Способ оценки плазменного гемостаза Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а точнее к диагностике гипер- и гипокоагуляционного состояния на основе метода кинетики формирования фибрина, и может быть использовано в клинической практике врачами клинической лабораторной диагностики, терапевтами, кардиологами с целью своевременной диагностики претромботического состояния и предупредить развитие ДВС-синдрома.

После распространения коронавирусной инфекции стремительно стало расти число пациентов с нарушением свертывающей системы крови, что связано с одним из осложнений данной патологии - повышенного риска тромбообразования. По этой причине, согласно клиническим рекомендациям, пациенты с подтвержденным диагнозом COVID-19 получают антикоагулянтную терапию. С целью корректировки верной терапевтической дозировки препарата и отслеживания состояния системы гемостаза пациенту необходимо регулярно проводить анализ системы свертывания крови.

Процесс свертывания крови проходит несколько этапов: первичный (тромбоцитарный), вторичный (плазменный) и фибринолиз. Рутинные тесты на определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) или международного нормализованного отношения (МНО) отражают только конечное время свертывания крови, что не всегда дает возможность составить полноценную картину состояния свертывающей системы крови и назначить действенную терапию. Методы, характеризующие динамику одной или нескольких стадий коагуляции крови, например, тромбоэластограмма (ТЭГ), тромбодинамика, тест генерации тромбина или импедансная агрегометрия, позволяют достоверно выявить нарушения процесса свертывания.

Вышеуказанные тесты являются достаточно энергоемкими и требуют наличия дорогостоящего оборудования и расходных материалов. В этой связи встал вопрос о поиске альтернативного метода исследования и мониторинга системы свертывания крови.

Так, например, в основе метода тромбодинамики лежит принцип разделения в пространстве процесса активации и роста фибринового сгустка. Активация свертывания запускается от поверхности с иммобилизованным рекомбинантным тканевым фактором, которая имитирует место повреждения стенки кровеносного сосуда. Далее сгусток распространяется в плазме уже без контакта с активирующей поверхностью. Тест тромбодинамики проводится с помощью лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2». Предварительно подготовленные образцы плазмы крови помещают в два канала измерительной кюветы. Затем в кювету вводят специальную вставку-активатор, на торцы которой нанесено покрытие, содержащее липиды и ТФ. В момент соприкосновения плазмы крови с вставкой-активатором запускается процесс свертывания, и от торца вставки-активатора начинается рост фибринового сгустка. Этот процесс регистрируется прибором в режиме последовательной фотосъемки цифровой фотокамерой при помощи метода темного поля (регистрация картины светорассеяния) в течение 30 мин. Полученная серия фотоизображений показывает, как размеры, форма и структура фибринового сгустка меняются во времени (Фиг.1)

Особенности преаналитического этапа. Биоматериалом для исследования являются нативные образцы свободной от тромбоцитов плазмы крови. Объем, необходимый для проведения исследования - 120 мкл. Взятие проб цельной крови следует производить путем обычной венопункции в объеме не менее 2 мл. При этом первую порцию крови необходимо использовать для других анализов. Цельную кровь набирают в пластиковые коагулологические пробирки с цитратом натрия. Категорически запрещается использовать стеклянные или силиконизированные стеклянные пробирки для забора крови с целью проведения исследования тромбодинамики. Использование вакуумных систем забора крови различных производителей может оказывать значительное влияние на результаты тромбодинамики. Как и при выполнении любых лабораторных тестов гемостаза, рекомендуется провести дополнительное исследование и набрать собственный диапазон нормальных референсных значений на пробирках, используемых в данной лаборатории. Цельная кровь должна храниться при комнатной температуре не более 1 ч после взятия. Транспортировка цельной крови крайне нежелательна, так как трудно гарантировать адекватные условия (соблюдение температурного режима, отсутствие резких встряхиваний). В этих случаях возможна ложная регистрация гиперкоагуляционных отклонений.

Недостатками данного технического решения является принципиальность в преаналитическом этапе, образцы можно хранить не более 1 часа после процедуры забора крови. Также, метод требует сложного и дорогостоящего технического оснащения, что ограничивает его использование небольшими медицинскими учреждениями.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является «Способ диагностики скрытого внутрисосудистого фибринообразования» (Патент RU №2431841 C1, МПК G01N33/53 - 2011.10.20), у пациента определяют уровнь D-димера до и через сутки после проведения последовательно перемежающейся пневматической компрессии (ПППК) нижних конечностей. При выявлении повышения уровня D-димера во второй пробе диагностируют наличие скрытого внутрисосудистого фибринообразования. Использование способа позволяет определить высокий риск развития тромбозов на ранних этапах тромбообразования у пациентов с имеющимися в анамнезе тромбозами любой локализации и дифференцировать подходы к назначению терапии у таких пациентов.

Но этот способ является узко информативным и не описывает полную картину состояния системы гемостаза и, что не дает возможности предотвратить начальную стадию развития осложнений.

Таким образом, вышеперечисленные методы являются дорогостоящими и не могут использоваться скрининговым тестом для предотвращения тромбозов и геморрагических состояний на начальном этапе для их профилактики и предотвращения.

Фибрин является конечным продуктом коагуляционного каскада химических реакций плазменного гемостаза, приводящий к полной остановке кровотечения за счет блокирования места повреждения сосуда. На кинетику образования фибрина влияют изменения в любой из реакций каскада коагуляции крови, что позволяет по кривой коагуляции крови, представляющей из себя зависимость параметра (физико-химического свойства фибрина) от времени, оценить состояние системы гемостаза. Таким физико-химическим параметром фибриновых нитей может являться вязкость сгустка, величина оптической плотности пробы или размер нити.

Фибрин, образующий структурную базу тромба образуется из фибриногена под воздействием тромбина. Результатом полимеризации фибрина является формирование фибриновых волокон в форме разветвленной трехмерной сети, обеспечивающей механическую прочность тромбов.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа общей оценки плазменного гемостаза путем исследования функциональности фибринового сгустка с помощью метода определения процесса фибринообразования по кинетике формирования фибриновых нитей.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение универсальной характеристики состояния плазменного гемостаза простым и доступным способом, позволяющим выявить нарушения функционирования системы гемостаза и предотвратить фатальные осложнения у пациентов.

Полученные методом турбидиметрии данные подставляют в расчетную формулу:

X = (Amax*V)/Lag-time, где

где Х - индекс, характеризующий функциональность фибринового сгустка;

Lag-time - соответствует времени генерации тромбина и образования протофибрилл;

V - скорость полимеризации, повышение оптической плотности на отрезке ее нарастания в единицу времени, которая характеризует скорость латеральной агрегации и формирования волокон фибрина;

Amax - максимальная оптическая плотность при данной длине волны, определяемая количеством полимеризованного белка и толщиной фибриновых волокон,

при получении расчетного индекса Х≤0,05 - констатируют гипокоагуляцию и риск развития 2 стадии ДВС-синдрома; при Х равного 0,06 - 1,5 - констатируют нормальную функциональность плазменного гемостаза; если индекс Х >1,5 - констатируют гиперкоагуляцию и рисках развития тромботических осложнений.

Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является простота выполнения исследования, доступность приобретения оборудования.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:

Фиг.1 - Способ проведения тромбодинамики.

Фиг.2 - Регистрация кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии у трех исследуемых групп. Определяемые параметры: лаг-период (Lag) - время до начала нарастания плотности; (V) - повышение оптической плотности на отрезке ее нарастания в единицу времени; максимальная оптическая плотность при данной длине волны (Amax).

Фиг.3 - Регистрация кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии у пациента с тяжелым течением заболевания

Фиг.4 - Регистрация кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии у пациента со средним течением заболевания

Осуществление изобретения.

Для реализации данного изобретения нам потребовалось следующее:

Получение свободной от тромбоцитов плазмы крови (СТП) пациентов. Кровь пациентов забирали из локтевой вены утром натощак, стабилизировали 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1 по объему и центрифугировали дважды при 1500g 15 минут и далее в режиме 10000g 5 минут для осаждения тромбоцитов и получения СТП.

Определение кинетики полимеризации фибрина методом динамической турбидиметрии.

Для измерения оптической плотности раствора использовался спектрофотометр СФ-2000 (ОКБ Спектр, Россия, г. Санкт-Петербург) с программным обеспечением «Кинетика». В кювете смешивали 400 мкл СТП и 400 мкл 0,025М CaCl₂. Свертывание начинали регистрировать сразу после рекальцификации плазмы (нулевой момент времени). Формирование сгустка определяли по увеличению оптической плотности образца вследствие образования нерастворимых фибриновых волокон из растворимого фибриногена. Регистрацию проводили при длине волны 340 нм в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм в течение 60 минут. При анализе турбодиметрической кривой (Фиг.2) определяли lag-период (Lag), соответствующий времени генерации тромбина и образования протофибрилл; скорость полимеризации (V) - повышение оптической плотности на отрезке ее нарастания в единицу времени, которая характеризует скорость латеральной агрегации и формирования волокон фибрина; максимальная оптическая плотность при данной длине волны (Amax), определяемая количеством полимеризованного белка и толщиной фибриновых волокон.

Для анализа результатов пациенты были разделены на три группы, в зависимости от тяжести течения коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 и наличия в анамнезе сердечно-сосудистых патологий (ССП):

Группа 1. Контроль, без сопутствующих сердечно-сосудистых патологий

Группа 2. КТ 2-3, с сопутствующими сердечно-сосудистыми патологиями

Группа 3. КТ 4, пациенты отделения реанимации и интенсивной терапии (антикоагулянтная терапия - гепарин 20000 ЕД через дозатор).

В таблице 1 представлены показатели основных лабораторных показателей гемостаза и биохимии у пациентов с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2, по группам в зависимости от тяжести течения заболевания.

Таблица 1. Данные основных лабораторных показателей гемостаза и биохимии у пациентов с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2, по группам в зависимости от тяжести течения заболевания

Группа 1 Группа 2 Группа 3 D-dimer (мг/л) 0,28±0,03 1,07±0,42 5,39±1,7
p<0,01 Фибриноген (г/л) 2,8±1,1 4,6±0,9 4,2±1,1 АЧТВ (сек.) 23,8±13,8 29,1±6,8 99,2±38,5
p<0,01 PLT *10⁹ 210,8±57,1 234,1±75,9 151,2±49,4
p<0,05 Ферритин (мкг/л) 81±22 347±104 376±81,8 CRP (мг/л) 1,4±0,7
p<0,05 97,8±36,4 101,9±29,3

p - достоверность различий полученных показателей по сравнению с таковыми у других групп.

Согласно лабораторным исследованиям пациентов с коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2, выявлены отклонения от нормы д-димера (у 2 и 3 групп), фибриногена в различной степени у всех пациентов.

У пацентов из 3 группы отмечается выраженная тромбоцитопения. Белки острой фазы воспаления (с-реактивный белок, ферритин) повышены во 2 и 3 группах

Согласно полученным данным лабораторных показателей, подтвердилось нарушение гемостаза в опытных группа с различной степенью тяжести заболевания.

В таблице 2 представлены показатели степени тяжести течения коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 на кинетику фибринообразования.

Таблица 2. Влияние степени тяжести течения коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 на кинетику фибринообразования

Группа 1 Группа 2 Группа 3 V(скорость полимеризации фибринового сгустка)
(ед ОП/с) 3,93±2,3 5,44±2,47
р<0,05 1,12±0,71 Lag-период (мин) 6,2±1,2 3,8±1,1
р<0,05 9,4±0,8 Amax (ед ОП) 1,625±0,433 1,412±0,351
р<0,01 0,576±0,17

ОП - оптическая плотность; p - достоверность различий полученных показателей по сравнению с таковыми у групп 1 и 3

Обработку и графическое представление результатов турбодиметрии проводили с использованием программы OriginLab 2021 (OriginLab Corporation, США), статистический анализ результатов - с использованием программы STATISTICA.

Динамика турбидиметрии пациентов опытных групп значительно различается. Тяжелое течение коронавирусной инфекции отличается удлинением лаг-периода, достоверным снижением скорости полимеризации и значительным снижением максимальной оптической плотности сгустка (табл. 1). Среднее течение заболевания же, напротив, характерно укорочением lag-периода, но максимальная оптическая плотность сгустка также ниже, чем у контрольной группы.

Также, нами было отмечено, что у пациентов группы 3, у которых проводилась активная антикоагулянтная терапия, и у пациентов из этой же группы, кому не проводилась гепаринотерапия, график формирования фибринового сгустка значительно схож, что дает нам возможность полагать независимость явной коагулопатии от проводимой гепаринотерапии.

Проанализировав полученные данные, мы сформулировали зависимость измеряемых параметров, характеризующих состояние фибринообразования у пациентов:

X = (Amax*V)/Lag-time,

где Х - индекс, характеризующий функциональность фибринового сгустка;

lag-time - соответствует времени генерации тромбина и образования протофибрилл;

V - скорость полимеризации, повышение оптической плотности на отрезке ее нарастания в единицу времени, которая характеризует скорость латеральной агрегации и формирования волокон фибрина;

Amax - максимальная оптическая плотность при данной длине волны, определяемая количеством полимеризованного белка и толщиной фибриновых волокон.

Основываясь на лабораторных данных рутинных тестов, на анамнез наших опытных групп были сфомулированы следующие референсные значения для данного индекса фибринообразования: если рассчетный индекс 0,06 - 1,5 - делают вывод о нормальной функциональности плазменного гемостаза, если значение полученного индекса ≤ 0,05 - это говорит о гипокоагуляции и рисках развития 2 стадии ДВС-синдрома (синдром дессиминированного внутрисосудистого свертывания), если индекс >1,5 - делаем выводы о гиперкоагуляции и рисках развития тромботических осложнений.

Способ поясняется конкретными клиническими примерами.

Пример 1.

Поступила пациентка Р., 63 года в инфекционный госпиталь с жалобами: повышение температуры тела до 37,9°С; потеря обоняния и вкуса, сухой кашель, кашель с мокротой белого цвета, утомляемость, общая слабость, ощущение заложенности в грудной клетке, головная боль, заложенность носа, слизистые выделения из носа, боль в горле

Считает себя больным с момента появления вышеперечисленных жалоб (10 дней), состояние средней степени тяжести. Сознание ясное. В легких дыхание жесткое, хрипов нет. Сердечные тоны ритмичные, приглушены. Живот мягкий, не напряжен, участвует в акте дыхания, безболезненный. Печень не пальпируется. Селезенка не пальпируется. Периферических отеков нет. Стул регулярный. Диурез адекватный. РКТ - признаки пневмонии, вероятно, вирусного характера (согласно критериям оценки тяжести, соответствует КТ2). Предварительный диагноз: подозрение на новую коронавирусную инфекцию CОVID-19. Внебольничная двусторонняя полисегментарная пневмония (вероятно вирусная), среднетяжелая форма. КТ 2.

У пациента была взята кровь на исследование гемостаза. Были выполнены рутинные методы и методом двойного центрифугирования получена свободная от тромбоцитов плазма, проведен тест на измерение оптической плотности фибринового сгустка. Получены следующие результаты по рутинным тестам гемостаза:

Фибриноген (2-4 г/л) ПТ по Квику ПВ (9,2-12,2 сек) АЧТВ (28-40 сек) МНО (0,9-1,5 у.е.) Д-димер (<0,5 нг/мл) 4,7 81 13,8 21,9 1,18 0,87

Результаты теста кинетики фибринообразования методом турбидиметрии:

V(скорость полимеризации фибринового сгустка)
(ед ОП/с) Lag-период (мин) Amax (ед ОП) 4,2 2,5 1,45

Подставляем наши данные в формулу и получаем индекс функциональности фибринового сгустка:

X = (Amax*V)/Lag-time

X = (1,45*4,2)/2,5=2,436

За счет гепаринотерапии картина рутинных тестов склоняет считать, что у пациента гипокоагуляция, но согласно нашим референсным интервалам индекса функциональности фибринового сгутска у данного пациента высокий риск тромботических осложнений (>1,5). Что в дальнейшем подтвердилось наблюдениями за пациентом в условиях стационара. Рекомендовано пациенту прием Апиксабана 2,5 мг 2 раза в сутки, под контролем фибриногена и уровня тромбоцитов 3 месяца.

Пример 2.

Поступил пациент Д., 68 лет, в инфекционный госпиталь с жалобами:

повышение температуры тела до 39°С; сухой кашель; одышка, чувство нехватки воздуха; общая слабость; заложенность носа, слизистые выделения из носа; боли в животе; боль в грудной клетке.

Считает себя больным с момента появления вышеперечисленных жалоб (3 дня). В анамнезе ЖКБ (удаление желчного пузыря 1996 г.), ОНМК (острое нарушение мозгового кровообращения) 2016, 2018 г., гипертоническая болезнь, Органическое расстройство личности вследствие перенесенного повторного ОНМК. Состояние тяжелое. В сознании. Кожные покровы физиологической окраски, сухие. Сыпи нет. Дыхание жесткое, хрипов нет. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Живот мягкий, не напряжен, участвует в акте дыхания, болезненный в области эпигастрия. Печень не пальпируется, у края реберной дуги, безболезненна. Селезенка не пальпируется. Периферических отеков нет. Стул регулярный. Диурез адекватный.

Предварительный диагноз:

Подозрение на коронавирусную инфекцию CОVID-19, внебольничная двусторонняя полисегментарная пневмония, среднетяжелая форма. Гипертоническая болезнь стадия 3, риск 4. СПОНМК 2016, 2018г.

Пациент десатурировал в ПДО до 87%, дан был кислород 15 л/мин, был вызван реаниматолог. Пациент осмотрен реаниматологом, в связи с тяжестью состояния пациент госпитализируется в отделение реанимации и интенсивной терапии.

У пациента была взята кровь на исследование гемостаза. Были выполнены рутинные методы и методом двойного центрифугирования получена свободная от тромбоцитов плазма, проведен тест на измерение оптической плотности фибринового сгустка. Получены следующие результаты по рутинным тестам гемостаза:

Фибриноген (2-4 г/л) ПТ по Квику ПВ (9,2-12,2 сек) АЧТВ (28-40 сек) МНО (0,9-1,5 у.е.) Д-димер (<0,5 нг/мл) 5,1 71,9 14,7 33,1 1,25 1,81

Результаты теста кинетики фибринообразования методом турбидиметрии:

V(скорость полимеризации фибринового сгустка)
(ед ОП/с) Lag-период (мин) Amax (ед ОП) 0,98 8,8 0,477

Подставляем наши данные в формулу и получаем индекс функциональности фибринового сгустка

X = (Amax*V)/Lag-time

X = (0,477*0,98)/8,8=0,05

Согласно нашим референсным интервалам индекса функциональности фибринового сгустка у данного пациента высокий риск геморрагических осложнений и развития 2 стадии ДВС-синдрома (≤0,05).

Несмотря на проводимую терапию, пациент прогрессивно ухудшался.

В 16:10 пациент на ИВЛ, через интубационную трубку, режим SIMV.

В 21:10 пациент на ИВЛ, через интубационную трубку, режим СMV. Подключена вазопрессорная поддержка. Отмечается нарастающая гипотензия, рефрактерность к вазопрессорной поддержке.

В 22:40 на фоне проводимого лечения произошла остановка сердечной деятельности, начаты реанимационные мероприятия, введение вазопрессорных препаратов и непрямой массаж сердца, которые проводились 30 минут - безуспешно.

В 23:10 - констатирована смерть пациента.

Диагноз: Коронавирусная инфекция CОVID-19, вирус идентифицирован, крайне тяжелое течение. Внебольничная двусторонняя полисегментарная пневмония смешанной этиологии, тяжелой степени. ДН 3. Гипертоническая болезнь стадия 3, риск 4.

НРС: тахисистолическая форма фибрилляции предсердий. ХСН I, ФК 2. ДВС-синдром.

Пример 3

У здорового донора-добровольца была взята кровь на исследование гемостаза. Были выполнены рутинные методы и методом двойного центрифугирования получена свободная от тромбоцитов плазма, проведен тест на измерение оптической плотности фибринового сгустка. Получены следующие результаты по рутинным тестам гемостаза:

Фибриноген (2-4 г/л) ПТ по Квику ПВ (9,2-12,2 сек) АЧТВ (28-40 сек) МНО (0,9-1,5 у.е.) Д-димер (<0,5 нг/мл) 2,2 91,9 12,4 23,1 1,1 0,23

Результаты теста кинетики фибринообразования методом турбидиметрии:

V(скорость полимеризации фибринового сгустка)
(ед ОП/с) Lag-период (мин) Amax (ед ОП) 3,5 4,1 1,388

Подставляем наши данные в формулу и получаем индекс функциональности фибринового сгустка

X = (Amax*V)/Lag-time

X= (1,388*3,5)/4,1=1,18

Согласно нашим референсным интервалам индекса функциональности фибринового сгустка у здорового донора результаты входят в нормальные значения. Что подтверждает наши расчеты.

Медико-клиническая эффективность предполагаемого способа заключается в возможности проведения данного теста большому количеству пациентов стационара (в силу его недорогой себестоимости и показательности) для оценки функциональности фибринового сгустка. Предложенный тест позволяет прогнозировать тромботические и геморрагические осложнения до того, как станут появляться клинические признаки осложнений, а, следовательно, проводить своевременную профилактику данных осложнений.

Заявленный способ характеристики кинетики фибринообразования in vitro у пациентов поможет определить высокий риск развития тромбозов и ДВС-синдрома на ранних этапах, что позволит предотвратить необратимые последствия осложнений. Данный метод исследования экономичен и не зависит от иностранной реагентики, так как все расходные материалы имеются у отечественных производителей.

Описанный способ может быть использован в лечебно-профилактических учреждениях любого профиля, включая поликлиники, способ прост в исполнении и интерпретации показателей.

Изобретение относится к медицине, а точнее к диагностике гипер- и гипокоагуляционного состояния на основе метода кинетики фибрина, и может быть использовано в клинической практике врачами клинической лабораторной диагностики, терапевтами, кардиологами с целью своевременной диагностики претромботического состояния и предупредить развитие ДВС-синдрома. Сущность способа заключается в том, что на основании сформированных баз данных результатов исследований динамики фибринообразования методом турбидиметрии разработана формула зависимости измеряемых параметров, которая позволяет систематизировать и охарактеризовать состояние системы гемостаза пациента в формате расчетного индекса. 4 ил., 2 табл.

Способ оценки плазменного гемостаза, включающий забор крови с антикоагулянтом, отличающийся тем, что проводят двойное центрифугирование при 1500g 15 мин и далее в режиме 10000g 5 мин для осаждения тромбоцитов и получения свободной от тромбоцитов плазмы, затем на спектрофотометре измеряют кинетику фибринообразования и полученные данные подставляют в расчётную формулу:

X = (Amax⋅V)/Lag-time, где

где Х - индекс, характеризующий функциональность фибринового сгустка;

Lag-time - соответствует времени генерации тромбина и образования протофибрилл;

V - скорость полимеризации, повышение оптической плотности на отрезке её нарастания в единицу времени, которая характеризует скорость латеральной агрегации и формирования волокон фибрина;

Amax - максимальная оптическая плотность при данной длине волны, определяемая количеством полимеризованного белка и толщиной фибриновых волокон,

при получении расчётного индекса Х≤0,05 констатируют гипокоагуляцию и риск развития 2 стадии ДВС-синдрома; при Х, равного 0,06–1,5 - констатируют нормальную функциональность плазменного гемостаза; если индекс Х>1,5 – констатируют гиперкоагуляцию и риск развития тромботических осложнений.