 1:2 (пример 7) давала более значительный рост, среднесуточная продуктивность составляла 33 экз./мл⋅сут.

В примерах 9-14 в подготовленную морскую воду (пример 2) вносится D. lutheri в концентрации 6⋅10⁶ кл./мл, трипептид глутатион (GSH) и незаменимые аминокислоты Met:Lys в соотношениях: 1:0:0 (контроль), 0,5:1:2, 1:1:2, 1,5:1:2, 2:1:2. Во всех примерах с введением GSH отмечено увеличение численности популяции по сравнению с контролем. Оптимальным выбрано соотношение GSH:Met:Lys - 1,5:1:2 (пример 13), среднесуточная продуктивность составляла 40 экз./мл⋅сут. Отмечено, что при этом соотношении популяция коловраток на 7-е сутки обладала более высокой продуктивностью: количество репродуктивно зрелых амиктических самок составляло 45-50%, что может свидетельствовать о более раннем начале экспоненциального увеличения численности коловратки.

В примерах 15-17 в предварительно подготовленную морскую воду (пример 2) вносится GSH:Met:Lys - 1,5:1:2, микроводоросль D. lutheri в концентрации 6⋅10⁶ кл./мл (пример 13), смесь микроводорослей D. lutheri и Т. viridis (примеры 15-17). Наиболее высокую среднесуточную продуктивность (46 экз./мл⋅сут) обеспечивало соотношение микроводорослей в смеси при концентрации D. lutheri (3,0⋅10⁶ кл./мл) и Т. viridis (0,4⋅10⁶ кл./мл) (пример 16).

Таким образом, предлагаемый способ культивирования коловраток Brachionus plicatilis Muller обеспечивает жизнестойкость и прирост численности популяции, что приводит на 10-е сутки к повышению продуктивности культуры по сравнению с прототипом за счет очистки и обеззараживания морской воды, введения в корм 2-х видов микроводорослей, незаменимых аминокислот и глутатиона.

Изобретение относится к гидробиологии и рыбоводству и может быть использовано для получения живого корма для личинок рыб. Морскую воду пропускают через песчано-ракушечный фильтр и систему микрофильтрации, обеззараживают с помощью обработки гидродинамической кавитацией и аэрируют, вносят культуру коловраток, культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri, незаменимые аминокислоты метионин, лизин в соотношении 1:2 соответственно. Изобретение обеспечивает повышение продуктивности культуры коловраток Brachionus plicatilis Muller. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ накопительного культивирования эвригалинных коловраток Brachionus plicatilis Muller, характеризующийся тем, что морскую воду пропускают через песчано-ракушечный фильтр и систему микрофильтрации, обеззараживают с помощью обработки гидродинамической кавитацией и аэрируют, вносят культуру коловраток, культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri, незаменимые аминокислоты метионин, лизин в соотношении 1:2 соответственно.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri вносят в концентрации 6⋅10⁶ кл./мл.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культуру морских микроводорослей Diacronema lutheri вносят в концентрации 3,0⋅10⁶ кл./мл и совместно вносят культуру морских микроводорослей Tetraselmis viridis в концентрации 0,4⋅10⁶ кл./мл.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что дополнительно вносят глутатион, при соотношении метионин, лизин, глутатион 1:2:1,5 соответственно.