ТРАНСГЕННЫЙ ОБЪЕКТ КУКУРУЗЫ MON95275 И СПОСОБЫ ЕГО ОБНАРУЖЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК A01H6/46 C12N15/82 C12Q1/686 C12Q1/6895 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №63/014771, поданной 24 апреля 2020 г., которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Размер перечня последовательностей, содержащегося в файле под названием MONS480WO_ST25.txt, составляет 83283 байта (измерено в Microsoft Windows®), он был создан 20 апреля 2021 г., представлен в данном документе в электронном виде и включен посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Изобретение относится к молекулам рекомбинантной ДНК, присутствующим в и/или выделенным из объекта кукурузы MON95275. Изобретение также относится к трансгенным растениям кукурузы, частям растений и семенам, пыльце, клеткам и сельскохозяйственным продуктам, содержащим объект кукурузы MON95275, а также к способам их применения и обнаружения присутствия объекта кукурузы MON95275 в образцах, содержащих кукурузу. Трансгенные растения кукурузы, части растений, семена и клетки, содержащие ДНК объекта кукурузы MON95275, проявляют устойчивость к заражению насекомыми семейства жесткокрылых.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Кукуруза (Zea mays) является важной сельскохозяйственной культурой и основным источником пищи во многих регионах мира. Методы биотехнологии были применены к кукурузе для улучшения агрономических свойств и качества продукции. Одним из таких агрономических признаков является устойчивость к насекомым, проявляющаяся посредством встраивания сегмента рекомбинантной ДНК в геном растения кукурузы.

[0005] Существует ряд различных трансгенных объектов кукурузы, описанных в данной области, которые обеспечивают различные типы устойчивости к насекомым, особенно к видам чешуекрылых или жесткокрылых, и они включают MON810, ТС1507, MON89034, MON95379 и MIR162 среди тех, которые придают устойчивость к чешуекрылым, а также MON863, MON88017, DAS-59122-7, DP-004114-3, DP23211 и MIR604 среди тех, которые придают устойчивость к жесткокрылым, особенно устойчивость к заражению кукурузным корневым червем. Эти трансгенные объекты использовались в коммерческих целях в различных географических регионах по всему миру в течение длительного периода времени, часто использовались те же или аналогичные токсины, которые использовались в ранее используемых трансгенных объектах, и устойчивость к экспрессированным токсинам в этих объектах целевыми насекомыми-вредителями наблюдалась во многих географических регионах, где они были использованы.

[0006] Таким образом, в данной области техники существует постоянная потребность в создании новых трансгенных объектов кукурузы, которые проявляют устойчивость к заражению насекомыми, и, предпочтительно, новые трансгенные объекты придают устойчивость к целевым насекомым, включая те расы, которые развили устойчивость к существующим коммерчески используемым признакам, используя способы действия, которые не перекрываются и не похожи на способы действия, ранее используемые в более ранних коммерческих вариантах осуществления. Изобретения, описанные в данном документе, являются одним из примеров такого нового трансгенного объекта, который придает устойчивость к заражению кукурузным корневым червем, включая устойчивость к корневым червям, которые развили устойчивость к коммерческим вариантам осуществления, которые применялись ранее.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] В одном варианте осуществления изобретение относится к новому трансгенному объекту кукурузы - MON95275 - который обеспечивает инсектицидную борьбу с жесткокрылыми вредителями кукурузы. В другом варианте осуществления изобретение также относится к трансгенным растениям, растительным клеткам, семенам, частям растений, пыльце и товарным продуктам, которые содержат ДНК, которая специфически и идентифицируемо присутствует в объекте кукурузы MON95275 и не присутствует в кукурузе, не содержащей этого конкретного объекта. Эта специфичная для объекта ДНК представляет собой вставленную трансгенную ДНК и новые сегменты ДНК, которые описаны в данном документе как соединительные последовательности, образованные в точках разрыва хромосом, в которые была введена вставленная ДНК. В другом варианте осуществления изобретение относится к полинуклеотидам, специфичным для объекта кукурузы MON95275 и растения, растительных клеток, семян, частей растений, пыльцы, потомства растений и товарных продуктов, содержащих ДНК объекта MON95275. В еще одном варианте осуществления предусмотрены способы, связанные с возможностью отбора и обнаружения присутствия (или отсутствия) объекта кукурузы MON95275 в образце, такие способы позволяют исследователю подтвердить, присутствует или нет ДНК объекта в конкретном образце, подвергнутом способу.

[0008] Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к молекуле рекомбинантной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, и их полного комплемента.

[0009] В одном варианте осуществления молекула рекомбинантной ДНК получена из кукурузы, содержащей объект кукурузы MON95275, в образце семян, которые были депонированы в репозиторий Американской коллекции типов культур (АТСС) и обозначены номером доступа РТА-126049.

[0010] В другом аспекте изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей полинуклеотидный сегмент достаточной длины для функционирования в качестве ДНК-зонда, который специфически гибридизуется в строгих условиях гибридизации с ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце, при этом обнаружение гибридизации зонда с ДНК объекта кукурузы при строгих условиях гибридизации является диагностическим для подтверждения присутствия ДНК объекта кукурузы MON95275 в этом образце. В определенных вариантах осуществления образец включает растение кукурузы, растительную клетку кукурузы, семя кукурузы, часть растения кукурузы, пыльцу кукурузы, потомство любого из вышеизложенного, обработанное семя кукурузы, корм для животных, содержащий кукурузу, кукурузное масло, кукурузную муку, кукурузный крахмал, кукурузные хлопья, кукурузные отруби, макаронные изделия и другие пищевые продукты, изготовленные из кукурузы, биомассу кукурузы, и топливные продукты, произведенные с использованием кукурузы и частей кукурузы, при условии, что такая кукуруза и продукты из кукурузы содержат обнаруживаемые количества ДНК объекта кукурузы MON95275 или обнаруживаемые количества нового токсина белков или двухцепочечной ДНК, продуцируемой растениями кукурузы, клетками и т.п., которые содержат ДНК объекта кукурузы MON95275.

[0011] Еще один аспект изобретения относится к первой молекуле ДНК и второй молекуле ДНК, отличной от первой молекулы ДНК, то есть к паре молекул ДНК, которые функционируют как праймеры при совместном использовании в реакции амплификации, содержащей соответствующие реагенты, необходимые для проведения процедуры амплификации ДНК, причем образец содержит матричную ДНК объекта кукурузы MON95275, для получения ампликона, диагностического для присутствия указанной ДНК объекта кукурузы MON95275 в указанном образце. Полученный ампликон может содержать по меньшей мере нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10.

[0012] Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ обнаружения присутствия диагностического сегмента ДНК для подтверждения присутствия или отсутствия ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце. В определенном варианте осуществления способ осуществляют путем приведения образца в контакт с молекулой ДНК-зонда, которая специфически гибридизуется с ДНК, уникально связанной с объектом кукурузы MON95275, затем подвергают образец и молекулу ДНК-зонда строгим условиям гибридизации, чтобы позволить зонду связать соответствующий комплементарный сегмент специфичной ДНК объекта кукурузы MON95275. Обнаружение гибридизации молекулы ДНК-зонда с ДНК в образце будет окончательным, а это означает, что обнаружение такой гибридизации будет диагностическим, что ДНК в образце содержит обнаруживаемое количество ДНК объекта кукурузы MON95275.

[0013] Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ обнаружения присутствия сегмента ДНК, диагностического для ДНК объекта кукурузы MON95275, в образце, содержащем ДНК кукурузы. В одном варианте осуществления способ включает стадии контакта образца с парой молекул ДНК, которые функционируют как праймеры для термической амплификации, специфичные для амплификации сегмента ДНК объекта кукурузы MON95275, и проведения реакции амплификации, достаточной для получения ампликона ДНК, затем обнаружения присутствия ампликона ДНК в реакции. Обнаружение ампликона ДНК может быть диагностическим признаком наличия в образце обнаруживаемого количества ДНК объекта кукурузы MON95275, и ампликон может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10.

[0014] Другой вариант осуществления изобретения представляет собой растение кукурузы, часть растения кукурузы, клетку кукурузы или ее часть, содержащую рекомбинантную полинуклеотидную молекулу, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Это растение кукурузы, часть растения кукурузы, клетка кукурузы или ее часть обладают инсектицидным действием, если они содержатся в рационе жесткокрылых насекомых-вредителей. Целевые жесткокрылые насекомые-вредители, подлежащие контролю, включают, но не ограничиваются ими, западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera) и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi). Кроме того, растение кукурузы можно дополнительно определить как потомство любого поколения растения кукурузы, содержащего объект кукурузы MON95275, при условии, что потомство содержит ДНК объекта кукурузы MON95275.

[0015] Еще один вариант осуществления изобретения представляет собой способ защиты растения кукурузы от заражения насекомыми, при этом указанный способ включает введение в рацион жесткокрылого насекомого-вредителя инсектицидно эффективного количества клеток или ткани растения кукурузы, содержащего объект кукурузы MON95275. Предполагаемые жесткокрылые насекомые-вредители включают западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera) и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi).

[0016] Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения растения кукурузы, устойчивого к насекомым, включающий: а) скрещивание двух разных растений кукурузы для получения потомства, причем по меньшей мере одно из двух разных растений кукурузы содержит ДНК объекта кукурузы MON95275; Ь) подтверждение в потомстве наличия сегмента ДНК, диагностического для ДНК объекта кукурузы MON95275; и с) отбор потомства, содержащего ДНК объекта кукурузы MON95275. В определенных вариантах осуществления это потомство представляет собой растения кукурузы, устойчивые к кукурузному корневому червю.

[0017] Еще одним вариантом осуществления изобретения является семя кукурузы, неживой растительный материал или микроорганизм, содержащие обнаруживаемое количество нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 или их полных комплементов.

[0018] Еще один вариант осуществления представляет собой товарный продукт из кукурузы, содержащий обнаруживаемое количество молекулы ДНК, уникальной для ДНК, описывающей объект кукурузы MON95275, где молекула содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Предполагаемые товарные продукты из кукурузы включают, помимо прочего, целые или обработанные семена кукурузы, корма для животных, содержащие кукурузу, кукурузное масло, кукурузную муку, кукурузный крахмал, кукурузные хлопья, кукурузные отруби, кукурузную биомассу и топливные продукты, произведенные с использованием кукурузы и частей кукурузы.

[0019] Другой вариант осуществления изобретения представляет собой растение кукурузы, часть растения кукурузы или семена кукурузы, содержащие ДНК, функционирующую в качестве матрицы, при тестировании методом амплификации ДНК с получением ампликона, диагностического для присутствия ДНК объекта кукурузы MON95275.

[0020] Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ определения зиготности генома растения кукурузы или семян кукурузы, содержащих ДНК, описывающую объект кукурузы MON95275. Зиготность определяется в ряде последовательных шагов. На первой стадии образец, содержащий ДНК кукурузы, вступает в контакт с первой парой праймеров, которая способна продуцировать ампликон, диагностический для ДНК, который описывает и присутствует исключительно в объекте кукурузы MON95275. Затем образец, содержащий ДНК кукурузы, вступает в контакт со второй парой праймеров, предназначенной для получения ампликона внутреннего стандарта, о котором известно, что он однокопийный и гомозиготный в растении кукурузы. Способ дополнительно включает приведение образца ДНК в контакт с набором зондов, который содержит по меньшей мере первый зонд, специфически гибридизирующий аллель объекта кукурузы MON95275, и второй зонд, специфически гибридизующийся с внутренним стандартом геномной ДНК, который, как известно, является однокопийным и гомозиготным в растении кукурузы. Способ также включает реакцию амплификации ДНК, проводимую с использованием ПЦР в реальном времени и определением порогов цикла (значения Ct) ампликона, соответствующего аллелю объекта кукурузы MON95275, и однокопийного гомозиготного внутреннего стандарта. После амплификации можно рассчитать разницу (ΔCt) между значением Ct однокопийного гомозиготного ампликона внутреннего стандарта и значением Ct аллеля для ампликона объекта кукурузы MON95275. В одном варианте осуществления определяется зиготность, при этом ΔCt около нуля (0) указывает на гомозиготность встроенной Т-ДНК объекта кукурузы MON95275, a ΔCt около единицы (1) указывает на гетерозиготность встроенной Т-ДНК объекта кукурузы MON95275. В определенных вариантах осуществления этого способа пары праймеров выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:15 в комбинации с SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:18 в комбинации с SEQ ID NO:19; и при этом зонды представляют собой SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:20. В еще одном варианте осуществления данного изобретения значение ΔCt, равное примерно единице (1), указывающее на гетерозиготность встроенной Т-ДНК объекта кукурузы MON95275, находится в диапазоне от 0,75 до 1,25. В определенных вариантах осуществления значение ΔCt, равное примерно нулю (0), может составлять примерно 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 или 0,25, в других вариантах осуществления значение ΔCt, равное примерно единице (1), может составлять примерно 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,05, 1,1, 1,15, 1,2 или 1,25. В дополнительном варианте осуществления значение ΔCt, равное примерно единице (1), может находиться в диапазоне от 0,75 до 1,25, от 0,8 до 1,25, от 0,85 до 1,25, от 0,9 до 1,25, от 0,95 до 1,25, от 1,0 до 1,25, от 1,05 до 1,25, от 1,1 до 1,25, от 1,15 до 1,25, от 1,2 до 1,25, от 0,75 до 1,2, от 0,8 до 1,2, от 0,85 до 1,2, от 0,9 до 1,2, от 0,95 до 1,2, от 1,0 до 1,2, от 1,05 до 1,2, от 1,1 до 1,2, от 1,15 до 1,2, от 0,75 до 1,15, от 0,8 до 1,15, от 0,85 до 1,15, от 0,9 до 1,15, от 0,95 до 1,15, от 1,0 до 1,15, от 1,05 до 1,15, от 1,1 до 1,15, от 0,75 до 1,1, от 0,8 до 1,1, от 0,85 до 1,1, от 0,9 до 1,1, от 0,95 до 1,1, от 1,0 до 1,1, от 1,05 до 1,1, от 0,75 до 1,05, от 0,8 до 1,05, от 0,85 до 1,05, от 0,9 до 1,05, от 0,95 до 1,05, от 1,0 до 1,05, от 0,75 до 1,0, от 0,8 до 1,0, от 0,85 до 1,0, от 0,9 до 1,0, от 0,95 до 1,0, от 0,75 до 0,95, от 0,8 до 0,95, от 0,85 до 0,95, от 0,9 до 0,95, от 0,75 до 0,9, от 0,75 до 0,85, от 0,75 до 0,8, от 0,8 до 0,9, от 0,8 до 0,85 или от 0,85 до 0,9.

[0021] Еще одним вариантом осуществления изобретения является способ определения зиготности растения кукурузы или семян кукурузы, содержащих объект кукурузы MON95275, включающий: а) приведение образца, содержащего ДНК кукурузы, в контакт с набором пар праймеров, включающим по меньшей мере две разные пары праймеров, способных продуцировать первый ампликон, диагностический для объекта кукурузы MON95275, и второй ампликон, диагностический для нативной геномной ДНК кукурузы, не содержащей объект кукурузы MON95275; i) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты с образцом и набором пар праймеров; ii) обнаружение в реакции амплификации нуклеиновых кислот первого ампликона, диагностического для объекта кукурузы MON95275, или второго ампликона, диагностического для нативной геномной ДНК кукурузы, не содержащей объект кукурузы MON95275, причем присутствие только первого ампликона является диагностическим признаком гомозиготной ДНК объекта MON95275 в образце, и присутствие как первого ампликона, так и второго ампликона является диагностическим признаком растения кукурузы, гетерозиготного по аллелю объекта кукурузы MON95275; или b) приведение образца, содержащего ДНК кукурузы, в контакт с набором зондов, который содержит по меньшей мере первый зонд, который специфически гибридизуется с ДНК объекта кукурузы MON95275, и по меньшей мере второй зонд, который специфически гибридизуется с геномной ДНК кукурузы, которая была нарушена вставкой гетерологичной ДНК объекта кукурузы MON95275 и не гибридизуется до ДНК объекта кукурузы MON95275; i) гибридизацию набора зондов с образцом в строгих условиях гибридизации, при этом обнаружение гибридизации только первого зонда в условиях гибридизации является диагностическим в отношении гомозиготного аллеля ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце, и при этом обнаружение гибридизации обоих первого зонда и второго зонда в условиях гибридизации является диагностическим для гетерозиготного аллеля объекта кукурузы MON95275 в указанном образце. В одном варианте осуществления этого способа набор пар праймеров содержит SEQ ID NO: 15 в комбинации с SEQ ID NO: 16, которые можно использовать для получения ампликона, который можно обнаружить с помощью последовательности зонда, представленной в SEQ ID NO: 17, и SEQ ID NO:21 в комбинации с SEQ ID NO:22, которые можно использовать для получения ампликона, который можно обнаружить с использованием последовательности зонда, представленной в SEQ ID NO:23.

[0022] Вышеупомянутые и другие аспекты изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0023] На фиг. 1 представлено графическое изображение ориентации и выравнивания элементов/сегментов ДНК, которые присутствуют в нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID N0:10, которая представляет собой последовательность вставленной трансгенной ДНК и соответствующих смежных 5'- и 3'-последовательностей генома кукурузы, присутствующего в объекте кукурузы MON95275. Каждая из [1] (SEQ ID NO:l) и [2] (SEQ ID NO:2) графически представляет приблизительные положения последовательностей 50 последовательных нуклеотидных сегментов, обозначаемых соответственно как 5'- или 3'-соединительная последовательность, соответственно, произвольно назначенные левая, 5'-концевая, и правая, -концевая соединительные последовательности [9], которые состоят соответственно из 25 последовательных нуклеотидов ДНК генома кукурузы (концы светло-серого заштрихованного сегмента [10]) и 25 последовательных нуклеотидов смежной встроенной трансгенной ДНК (сегмент, заштрихованный более темным серым цветом [10]); каждая из [3] (SEQ ID NO:3) и [4] (SEQ ID NO:4) графически представляет 100 последовательных нуклеотидных сегментов ДНК в положениях 5'- и 3'-соединения, представляет собой соответственно 5'- или 3'-соединительные последовательности, и каждая содержит 50 последовательных нуклеотидов геномной ДНК кукурузы и 50 последовательных нуклеотидов смежной встроенной трансгенной ДНК; каждая из [5] (SEQ ID NO:5) и [6] (SEQ ID NO:6) графически представляет 200 последовательных нуклеотидных сегментов ДНК в положениях соединения, представляет собой соответственно 5' или 3'-соединительную последовательность, и каждая содержит 100 последовательных нуклеотидов ДНК генома кукурузы и 100 последовательных нуклеотидов смежной встроенной трансгенной ДНК; [7] (SEQ ID NO:7) представляет собой область 5'-соединения геномной ДНК кукурузы и встроенной трансгенной ДНК и содержит 1073 последовательных нуклеотида геномной ДНК кукурузы и 153 последовательных нуклеотида смежной встроенной трансгенной ДНК; [8] (SEQ ID NO:8) представляет собой область 3'-соединения геномной ДНК кукурузы и встроенной трансгенной ДНК, содержащей 101 последовательный нуклеотид встроенной трансгенной ДНК и 1006 последовательных нуклеотидов смежной геномной ДНК кукурузы; [9] (SEQ ID NO:9) представляет длину и структуру встроенной ДНК, а стрелки и метки под каждой стрелкой представляют элементы экспрессии в трех кассетах встроенной ДНК, в которых RB/LB представляют собой положения правой и левой границ вектора трансформации, опосредованной двойной границей Agrobacterium, LoxP представляет собой положение остаточного сайта узнавания Cre-рекомбиназы, оставшегося во встроенной ДНК после удаления маркера, три буквы Е представляют положения энхансерных элементов в соответствующих конструктах, три буквы Р обозначают положения промоторных элементов в соответствующих конструктах, три буквы L обозначают положения лидерных последовательностей (5'-нетранслируемые области, 5'UTR) в соответствующих конструктах, три буквы I обозначают положения интронных последовательностей в соответствующих конструктах, три буквы Т представляют положения последовательностей терминации транскрипции (3'-нетранслируемые области, 3'UTR) в соответствующих конструктах, a ISR представляет собой положение области межгенной последовательности (ISR4). Три конструкта справа налево на странице фигуры кодируют токсичные для жесткокрылых вредителей токсины Vip4Da2 и Cry75Aa1, а сегмент, кодирующий молекулу РНК, способную складываться в двухцепочечную молекулу в форме шпильки, которая предназначена для подавления транскриптов и, таким образом, уменьшение транслируемого белка Snf7, белка, необходимого для выживания личинок кукурузного корневого червя. [11] (SEQ ID NO:11) представляет положение ДНК генома кукурузы, фланкирующей 5'-конец встроенной ДНК, и [12] (SEQ ID NO:12) представляет положение ДНК генома кукурузы, фланкирующей 3'-конец встроенной ДНК. [15] (SEQ ID NO:15, праймер SQ51355) и [16] (SEQ ID NO:16, праймер SQ51355) представляют положение пары праймеров, которую можно использовать в реакции термической амплификации для получения ампликона из 74 нуклеотидов, содержащих правую вставку/соединение генома, стрелки показывают направление, в котором будет происходить амплификация с образованием ампликона из соответствующих положений внутри [10]. [17] (SEQ ID NO:17, РВ10263) представляет собой зонд и положение, в котором зонд будет связываться (или гибридизоваться) с ампликоном, полученным с использованием праймеров [16] и [17], для обнаружения присутствия объекта MON95275 в образце.

[0024] На фиг. 2 показана кассета Т-ДНК в плазмидном векторе, используемом для трансформации кукурузы. Один объект вставки, подвергнутый вырезанию маркера Cre-рекомбиназы, привел к объекту MON95275. [13] (SEQ ID NO:13) иллюстрирует ДНК в плазмидном векторе перед вставкой («Т-ДНК перед вставкой»). Стрелки ниже [13] представляют отдельные генетические элементы, содержащиеся в трех трансгенных кассетах, предназначенных для экспрессии полученных эффективных токсических агентов для жесткокрылых. Кассета селектируемого маркера СР4 EPSPS фланкирована между двумя сегментами LoxP, которые распознаются Cre-рекомбиназой и способны вырезать селектируемый маркер из объекта вставки, содержащего [13]. ДНК объекта вставки представлена [14], отличаясь от [13] только тем фактом, что сегмент [13] был вставлен в геном кукурузы и теперь изображен как фланкированный 5' и 3' сегментами генома кукурузы, помеченными как 5'-фланк и 3'-фланк. [18] представляет сегмент, показанный на фиг. 1 как [10].

[0025] На фиг. 3 представлено схематическое изображение временной шкалы исследований, испытаний и разработок, на которые опирались при выборе объекта кукурузы MON95275.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0026] SEQ ID NO:l представляет собой последовательность из 50 нуклеотидов, представляющую 5'-соединительную область ДНК генома кукурузы и встроенной кассеты трансгенной экспрессии (25 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 5'-конце SEQ ID NO:l, 25 нуклеотидов трансгенной встроенной ДНК на 3'-конце SEQ ID NO:l), и может быть идентифицирована в SEQ ID N0:10 в положениях нуклеотидов 1049-1098.

[0027] SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность из 50 нуклеотидов, представляющую 3'-соединительную область встроенной кассеты трансгенной экспрессии и ДНК генома кукурузы (25 нуклеотидов трансгенной встроенной ДНК на 5'-конце SEQ ID NO:2, 25 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 3'-конце SEQ ID NO:2), и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 15731-15780.

[0028] SEQ ID NO:3 представляет собой последовательность из 100 нуклеотидов, представляющую 5'-соединительную область ДНК генома кукурузы и встроенную кассету трансгенной экспрессии (50 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 5'-конце SEQ ID NO:3, 50 нуклеотидов трансгенной встроенной ДНК на 3'-конце SEQ ID NO:3) и может быть идентифицирована в SEQ ID N0:10 в положениях нуклеотидов 1024-1123.

[0029] SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность из 100 нуклеотидов, представляющую 3'-соединительную область встроенной кассеты трансгенной экспрессии и ДНК генома кукурузы (50 нуклеотидов трансгенной встроенной ДНК на 5'-конце SEQ ID NO:4, 50 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 3'-конце SEQ ID NO:4), и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 15706-15805.

[0030] SEQ ID NO:5 представляет собой последовательность из 200 нуклеотидов, представляющую 5'-соединительную область ДНК генома кукурузы и встроенной кассеты трансгенной экспрессии (100 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 5'-конце SEQ ID NO:5, 100 нуклеотидов трансгенной встроенной ДНК на 3'-конце SEQ ID NO:5), и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 974-1173.

[0031] SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность из 200 нуклеотидов, представляющую 3'-соединительную область встроенной кассеты трансгенной экспрессии и ДНК генома кукурузы (100 нуклеотидов трансгенной встроенной ДНК на 5'-конце SEQ ID NO:6, 100 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 3'-конце SEQ ID NO:6), и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 15656-15855.

[0032] SEQ ID NO:7 представляет собой последовательность из 1226 нуклеотидов, представляющую 5'-соединительную область ДНК генома кукурузы и встроенную кассету трансгенной экспрессии (1073 нуклеотида ДНК генома кукурузы на 5'-конце SEQ ID NO:5, 153 нуклеотида трансгенной встроенной ДНК на 3'-конце SEQ ID NO:5), и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 1-1226.

[0033] SEQ ID NO:8 представляет собой последовательность из 1 207 нуклеотидов, представляющую 3'-соединительную область встроенной кассеты трансгенной экспрессии и ДНК генома кукурузы (101 нуклеотид трансгенной встроенной ДНК на 3'-конце SEQ ID NO:8, 1106 нуклеотидов ДНК генома кукурузы на 3'-конце SEQ ID NO:8), и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 15655-16861.

[0034] SEQ ID NO:9 представляет собой последовательность из 14682 нуклеотидов, соответствующую трансгенной встроенной Т-ДНК объекта кукурузы MON95275, и может быть идентифицирована в SEQ ID NO: 10 в положениях нуклеотидов 1074-15755.

[0035] SEQ ID NO:10 представляет собой последовательность из 16 861 нуклеотида, соответствующую непрерывной нуклеотидной последовательности нуклеотидной последовательности 5'-геномной фланкирующей ДНК, встроенной нуклеотидной последовательности Т-ДНК в объекте MON95275 и нуклеотидной последовательности 3'-геномной фланкирующей ДНК; и включает SEQ ID NO:11 (нуклеотиды 1-1073), SEQ IDNO:9 (нуклеотиды 1074-15755) и SEQ IDNO: 12 (нуклеотиды 15756-16861).

[0036] SEQ ID NO:11 представляет собой последовательность из 1073 нуклеотидов, представляющую геномную ДНК кукурузы, фланкирующую 5'-конец встроенной T-ДНК, и может быть идентифицирована в SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 1-1073.

[0037] SEQ ID NO:12 представляет собой последовательность из 1106 нуклеотидов, представляющую геномную ДНК кукурузы, фланкирующую 3'-конец встроенной Т-ДНК, и может быть идентифицирована в SEQ ID N0:10 в положениях нуклеотидов 15756-16861.

[0038] SEQ ID NO:13 представляет собой последовательность из 19 612 нуклеотидов, представляющую кассету трансгена, содержащуюся в бинарном плазмидном векторе трансформации растений, используемом для трансформации кукурузы с получением объекта кукурузы MON95275.

[0039] SEQ ID NO:14 представляет собой последовательность LoxP из 35 нуклеотидов, используемую для Cre-опосредованного вырезания и рекомбинации, и остаточная последовательность может быть идентифицирована в пределах SEQ ID NO:10 в положениях нуклеотидов 15444-15478.

[0040] SEQ ID NO:15 представляет собой последовательность из 27 нуклеотидов, соответствующую праймеру для термической амплификации, обозначаемому как SQ20267, которая может использоваться для идентификации ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце или который можно использовать для обнаружения объекта вставки, который при вырезании маркера Cre-рекомбиназы приводит к ДНК объекта MON95275. SEQ ID NO:15 идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 15706-15732 SEQ ID NO:10.

[0041] SEQ ID NO:16 представляет собой последовательность из 24 нуклеотидов, соответствующую праймеру для термической амплификации, обозначаемому как SQ51355, используемому для идентификации ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце или который можно использовать для обнаружения объекта вставки, который при вырезании маркера Сге-рекомбиназы приводит к ДНК объекта MON95275. SEQ ID NO:16 идентична обратному комплементу нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 15756-15779 SEQ ID NO:10.

[0042] SEQ ID NO:17 представляет собой последовательность из 19 нуклеотидов, соответствующую зонду, обозначаемому как РВ10263, используемому для идентификации ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце или который можно использовать для обнаружения объекта вставки, который при вырезании маркера Cre-рекомбиназы приводит к ДНК объекта MON95275. SEQ ID NO:17 идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 15734-15752 SEQ ID NO:10, и в качестве зонда может связываться с полинуклеотидным сегментом, имеющим обратный комплемент нуклеотидов в этом положении.

[0043] SEQ ID NO:18 представляет собой последовательность из 24 нуклеотидов, соответствующую праймеру для термической амплификации, обозначенному как SQ20222, используемому в качестве внутреннего контроля для анализа объекта и зиготности для объекта кукурузы MON95275, и который гибридизуется с областью генома кукурузы.

[0044] SEQ ID NO:19 представляет собой последовательность из 28 нуклеотидов, соответствующую праймеру для термической амплификации, обозначенному как SQ20221, используемому в качестве внутреннего контроля для анализа объекта и зиготности для объекта кукурузы MON95275, и который гибридизуется с областью генома кукурузы.

[0045] SEQ ID NO:20 представляет собой последовательность из 17 нуклеотидов, соответствующую зонду, обозначенному как РВ50298, используемому в качестве внутреннего контроля для анализа объекта и зиготности для объекта кукурузы MON95275, и который гибридизуется с областью генома кукурузы.

[0046] SEQ ID NO:21 представляет собой последовательность из 20 нуклеотидов, соответствующую праймеру для термической амплификации, обозначенному как PNEG95275_F, используемому в анализе зиготности для объекта кукурузы MON95275, и который гибридизуется с областью геномной ДНК кукурузы, которая была удалена, когда Т-ДНК использовалась для получения объекта MON95275, встроенного в геном кукурузы. Ампликон, полученный в реакции термической амплификации с использованием комбинации праймеров PNEG95275_F и PNEG95275_R (SEQ ID NO:22) и нативной ДНК кукурузы в качестве матрицы, является диагностическим для аллеля дикого типа, в котором отсутствует встроенная Т-ДНК MON95275.

[0047] SEQ ID NO:22 представляет собой последовательность из 20 нуклеотидов, соответствующую праймеру для термической амплификации, обозначенному как PNEG95275_R, используемому в анализе зиготности для объекта кукурузы MON95275, и который гибридизуется с областью геномной ДНК кукурузы, которая была удалена, когда Т-ДНК использовалась для получения объекта MON95275, встроенного в геном кукурузы. Ампликон, полученный в реакции термической амплификации с использованием комбинации праймеров PNEG95275_F (SEQ ID NO:21) и PNEG95275_R и нативной ДНК кукурузы в качестве матрицы, является диагностическим для аллеля дикого типа, в котором отсутствует встроенная Т-ДНК MON95275.

[0048] SEQ ID NO:23 представляет собой последовательность из 17 нуклеотидов, соответствующую зонду, обозначенному как PRBNEG95275, используемому в анализе зиготности для подтверждения отсутствия объекта кукурузы MON95275, и который гибридизуется с областью нативной геномной ДНК кукурузы, которая была удалена, когда Т-ДНК использовалась для получения объекта MON95275, встроенного в геном кукурузы.

[0049] SEQ ID NO:24 представляет собой последовательность ДНК, которая функционирует в растениях как сегмент усилителя экспрессии.

[0050] SEQ ID NO:25 представляет собой функциональный промотор растения, функционально связанный с нетранслируемой лидерной последовательностью.

[0051] SEQ ID NO:26 представляет собой последовательность ДНК, которая функционирует в растениях как сегмент усилителя экспрессии.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0052] Данное изобретение обеспечивает объект трансгенной кукурузы - MON95275 -который обеспечивает инсектицидный контроль над жесткокрылыми вредителями кукурузы посредством экспрессии Cry75Aal, Vip4Da2 и дцРНК, предназначенной для подавления нативного и основного кукурузного корневого червя DvSnf7. В частности, объект кукурузы MON95275 обеспечивает устойчивость к жесткокрылым насекомым-вредителям, западному кукурузному жуку (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) и северному кукурузному жуку (Diabrotica barberi, NCR). Объект кукурузы MON95275 удовлетворит большую потребность в борьбе с этими насекомыми в сельскохозяйственном производстве кукурузы, где присутствуют кукурузные корневые черви, поскольку химические инсектициды часто не обеспечивают надлежащего контроля над этими насекомыми, или поскольку требуется многократное применение таких химикатов на протяжении всего сезона сбора урожая, увеличивая потребность в рабочей силе, углеродный след и попадание химических пестицидов в окружающую среду, а также значительно увеличивая стоимость производства кукурузы. Ссылка на объект кукурузы MON95275 в данном документе подразумевает как эквивалентная ссылке на MON 95275, объект MON95275, объект MON 95275, MON95275 объект, объект MON 95275; ссылки взаимозаменяемы.

[0053] Устойчивость к заражению видами жесткокрылых, обеспечиваемая объектом MON95275, возникает в связи с экспрессией сегмента ДНК, кодирующего два инсектицидных белка и двухцепочечную РНК (дцРНК), способную вмешиваться в основной ген кукурузного корневого червя, которые функционально и ковалентно связаны внутри встроенной трансгенной ДНК, которая частично определяет объект кукурузы MON95275. Двумя инсектицидными белками в объекте MON95275 являются белок Сгу75Аа1 (публикация заявки на патент США №2016-0319302А2, SEQ ID NO: 25, кодирующая последовательность, SEQ ID NO:37) и белок Vip4Da2 (патент США №10100330, SEQ ID NO:2, кодирующая последовательность, SEQ ID NO:3). дцРНК, продуцируемая в объекте MON95275, нацелена на супрессию гена, называемого DvSnf7, у западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera) при проглатывании корневым червем (см., например, патент США №7943818, SEQ ID NO:818). Указанные два инсектицидных белка и дцРНК экспрессируются из трех экспрессионных кассет внутри встроенной конструкции трансгенной ДНК, как указано в SEQ ID NO:9 и проиллюстрировано на фиг. 1.

[0054] Белок Cry75Aa1 в объект кукурузы MON95275 экспрессируется промотором RCc3 Tripsacum dactyloides (Патент США №9617553, SEQ ID NO:13) и лидером, функционально связанными с энхансером, образованным из промотора вируса мозаичности булгура, номер доступа Genbank EF513491, нуклеотиды 1-322; и интрона гена белка 14-3-3С Setaria italica (Публикация заявки на патент США №2013-0031672 А2, SEQ ID NO: 151).

[0055] Белок Vip4Da2 в объекте кукурузы MON95275 экспрессируется промотором и лидером белка-переносчика липидов Zea mays, энхансером с перегруппированным энхансером, образованным из нескольких общедоступных промоторов вируса мозаичности булгура и интрона гена актина 4 Setaria italica (Публикация заявки на патент США №2013-0031672 А2, SEQ ID NO:627). Энхансер вируса мозаичности булгура (DaMV), функционально связанный с промотором белка-переносчика липидов Zea mays, и лидер представляют собой фрагменты перегруппированного композитного материала, образованных из нескольких общедоступных номеров доступа Genbank DaMV, и представлены в виде SEQ ID NO:24. Первый фрагмент получен из промотора штамма DaMV-Holland (DaMV-H), регистрационный номер Genbank EU090957, нуклеотиды 1177-1494. Данный фрагмент функционально связан со вторым фрагментом, полученным из промотора DaMV-H, нуклеотиды 1003-1176. В первом фрагменте, относительно SEQ ID NO:24, нуклеотиды 287-288, и нуклеотиды 319-322 были изменены на последовательности в аналогичных положениях промотора DaMV в номере доступа Genbank JX272320. В исходной конфигурации промотора DaMV второй фрагмент будет предшествовать первому фрагменту. Перегруппировка данных двух фрагментов обеспечивала более высокую экспрессию относительно исходного фрагмента и, следовательно, была выбрана для применения в объекте MON95275.

[0056] дцРНК, специфичная к последовательности, кодирующей DvSnf7, в объекте кукурузы MON95275, управляется промотором и лидером, образованными из изолята вируса мозаичности цветной капусты (CaMV) NY8153 (представленного SEQ ID NO:25), который усилен энхансером, образованным из промотора гена pIIG, кодирующего белок, индуцированный физическим импедансом из Zea mays; и интрона hsp70 Zea mays. Промотор/лидер CaMV образован из номера доступа Genbank М90541, нуклеотиды 6907-7482. Относительно SEQ ID NO:25, второй нуклеотид был изменен с треонина (Т) на аденин (А) для удаления потенциального инициирующего кодона в функционально связанной конфигурации кассеты. Данный промотор/лидер CaMV включает более длинную лидерную последовательность относительно промотора и лидера CaMV в объекте кукурузы MON87411. Данный более длинный лидер повышал уровни экспрессии дцРНК DvSNF7 в MON95275 относительно MON87411.

[0057] Экспрессия трансгенных кассет Сгу75Аа1 и Vip4Da2 в MON95275 ориентированы ковергентным способом, как показано на фиг. 1. Трансгенная кассета DvSnf7 в MON95275 ориентирована в непараллельном направлении относительно трансгенной кассеты Сгу75Аа1, как показано на фиг. 1. Трансгенные кассеты DvSnf7 и Сгу75Аа1 разделены между собой областью межгенной последовательности (ISR4, Предварительная заявка на патент США с серийным номером 62/875752). На фиг. 1 показаны относительные положения каждого элемента - энхансера (Е), промотора (Р), 5' UTR или лидера (L), интрона (I), 3' UTR (Т), ISR4 (ISR), DvSnf7, Cry75Aal, и Vip4Da2 - включенных в SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10.

[0058] Как описано в данном документе, были оценены многочисленные конструкции, которые различались использованием элементов экспрессии, кодированием токсина, последовательностью и ориентацией. Конструкция, использованная для создания объекта кукурузы MON95275, показанная на фиг. 2 и представленная как SEQ ID NO: 13, обеспечивала превосходную эффективность по сравнению с другими конструкциями при оценке устойчивости к заражению жесткокрылыми насекомыми-вредителями. Кроме того, объект кукурузы MON95275 не содержит маркеры, применяемые для селекции трансформированной растительной клетки в результате вырезания посредством Cre-рекомбиназы. Кассета для селекции СР4 показана на фиг.2 и содержится в SEQ ID NO:13. Кассета для селекции СР4 фланкирована двумя сайтами LoxP. Иссечение с использованием Cre-рекомбиназы привело к потере кассеты для селекции СР4 после скрещивания с Cre-экспрессирующими трансгенными объектами кукурузы. Полученное потомство оценивали на отсутствие кассеты для селекции, а также на отсутствие кассеты для селекции Cre-рекомбиназы, и те потомства, у которых отсутствует и то, и другое, отбирали для дальнейшей оценки, что приводило к отбору безмаркерного объекта кукурузы MON95275.

[0059] Объект MON95275 отбирали на основании сравнения тысяч различных независимых трансгенных объектов, каждый из которых трансформирован конструкцией, содержащей трансгенную кассету, представленную SEQ ID NO:13, или другими конструкциями, содержащими те же или другие токсины. Образованные объекты, экспрессирующие токсины для насекомых, сравнивали с нетрансгенными контрольными растениями кукурузы того же сорта. Результаты, показанные в примерах, демонстрируют, что объект MON95275 проявлял лучшие характеристики вследствие экспрессии белка Сгу75Аа1 и Vip4Da2, и специфичной к DvSnf7 дцРНК. Каждый из множества трансгенных объектов, полученных с использованием конструкции, применяемой для образования объекта MON95275, с большей вероятностью, чем другие объекты, полученные с другими конструкциями, продемонстрировали эффективную борьбу с жесткокрылыми насекомыми-вредителями.

[0060] MON95275 был создан посредством методик трансформации растения, применяемых для вставки гетерологичной ДНК (также известной как трансгенная ДНК) случайным образом в хромосому генома клетки кукурузы с получением генетически модифицированной клетки кукурузы,также называемой «трансгенной» или «рекомбинантной» клеткой кукурузы. Посредством данной методики многие отдельные клетки трансформируются, каждая из которых приводит к уникальному «трансгенному объекту» или «объекту» вследствие случайной вставки чужеродной ДНК в геном. Затем трансгенное растение регенерируется из каждой отдельной трансгенной клетки. Это приводит к тому, что каждая клетка трансгенного растения содержит уникально вставленный трансгенный объект как стабильную часть своего генома. Затем данное трансгенное растение можно применять для получения семени, которое затем высаживают и выращивают до растений-потомков, каждое из которых содержит уникальный трансгенный объект.

[0061] Объект кукурузы MON95275 получали посредством Agrobacterium-опосредованного процесса трансформации незрелых зародышей кукурузы одной бинарной системой Т-ДНК. В данной системе применяли штамм Agrobacterium, в котором используется один бинарный плазмидный вектор с одной Т-ДНК. Конструкция Т-ДНК содержала три трансгенные кассеты для экспрессии кодирующих последовательностей токсина для насекомых, кодирующих Cry75Aa, Vip4Da2, и кодирующую последовательность дцРНК, кодирующую DvSnf7, и трансгенную кассету, применяемую для селекции трансформированных клеток кукурузы с использованием селекции глифосата (СР4). Конструкция Т-ДНК представляет собой SEQ ID NO:13 и проиллюстрирована на фиг. 2 («Т-ДНК перед вставкой»). В ходе вставки один нуклеотид был изменен с гуанина (G) на треонин (Т) в положении нуклеотида (нт) 5300 в SEQ ID NO: 13 (нт 4986 в SEQ ID NO:9 и нт 6059 в SEQ ID NO:10) в области, которая не находится в пределах любой кодирующей последовательности или элементов экспрессии. Кроме того, в ходе вставки шесть (6) нуклеотидов были вставлены между вставленными Т-ДНК и 3' геномной фланкирующей ДНК и семьсот сорок шесть (746) нуклеотидов были удалены из геномной ДНК дикого типа. Кассета для селекции глифосата была фланкирована с обеих сторон сайтами распознавания LoxP, которые распознаются Сге-рекомбиназой, полученной из фага Enterobacteria PI (Larry Gilbertson (2003) Cre-lox recombination: Cre-active tools for plant biotechnology. TRENDS in Biotechnology, 21:12, 550-555).

[0062] Как конкретно описано в данном документе, объект кукурузы MON95275 был получен в результате сложного процесса исследований и разработок, в котором: (1) более ста шестидесяти (160) плазмидных векторных конструкций, которые различались в отношении кодирующих последовательностей для инсектицидных белков, кодирующих последовательностей для элементов регуляции транскрипции, а также количества и ориентации кассет в конструкциях, были разработаны и трансформированы в клетки кукурузы для создания тысяч объектов, которые были протестированы и проанализированы, что привело к выбору конструкта, используемого для создания объекта MON95275; (2) тысячи клеток кукурузы трансформировали конструктом, используемым для получения объекта MON95275, создавая популяцию трансгенных растений, в которой каждое растение содержало уникальный трансгенный объект, который регенерировали и тестировали; (3) окончательный объект MON95275 был выбран после тщательного многолетнего процесса отбора объектов, включающего тестирование и анализ молекулярных характеристик, эффективности, экспрессии белка и агрономических свойств в различных генетических условиях; и (4) кассета селекции глифосата в объекте кукурузы MON95275 была удалена посредством Cre-удаления in vivo для создания «безмаркерного» конечного объекта MON95275. Объект кукурузы MON95275 был получен таким образом и выбран в качестве уникально улучшенного объекта, пригодного для широкомасштабных агрономических целей.

[0063] Плазмидная ДНК, встроенная в геном объекта кукурузы MON95275, была охарактеризована посредством детального молекулярного анализа. Данный анализ включал следующее: номер вставки (количество сайтов интеграции в геноме кукурузы), расположение геномной вставки (конкретный сайт в геноме кукурузы, где произошла вставка), номер копии (количество копий Т-ДНК в пределах одного локуса) и целостность вставленной трансгенной ДНК. Подробный молекулярный анализ показал, что вставленная Т-ДНК, содержащая кассеты для экспрессии Сгу75Аа1, Vip4Da2 и DvSnf7, оставалась интактной после вставки и Cre-вырезания глифосатной (СР4) кассеты для селекции. В контексте данного документа «кассета для экспрессии» или «кассета» представляет собой молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую комбинацию отдельных элементов, которые подлежат экспресии трансформированной клеткой. В таблице 1 показан список элементов, содержащийся в SEQ ID N0:10, последовательности ДНК, соответствующей объекту кукурузы MON95275.

[0064] Объект кукурузы MON95275 характеризуется вставкой водин локус в геноме кукурузы, приводящей к двум новым локусам или соединительным последовательностям (например, последовательностям, представленным в SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8) между вставленной ДНК и ДНК генома кукурузы, которые, как известно, естественным образом не появляются в геноме кукурузы или других объектах трансгенной кукурузы - они уникальны для объекта MON95275. Эти соединительные последовательности полезны для обнаружения присутствия объекта MON95275 в клетках кукурузы, ткани кукурузы, семенах кукурузы и растениях кукурузы или продуктах из растений кукурузы, таких как товарные продукты из кукурузы. В данном документе описаны молекулярные ДНК-зонды и пары праймеров, которые были разработаны для использования при идентификации присутствия этих различных соединительных сегментов в биологических образцах, содержащих или предположительно содержащих клетки кукурузы, семена кукурузы, части растений кукурузы или ткани растений кукурузы, которые содержат объект MON95275.

[0065] Образец предназначен для обозначения композиции, которая представляет собой либо по существу чистую ДНК кукурузы, либо композицию, содержащую ДНК кукурузы. В любом случае образец является биологическим образцом, т.е. содержит биологические материалы, включая, помимо прочего, ДНК, полученную или производную прямо или косвенно из генома объекта кукурузы MON95275. «Прямо» относится к способности специалиста в данной области техники напрямую получать ДНК из генома кукурузы путем разрушения клеток кукурузы (или путем получения образцов кукурузы, содержащих разрушенные клетки кукурузы) и экспонирования геномной ДНК для целей обнаружения. «Опосредованно» относится к способности специалиста в данной области получить целевую или конкретную эталонную ДНК, т.е., новый и уникальный соединительный сегмент, описанный в данном документе как диагностический для обнаружения объекта MON95275 в конкретном образце, посредством способов, отличных от прямого разрушения клеток кукурузы или получения образца кукурузы, который содержит разрушенные клетки кукурузы. Такие опосредованные способы включают без ограничения амплификацию сегмента ДНК, который содержит последовательность ДНК, предназначенную для определенного зонда, предназначенного для связывания со специфичностью к целевой последовательности, или амплификацию сегмента ДНК, которой может быть измерен и охарактеризован, т.е., измерен посредством отделения от других сегментов ДНК посредством некоторой эффективной матрицы, такой как агарозный или акриламидный гель или тому подобное, или характеризующейся прямым анализом последовательности ампликонов, или клонированием ампликона в вектор и прямым секвенированием встроенного ампликона, присутствующего в таком векторе.

[0066] Подробный молекулярный анализ также показал, что объект MON95275 содержит одну вставку Т-ДНК с одной копией каждого из Cry75Aal, Vip4Da2 и DvSnf7 специфичных кассет экспрессии дцРНК. В объекте MON95275 не было идентифицировано каких-либо дополнительных элементов из трансформационной конструкции, кроме частей левой и правой крайних областей Agrobacteriiim tumefaciens, используемых для переноса трансгенной ДНК из трансформирующей плазмиды растения в геном кукурузы. Кроме того, была проведена тепловая амплификация с получением специфических ампликонов, диагностирующих наличие объекта MON95275 в образце, и анализ последовательности ДНК для определения произвольно назначенных геномных соединений 5' и 3'-вставок с растением, подтверждения организации элементов внутри вставки и определения полной последовательности ДНК встроенной трансгенной ДНК (SEQ ID NO:9). SEQ ID NO:11 представляет собой последовательность, представляющую собой последовательность геномной ДНК кукурузы 5' LH244 длиной в одну тысячу семьдесят три (1073) пары оснований (п.о.), фланкирующую встроенную последовательность Т-ДНК, представленную как SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:12 представляет собой последовательность, представляющую собой последовательность геномной ДНК кукурузы 3' LH244 длиной в одну тысячу сто шесть (1106) п. о., фланкирующую встроенную последовательность Т-ДНК, представленную как SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:7 представляет собой последовательность, представляющую собой последовательность геномной ДНК кукурузы 5' LH244 длиной в одну тысячу двести двадцать шесть (1226) пар оснований (п.о.), фланкирующую встроенную последовательность Т-ДНК, в комбинации с встроенной последовательностью Т-ДНК длиной в сто пятьдесят три (153) п. о., представленной как SEQ ID NO:9. SEQ ID NO: 8 представляет собой последовательность, представляющую собой встроенную последовательность Т-ДНК длиной в сто одну (101) п. о. с последовательностью геномной ДНК кукурузы 3' LH244 длиной в одну тысячу сто шесть (1106) п. о., фланкирующей встроенную последовательность Т-ДНК, представленную как SEQ ID NO:9. SEQ ID N0:10 соответствует объекту кукурузы MON95275 и содержит непрерывную последовательность (contig), включающую 5'-фланкирующую последовательность LH244, трансгенную вставку MON95275 и 3'-фланкирующую последовательность LH244, и, таким образом, содержит соединительные последовательности генома вставки к растению.

[0067] Если в данном документе не указано иное, термины следует понимать в соответствии с общепринятым использованием специалистами в соответствующей области. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно найти в Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5^е издание, Springer-Verlag: New York, 1991; и Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994, наряду с другими источниками, известными специалистам в данной области. В контексте данного документа термин «кукуруза» означает вид, принадлежащий роду Zea, предпочтительно Zea mays и включает все виды растений, которые можно скрещивать с растениями кукурузы, содержащими объект MON95275, включая дикие виды кукурузы, а также те растения, которые принадлежат роду Zea, которые позволяют размножаться между видами.

[0068] Предложены трансгенные растения, трансформированные конструкцией ДНК, содержащей кассеты для экспрессии, экспрессирующие токсичные количества инсектицидных белков Cry75Aa1 и Vip4Da2, и токсичные количества инсектицидной дцРНК, специфичные для подавления DvSnf7. Под токсичным количеством понимается эффективное количество, инсектицидное количество, инсектицидно-эффективное количество, подавляющее количество целевых насекомых, эффективное пестицидное количество, количество в рационе насекомых отряда жесткокрылых, обладающее инсектицидным действием, и другие подобные термины следует понимать в соответствии с общепринятым использованием специалистами в соответствующей области. Растения кукурузы, трансформированные в соответствии со способами и описанной в данном документе конструкцией ДНК, устойчивы к жесткокрылым насекомым-вредителям.

[0069] Трансгенное «растение» получают посредством трансформации клетки растения гетерологичной ДНК, т.е., конструкции полинуклеиновой кислоты, которая включает ряд представляющих интерес эффективных признаков, регенерацию растения в результате вставки трансгена в геном клетки растения и отбор конкретного растения, характеризующегося вставкой в определенное место генома, и количество эффективных свойств регенерированного трансгенного растения. Термин «объект» относится к ДНК из исходного трансформанта, включающей встроенную ДНК и фланкирующие геномные последовательности, непосредственно смежные со встроенной ДНК. Такая ДНК уникальна, и ожидается, что она будет передана потомству, получившему встроенную ДНК, включая представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания родительской линии, включающей встроенную ДНК (например, исходный трансформант и полученное от самоопыления потомство), и второй родительской линии, например, родительской линии, которая не содержит встроенную ДНК. Настоящее изобретение также относится к исходному трансформантному растению и потомству трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Такое потомство может быть получено в результате полового скрещивания между растениями, содержащими объект, и другим растением, в котором потомство включает гетерологичную ДНК. Даже после многократного обратного скрещивания с рекуррентным родителем объект присутствует в потомстве от скрещивания в том же месте хромосомы.

[0070] В контексте данного документа термин «рекомбинантный» относится к не встречающимся в природе ДНК, белку или организму, которые обычно не встречаются в природе и были созданы благодаря вмешательству человека. «Рекомбинантная молекула ДНК» представляет собой молекулу ДНК, содержащую комбинацию молекул ДНК, которые не могли бы встречаться вместе в природе и являются результатом вмешательства человека. Например, молекула ДНК, состоящая из комбинации по меньшей мере двух молекул ДНК, гетерологичных между собой, такая как молекула ДНК, содержащая трансген, и геномная ДНК растения, примыкающая к трансгену, представляет собой молекулу рекомбинантной ДНК.

[0071] Термины «ДНК» и «молекула ДНК», используемые в данном документе, относятся к молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Молекула ДНК может иметь геномное или синтетическое происхождение и, как правило, располагается от 5'-конца (выше) к 3'-концу (ниже). В контексте данного документа термин «последовательность ДНК» относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Условно ДНК последовательности по настоящему изобретению и ее фрагменты раскрываются со ссылкой только на одну цепь двухцепочечной комплементарной последовательности цепей ДНК. Подразумевается, что комплементарные последовательности последовательностей, представленных в данном документе (последовательность комплементарной цепи), также упоминаемые в данной области как обратная комплементарная последовательность, входит в объем данного изобретения и явно подразумевается, что она входит в объем заявленного предмета.

[0072] В контексте данного документа термин «фрагмент» относится к меньшей части целого. Например, фрагменты SEQ ID NO:10 будут включать последовательности, которые представляют собой по меньшей мере около 12 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 13 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 14 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 15 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 16 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 17 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 18 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 19 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 20 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 25 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 30 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 35 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 40 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 45 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 50 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 60 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 70 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 80 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере около 90 последовательных нуклеотидов, или по меньшей мере около 100 последовательных нуклеотидов полной последовательности SEQ ID NO:10.

[0073] Ссылка в этой заявке на «выделенную молекулу ДНК» или эквивалентный термин или фразу предназначена для обозначения того, что молекула ДНК представляет собой молекулу, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не в своем природном окружении. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, последовательность терминации транскрипции и т.п., которые природным образом присутствуют в ДНК генома организма, не считаются «выделенными» при условии, что элемент находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природных условиях. Однако каждый из этих элементов и подчасти этих элементов будут «выделены» в рамках настоящего раскрытия, если элемент не находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природных условиях. Подобным образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет выделенной нуклеотидной последовательностью, если эта нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, из которой в природе обнаружена последовательность, кодирующая белок. Синтезированная нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность встречающегося в природе инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей данного изобретения. Для целей настоящего раскрытия любая трансгенная нуклеотидная последовательность, т.е. нуклеотидная последовательность ДНК, встроенная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, будет считаться выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или аналогичной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии. В любом случае выделенная молекула ДНК представляет собой химическую молекулу, независимо от того, называется ли она нуклеиновой кислотой, последовательностью нуклеиновой кислоты, последовательностью полинуклеотида, конструкцией, кассетой и т.п. Это новая молекула по настоящему изобретению, которая демонстрирует промышленную применимость, если присутствует в клетке растения или в геноме растения, и если присутствует вне клетки растения, и, следовательно, проявляет и предназначена для проявления такой полезности независимо от того, где расположена молекула.

[0074] Последовательность ДНК области, охватывающей соединение фосфодиэфирной связью одного конца трансгенной вставки с фланкирующей геномной ДНК кукурузы, называется «соединением». Соединение представляет собой точку соединения трансгенной вставки и фланкирующей ДНК как одной непрерывной молекулы. Одно соединение находится на 5'-конце трансгенной вставки, а другое - на 3'-конце трансгенной вставки, обозначаемых в данном документе как 5'- и 3'-соединение, соответственно. «Последовательность соединения» относится к последовательности ДНК любой длины, который охватывает 5'- или 3'-соединение объекта. Последовательности соединения объекта кукурузы MON95275 очевидны специалисту в данной области с использованием SEQ ID N0:10. Примеры последовательностей соединения MON95275 представлены в виде SEQ ID NO:1-8. На фиг. 1 проиллюстрировано физическое расположение последовательностей соединения, расположенных от 5' до 3', относительно SEQ ID NO:10. Место соединения последовательности MON95275 может присутствовать как часть генома растения, семени или клетки, содержащей MON95275. Идентификация любого одного или более соединений последовательно в образце, содержащем ДНК из растения кукурузы, части растения кукурузы, семени кукурузы или клетки кукурузы, указывает на то, что ДНК была получена из кукурузы, содержащей объект MON95275, и является диагностическим признаком присутствия объекта кукурузы MON95275.

[0075] Последовательности соединения для MON95275 могут быть представлены последовательностью из группы, включающей SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:10. Например, последовательности соединения могут быть условно представлены нуклеотидными последовательностями, представленными в виде SEQ ID NO:l (последовательность соединения 5') и SEQ ID NO:2 (последовательность соединения 3'). В качестве альтернативы, последовательности соединения могут быть условно представлены нуклеотидными последовательностями, представленными в виде SEQ ID NO:3 (последовательность соединения 5') и SEQ ID NO:4 (последовательность соединения 3'). В качестве альтернативы, последовательности соединения могут быть условно представлены нуклеотидными последовательностями, представленными в виде SEQ ID NO:5 (последовательность соединения 5') и SEQ ID NO:6 (последовательность соединения 3'). В качестве альтернативы, последовательности соединения могут быть условно представлены нуклеотидными последовательностями, представленными в виде SEQ ID NO:7 (последовательность соединения 5') и SEQ ID NO:8 (последовательность соединения 3'). Данные нуклеотидные последовательности соединены посредством фосфодиэфирной связи, и в объект кукурузы MON95275 представлены в виде части клеточного генома рекомбинантного растения.

[0076] Данные последовательности соединения являются диагностическими в отношении наличия объекта MON95275, или конструкции, включенной в него. Таким образом, идентификация одной или более из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:10 в образце, полученном из растения кукурузы, семени кукурузы или части растения кукурузы, является диагностическим, что ДНК была получена из объекта кукурузы MON95275. Таким образом, в настоящем изобретении представлена молекула ДНК, которая содержит по меньшей мере одну из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Любой сегмент ДНК, полученный из трансгенного объекта кукурузы MON95275, который достаточен для включения по меньшей мере одной из последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, входит в объем данного изобретения. Кроме того, любой полинуклеотид, содержащий последовательность, комплементарную любой из последовательностей, описанных в данном параграфе, входит в объем данного изобретения.

[0077] В настоящем изобретении представлены иллюстративные молекулы ДНК, которые можно применять либо в качестве праймеров, либо зондов для обнаружения наличия ДНК, полученной из растения кукурузы, содержащего объект MON95275 ДНК в образце. Такие праймеры или зонды специфичны для целевой последовательности нуклеиновой кислоты и, соответственно, пригодны для идентификации последовательности нуклеиновой кислоты объекта кукурузы MON95275 посредством способов по настоящему изобретению, описанных в данном документе.

[0078] Использование слова «производный» подразумевает, что конкретная молекула ДНК находится в геноме растения кукурузы или может быть обнаружена в ДНК растения кукурузы. «Возможность обнаружения» относится к способности конкретного сегмента ДНК к амплификации и его размеру или последовательности, охарактеризованному или выясненному посредством анализа последовательности ДНК, т.е., к целевому сегменту ДНК, и последующей способности обнаруживать связывание зонда с мишенью. Конкретный сегмент ДНК или целевой сегмент ДНК по настоящему изобретению присутствует в кукурузе, которая содержит вставленный объект MON95275.

[0079] «Зонд» представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную (обратно комплементарную) цепи целевой нуклеиновой кислоты и используемую в способах гибридизации. Зонд может быть присоединен к обычной обнаруживаемой метке или репортерной молекуле, например, радиоактивному изотопу, лиганду, хемилюминесцентному агенту или ферменту. Такой зонд является комплементарным к цепи целевой нуклеиновой кислоты и, в случае данного изобретения, к цепи ДНК из MON95275, будь то из растения, содержащего MON95275, или из образца, который включает ДНК MON95275. Таким образом, зонды для использования в данном документе могут содержать молекулы ДНК или сегменты полинуклеотидов достаточной длины для функционирования в строгих условиях гибридизации, как определено в данном документе, для связывания с конкретным уникальным сегментом ДНК, присутствующим внутри и диагностическим для объекта MON95275 в образце. Такой зонд может быть предназначен для связывания только с одним соединением или другой новой последовательностью, присутствующей только в объекте кукурузы MON95275, или с двумя или более такими сегментами одиночного соединения. Зонды по настоящему изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы зондов, которые специфически связываются с целевой последовательностью ДНК, и могут быть использованы для обнаружения присутствия данной целевой последовательности ДНК. Иллюстративная последовательность ДНК, пригодная в качестве зонда для обнаружения объекта кукурузы MON95275, представлена в виде SEQ ID NO: 17 (РВ10263).

[0080] «Праймер» обычно представляет собой молекулу ДНК, предназначенную для использования в определенных способах отжига или гибридизации, включающих тепловую амплификацию. Праймеры могут содержать пары различных сегментов олигонуклеотидов или полинуклеотидов для использования в реакции термической амплификации, которая амплифицирует конкретный целевой сегмент ДНК. Каждый праймер в паре предназначен для связывания с довольно специфическим сегментом ДНК внутри или рядом с сегментом ДНК, представляющим интерес для амплификации. Праймеры связываются таким образом, что затем они действуют в качестве локальных областей полимеризации последовательности нуклеиновой кислоты, что приводит к продукции одного или более ампликонов (амплифицированных целевых сегментов ДНК). Ампликон, полученный в результате такой реакции, будет иметь последовательность ДНК, соответствующую последовательности матричной ДНК, расположенной между двумя сайтами, где праймеры гибридизуются с матрицей. В определенных вариантах осуществления использование праймеров, предназначенных для связывания с уникальными сегментами объекта кукурузы MON95275 и которые амплифицируют определенные ампликоны, содержащие одно или более последовательностей соединения, описанных в данном документе, и обнаружение и/или характеристика таких ампликонов после завершения или прекращения полимеразной реакции является диагностическим для наличия объекта кукурузы MON95275 в конкретном образце. Квалифицированный специалист хорошо знаком с данным способом амплификации, и нет необходимости перечислять особенности амплификации в данном документе.

[0081] Праймер обычно предназначен для гибридизации с комплементарной целевой цепью ДНК с образованием гибрида между праймером и целевой цепью ДНК, и присутствие праймера является точкой распознавания полимеразой для начала удлинения праймера (т.е., полимеризации дополнительных нуклеотидов в удлиняющуюся молекулу нуклеотида) с использованием в качестве матрицы целевой цепи ДНК. Пары праймеров относятся к использованию двух праймеров, связывающих противоположные нити двухцепочечного нуклеотидного сегмента с целью линейной амплификации полинуклеотидного сегмента между позициями, предназначенными для связывания отдельными членами пары праймеров, обычно в реакции термической амплификации или других обычных способах амплификации нуклеиновых кислот. Иллюстративные молекулы ДНК, подходящие в качестве праймеров, представлены в виде SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22.

[0082] Пара праймеров SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16 применима в качестве первой молекулы ДНК и второй молекулы ДНК, которая отличается от первой молекулы ДНК, и каждая из них имеет достаточную длину непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO:10 для функционирования в качестве праймеров ДНК, которые при совместном использовании в реакции термической амплификации с матричной ДНК, полученной из объекта кукурузы MON95275, применимы для получения ампликона, диагностического для ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце. Пара праймеров SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19 используются в качестве первой молекулы ДНК и второй молекулы ДНК, которая отличается от первой молекулы ДНК, и каждая из них имеет достаточную длину смежных нуклеотидов локуса в пределах генома кукурузы для функционирования в качестве праймеров ДНК, которые при совместном использовании в реакции термической амплификации с матричной ДНК, полученной из объекта кукурузы MON95275, дают ампликон, который служит внутренним контролем как для диагностики объекта кукурузы MON95275, так и для зиготности ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце. Пара праймеров SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22 используются в качестве первой молекулы ДНК и второй молекулы ДНК, которая отличается от первой молекулы ДНК, и каждая из них имеет достаточную длину смежных нуклеотидов локуса в пределах генома кукурузы для работы в качестве праймеров ДНК, которые при совместном использовании в реакции термической амплификации с матричной ДНК, полученной из объекта кукурузы MON95275, дают ампликон, диагностический для невстроенной геномной ДНК кукурузы дикого типа, не содержащей объект MON95275.

[0083] Зонды ДНК и праймеры ДНК обычно имеют длину одиннадцать (11) полинуклеотидов или более, часто восемнадцать (18) полинуклеотидов или более, двадцать четыре (24) полинуклеотида или более или тридцать (30) полинуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры выбирают таким образом, чтобы они имели достаточную длину для специфической гибридизации с целевой последовательностью в строгих условиях гибридизации. Предпочтительно, зонды и праймеры по настоящему изобретению имеют полное сходство последовательности с целевой последовательностью, несмотря на то, что зонды, отличающиеся от целевой последовательности, которые сохраняют способность гибридизоваться с целевой последовательностью, могут быть сконструированы обычными способами.

[0084] Зонды нуклеиновых кислот и праймеры по настоящему изобретению гибридизуются в строгих условиях с целевой молекулой ДНК. Любой обычный способ гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот можно использовать для идентификации присутствия ДНК трансгенного растения в образце. Молекулы полинуклеиновых кислот, также называемые сегментами нуклеиновых кислот или их фрагментами, при определенных обстоятельствах способны специфически гибридизоваться с другими молекулами нуклеиновых кислот.

[0085] В контексте данного документа указано, что две молекулы полинуклеиновой кислоты способны специфически гибридизоваться между собой, если данные две молекулы способны образовывать антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Указано, что молекула нуклеиновой кислоты является «дополнением» другой молекулы нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. В контексте данного документа указано, что молекулы проявляют «полную комплементарность», если каждый нуклеотид одной из молекул является комплементарным нуклеотиду другой. Две молекулы называются «минимально комплементарными», если они могут гибридизоваться между собой с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться отожженными между собой по меньшей мере в обычных условиях «низкой строгости». Подобным образом молекулы называются «комплементарными», если они могут гибридизоваться между собой с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться отожженными между собой в обычных условиях «высокой строгости». Обычные условия строгости описаны в Sambrook et al, 1989, и в Hames et al, в Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Таким образом, отклонения от полной комплементарности допустимы, пока такие отклонения не исключают полностью способность молекул образовывать двухцепочечную структуру. Для того, чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила праймером или зондом, она должна быть достаточно комплементарной по последовательности, чтобы быть способной образовывать стабильную двухцепочечную структуру при конкретных используемых концентрациях растворителя и соли.

[0086] Используемый в данном документе термин «по существу гомологичная последовательность» представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая будет специфически гибридизоваться с комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, с которым ее сравнивают, в условиях высокой строгости. Соответствующие строгие условия, способствующие гибридизации ДНК, например, 6,0-кратный раствор хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) при температуре около 45°С с последующей промывкой 2,0-кратным раствором SSC при 50°С, известны специалистам в данной области, или их можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Например, концентрация соли на стадии промывки может быть выбрана от низкой жесткости около 2,0×SSC при 50°С до высокой жесткости около 0,2×SSC при 50°С. Кроме того, температура на стадии промывки может быть повышена от условий низкой строгости при комнатной температуре, около 22°С, до условий высокой строгости при температуре около 65°С. Можно варьировать как температуру, так и концентрацию соль, или температуру или концентрацию соли можно поддерживать постоянными, в то время как другая переменная изменяется. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеиновая кислота по настоящему изобретению будет специфически гибридизоваться с одной или более молекулами нуклеиновой кислоты, указанными в SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, или их дополнениями или фрагментами в умеренно строгих условиях, например, при температуре около 2,0 х SSC и около 65°С. В особенно предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению будет специфически гибридизоваться с одной или более молекулами нуклеиновой кислоты, указанными в SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, или дополнениями или фрагментами любой из них в условиях высокой строгости. В одном аспекте данного изобретения молекула предпочтительной маркерной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO:l, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8, или SEQ ID NO:9, или SEQ ID NO:10, или их комплементы, или фрагменты любой из них. Гибридизация зонда с целевой молекулой ДНК может быть обнаружена любым количеством способов, известных специалистам в данной области, при этом они могут включать без ограничения флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки на основе антител и хемилюминесцентные метки.

[0087] Что касается амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты (например, посредством ПЦР) с использованием определенной пары праймеров для амплификации, «строгими условиями» являются условия, которые позволяют паре праймеров гибридизоваться только с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, к которой применяется праймер, имеющий соответствующие последовательности дикого типа (или его комплемент) будет связываться и происходить с образованием уникального продукта амплификации, ампликона, в реакции термической амплификации ДНК.

[0088] Термин «специфический для (целевой последовательности)» указывает, что зонд или праймер гибридизуется в строгих условиях гибридизации только с целевой последовательностью в образце, содержащем целевую последовательность.

[0089] В контексте данного документа термин «амплифицированная ДНК» или «ампликон» относится к продукту способа амплификации полинуклеиновой кислоты, направленного на целевую молекулу полинуклеиновой кислоты, которая является частью матрицы полинуклеиновой кислоты. Например, для определения того, содержит ли растение кукурузы, полученное в результате полового скрещивания, геномную ДНК трансгенного растения кукурузы, содержащего объект MON95275 по настоящему изобретению, ДНК, которая экстрагируется из образца ткани растения кукурузы, может быть подвергнута способу амплификации полинуклеиновой кислоты с использованием пары праймеров, которая включает первый праймер, полученный из последовательности геномной ДНК в области, фланкирующей гетерологичную вставленную ДНК объекта MON95275, и удлинена полимеразой от 5' до 3' в направлении вставленной ДНК. Второй праймер получен из гетерологичной вставленной молекулы ДНК, удлиненной полимеразой от 5' до 3' в направлении фланкирующей геномной ДНК, из которой получен первый праймер. Длина ампликона может варьировать от общей длины пары праймеров плюс одна пара нуклеотидных оснований, или плюс около пятидесяти пар нуклеотидных оснований, или плюс около двухсот пятидесяти пар нуклеотидных оснований, или плюс около четырехсот пятидесяти пар нуклеотидных оснований, или более. В качестве альтернативы, пара праймеров может быть получена из геномной последовательности с обеих сторон вставленной гетерологичной ДНК для получения ампликона, включающего всю вставку полинуклеотидной последовательности (например, прямой праймер, выделенный из геномной части на 5'-конце SEQ ID NO:10, и обратный праймер, выделенный из геномной части на 3'-конце SEQ ID NO:10, который амплифицирует молекулу ДНК, содержащую вставленную последовательность ДНК (SEQ ID NO:9), идентифицированную в данном документе в геноме объекта MON95275.). Член пары праймеров, полученной из геномной последовательности растения, примыкающей к вставленной трансгенной ДНК, расположен на расстоянии от вставленной последовательности ДНК, данное расстояние может варьировать от одной пары нуклеотидных оснований до около двадцати тысяч пар нуклеотидных оснований. Использование термина «ампликон» специально исключает димеры праймеров, которые могут образовываться в реакции термической амплификации ДНК.

[0090] Для практических целей следует разработать праймеры, которые производят ампликоны ограниченного диапазона размеров, например, от 100 до 1000 оснований. Ампликоны меньшего размера (с меньшей длиной полинуклеотида), как правило, более надежно продуцируются в реакциях термической амплификации, допускают более короткое время цикла и могут быть легко разделены и визуализированы на агарозных гелях или адаптированы для использования в анализах, подобных TAQMAN®. Ампликоны меньшего размера могут быть получены и обнаружены посредством способов, известных в области обнаружения ДНК-ампликонов. Кроме того, ампликоны, полученные с использованием пар праймеров, могут быть клонированы в векторы, размножены, выделены, и секвенированы или могут быть секвенированы непосредственно с использованием способов, хорошо зарекомендовавших себя в данной области. Любая пара праймеров, полученная из комбинации SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:9 или комбинации SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:9, которые применимы в способе амплификации ДНК для получения ампликона, диагностического для MON95275 или его потомства, являются аспектом данного изобретения. Любая отдельная выделенная молекула полинуклеотидного праймера ДНК, содержащая менее 15 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO:11 или ее комплемент, который может быть использован в способе амплификации ДНК для получения ампликона, диагностического для MON95275 или ее потомства, является аспектом данного изобретения. Любая отдельная выделенная молекула полинуклеотидного праймера ДНК, содержащая менее 15 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO:12 или ее комплемент, который может быть использован в способе амплификации ДНК для получения ампликона, диагностического для растений, содержащих MON95275, или их потомства, является аспектом данного изобретения. Любая отдельная выделенная молекула полинуклеотидного праймера ДНК, содержащая менее 15 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO:9 или ее комплемент, который может быть использован в способе амплификации ДНК для получения ампликона, диагностического для MON95275 или ее потомства, является аспектом данного изобретения.

[0091] Амплификацию полинуклеиновых кислот можно осуществить посредством любого из различных способов амплификации полинуклеиновых кислот, известных в данной области, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Способы амплификации известны в данной области и описаны, inter alia, в Патентах США №№4683195 и 4683202 и в PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al, Academic Press, San Diego, 1990. Способы амплификации ПЦР были разработаны для амплификации до 22 kb (килобаз) геномной ДНК и до 42 kb ДНК бактериофага (Cheng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). Данные способы, а также другие способы, известные в области амплификации ДНК, можно использовать в практике данного изобретения. Последовательность вставки гетерологичной ДНК или фланкирующей геномной последовательности ДНК из объектов кукурузы MON95275 можно проверить (и при необходимости скорректировать) посредством амплификации таких молекул ДНК из семян кукурузы, содержащих ДНК объекта MON95275, или растений кукурузы, выращенных из семян кукурузы, содержащих ДНК объекта MON95275, депонированную с АТСС, имеющей регистрационный номер РТА-126049, с использованием праймеров, полученных из последовательности, представленной в данном документе, с последующим стандартным секвенированием ДНК ампликона ПЦР или фрагментов его клонированной ДНК.

[0092] Диагностический ампликон, полученный посредством данных способов, может быть обнаружен с использованием множества способов. Одним из таких способов является генетический битовый анализ (Nikiforov et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994), в котором олигонуклеотид ДНК сконструирован таким образом, что он перекрывает как соседние фланкирующие геномные последовательности ДНК, так и вставленные последовательности ДНК. Олигонуклеотид иммобилизуют в лунках титрационного микропланшета. После ПЦР представляющей интерес области (с использованием одного праймера во вставленной последовательности и одного в соседней фланкирующей геномной последовательности) продукт одноцепочечной ПЦР может быть гибридизован с иммобилизованным олигонуклеотидом и служить матрицей для реакции удлинения одного основания с использованием ДНК-полимеразы и меченных дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ddNTP), специфичных к ожидаемому следующему основанию. Считывание может быть флуоресцентным или основанным на ELISA. Сигнал указывает на наличие трансгенной/геномной последовательности вследствие успешной амплификации, гибридизации и удлинения по одному основанию.

[0093] Другим способом является способ пиросеквенирования, описанный в Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). В данном способе создается олигонуклеотид, который перекрывает соседний участок геномной ДНК и ДНК-вставки. Олигонуклеотид гибридизуется с продуктом одноцепочечной ПЦР из представляющей интерес области (один праймер во вставленной последовательности и один во фланкующей геномной последовательности) и его инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ, сульфурилазы, люциферазы, апиразы, аденозина 5' фосфосульфата и люциферина. DNTP добавляют индивидуально, и включение приводит к измеряемому световому сигналу. Световой сигнал указывает на наличие трансгенной/геномной последовательности вследствие успешной амплификации, гибридизации и удлинения с одним или более основаниями.

[0094] Поляризация флуоресценции, описанная в Chen, et al. (Genome Res. 9:492-498, 1999), представляет собой способ, который можно использовать для обнаружения ампликона по настоящему изобретению. Посредством данного способа создается олигонуклеотид, который перекрывает геномное фланкирующее и вставленное соединение ДНК. Олигонуклеотид гибридизуется с одноцепочечным продуктом ПЦР из представляющей интерес области (один праймер во встроенной ДНК и один во фланкирующей геномной последовательности ДНК) и его инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы и флуоресцентно-меченого ddNTP. Удлинение по одному основанию приводит к включению ddNTP. Включение можно измерить как изменение поляризации с использованием флуорометра. Изменение поляризации указывает на наличие трансгенной/геномной последовательности за счет успешной амплификации, гибридизации и удлинения по одному основанию.

[0095] Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР) представляет собой возможность следить за ходом ПЦР по мере ее возникновения (т.е., в режиме реального времени). Данные собирают на протяжении всего процесса ПЦР, а не в конце ПЦР. В ПЦР в реальном времени реакции характеризуются моментом времени во время цикла, когда впервые обнаруживается амплификация мишени, а не количеством мишени, накопленным после фиксированного числа циклов. В ПЦР в реальном времени положительную реакцию обнаруживают по накоплению флуоресцентного сигнала. Чем выше начальное число копий целевой нуклеиновой кислоты, тем раньше наблюдается значительное увеличение флуоресценции. Порог циклов (значение Ct) определяется как количество циклов, необходимое для того, чтобы флуоресцентный сигнал преодолел порог (т.е., превысил фоновый уровень). Уровни Ct обратно пропорциональны количеству целевой нуклеиновой кислоты в образце (т.е., чем ниже значение Ct, тем больше количество целевой нуклеиновой кислоты в образце).

[0096] Taqman® (РЕ Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния) описан как способ обнаружения и количественного определения наличия последовательности ДНК с использованием ПЦР в реальном времени и полностью понимается согласно инструкциям, предоставленным производителем. Вкратце, разработан олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывает геномное фланкирование и соединение вставки ДНК. Зонд FRET и праймеры для ПЦР (один праймер во вставке последовательности ДНК и один во вставке геномной последовательности) циклируют в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. Гибридизация зонда FRET приводит к отщеплению и высвобождению флуоресцентного фрагмента от гасящего фрагмента на зонде FRET. Флуоресцентный сигнал указывает на наличие трансгенной/геномной последовательности вследствие успешной амплификации и гибридизации.

[0097] Молекулярные маяки были описаны для использования в последовательности обнаружения, как описано в Tyangi et al. (Nature Biotech. 14:303-308, 1996). Вкратце, разработан олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывает соединение фланкирующей геномной ДНК и ДНК-вставки. Уникальная структура зонда FRET приводит к тому, что он содержит вторичную структуру, которая удерживает флуоресцентную и гасящую части в непосредственной близости. Зонд FRET и праймеры для ПЦР (один праймер во вставке последовательности ДНК и один во вставке геномной последовательности) циклируют в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. После успешной ПЦР-амплификации гибридизация FRET-зонда с целевой последовательностью приводит к удалению вторичной структуры зонда и пространственному разделению флуоресцентной и гасящей частей. В результате появляется флуоресцентный сигнал. Флуоресцентный сигнал указывает на наличие фланкирующей/трансгенной вставки последовательности вследствие успешной амплификации и гибридизации.

[0098] Наборы для обнаружения ДНК, основанные на способах амплификации ДНК, содержат молекулы ДНК-праймеров, которые специфически гибридизуются с ДНК-мишенью и амплифицируют диагностический ампликон в соответствующих условиях реакции. Набор может обеспечивать способ обнаружения на основе агарозного геля или любое количество способов обнаружения диагностического ампликона, известных в данной области. Наборы для обнаружения ДНК могут быть разработаны с использованием композиций, раскрытых в данном документе, и могут быть использованы для идентификации ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце и могут применяться в способах селекции растений кукурузы, содержащих ДНК объекта MON95275. Набор, содержащий ДНК-праймеры, гомологичные или комплементарные любой части геномной области кукурузы, как указано в SEQ ID N0:10, и любой части встроенной трансгенной ДНК, как указано в SEQ ID NO:10, является объектом данного изобретения. Молекулы ДНК могут быть использованы в способах амплификации ДНК (ПЦР) или в качестве зондов в способах гибридизации полинуклеиновых кислот, т.е., саузерн-анализе, нозерн-анализе.

[0099] Зонды и праймеры по настоящему изобретению могут иметь полную идентичность последовательности с целевой последовательностью, несмотря на то, что праймеры и зонды, отличающиеся от целевой последовательности, которые сохраняют способность гибридизоваться предпочтительно с целевой последовательностью, могут быть созданы посредством обычных способов. Для того, чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила праймером или зондом, она должна быть достаточно комплементарной по последовательности, чтобы быть способной образовывать стабильную двухцепочечную структуру при конкретных используемых концентрациях растворителя и соли. Для идентификации наличия трансгенной ДНК из объекта кукурузы MON95275 в образце можно использовать любой традиционный способ гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот.Зонды и праймеры обычно имеют длину по меньшей мере около 11 нуклеотидов, по меньшей мере около 18 нуклеотидов, по меньшей мере около 24 нуклеотидов или по меньшей мере около 30 нуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры специфически гибридизуются с целевой последовательностью ДНК в строгих условиях гибридизации. Обычные условия строгости описаны в Sambrook et al, 1989, и в Hames et al, в Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).

[0100] Любое количество способов, хорошо известных специалистам в данной области, может быть использовано для выделения и манипулирования молекулой ДНК или ее фрагментом, раскрытыми в настоящем изобретении, включая способы термической амплификации. Молекулы ДНК или их фрагменты также можно получить с использованием других способов, таких как прямой синтез фрагмента химическими средствами, как это обычно практикуется с использованием автоматического синтезатора олигонуклеотидов.

[0101] Таким образом, представленные в данном документе молекулы ДНК и соответствующие нуклеотиды последовательности полезны, среди прочего, для идентификации объекта кукурузы MON95275, обнаружения присутствия ДНК, полученной из трансгенного объекта кукурузы MON95275, в образце, а также для мониторинга образцов в отношении наличия и/или отсутствия объекта кукурузы MON95275 или части растений, полученных из растений кукурузы, содержащих объект MON95275.

[0102] В отношении кукурузы подразумевается, что ростки кукурузы, клетки растений кукурузы, семена кукурузы, части растений кукурузы, растения-потомки кукурузы и товарные продукты кукурузы входят в объем данного изобретения, при условии, что каждый вариант осуществления содержит поддающееся обнаружению количество ДНК, соответствующее любому одному, двум или более сегментам, описанным в данном документе как диагностические в отношении наличия объекта кукурузы MON95275 (например, такое как полинуклеотид, имеющий по меньшей мере одну из последовательностей, представленных как SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10). Растения кукурузы, клетки растений, семена, части растений и потомство растений по настоящему изобретению также могут содержать один или более дополнительных трансгенов. Такой дополнительный трансген может представлять собой любой нуклеотид последовательности, кодирующий молекулу белка или РНК, придающую необходимый признак, включая без ограничения повышенную устойчивость к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную засухоустойчивость, повышенное качество семян и/или повышенную устойчивость к гербицидам.

[0103] Настоящее изобретение относится к растениям кукурузы, клеткам растений кукурузы, семенам кукурузы, частям растений кукурузы (таким как пыльца, семяпочка, рыльца, колос, пыльник, початок, ткань корня, ткань стебля, ткань листа, а также семена), потомкам растений кукурузы, полученным из трансгенного растения кукурузы, содержащего ДНК MON95275. Иллюстративный образец семян кукурузы, содержащий ДНК объекта MON95275, был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур (АТСС®). Репозиторий АТСС присвоил обозначение патентного депозита РТА-126049 семени, содержащему ДНК объекта MON95275.

[0104] Настоящее изобретение относится к микроорганизму, содержащему молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, и SEQ ID NO:10, присутствующую в его геноме. Предполагается, что микроорганизм включает любую микроскопическую клетку, будь то прокариотическая, эукариотическая или иная, которая содержит ДНК в геноме или хромосоме или внехромосомную структуру ДНК, чаще называемую плазмидой или вектором. К микроскопическим организмам относятся бактерии (прокариоты) и клетки, соответствующие высшим формам жизни (эукариотам), находящиеся ниже поля зрения среднего человека. Примером такого микроорганизма является трансгенная растительная клетка.

[0105] Микроорганизмы, такие как растительная клетка по настоящему изобретению, полезны во многих промышленных применениях, включая без ограничения следующее: (i) использование в качестве исследовательского инструмента для научных исследований или промышленных исследований; (ii) использование в культуре для получения эндогенных или рекомбинантных углеводов, липидов, нуклеиновых кислот или белковых продуктов, или малых молекул, которые могут быть использованы для последующих научных исследований или в качестве промышленных продуктов; и (iii) использование с современными способами культивирования тканей растений для получения трансгенных растений или культур тканей растений, которые затем могут быть использованы для сельскохозяйственных исследований или производства. При производстве и использовании микроорганизмов, таких как трансгенные клетки растений, используются современные микробиологические способы и вмешательство человека для получения искусственного уникального микроорганизма. В данном процессе рекомбинантная ДНК встраивается в геном клетки растения для создания трансгенной клетки растения, которая отличается и уникальна относительно встречающихся в природе клеток растения. Затем данную трансгенную растительную клетку можно культивировать так же, как клетки бактерий и дрожжей, используя современные способы микробиологии, и она может существовать в недифференцированном одноклеточном состоянии. Новый генетический состав и фенотип трансгенной растительной клетки представляет собой технический эффект, создаваемый интеграцией гетерологичной ДНК в геном клетки. Другим аспектом данного изобретения является способ использования микроорганизма по настоящему изобретению. Способы использования микроорганизмов по настоящему изобретению, таких как трансгенные клетки растений, включают (i) способы получения трансгенных клеток посредством интеграции рекомбинантной ДНК в геном клетки и последующего использования данной клетки для получения дополнительных клеток, обладающих такой же гетерологичной ДНК; (ii) способы культивирования клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, с использованием современных способов микробиологии; (iii) способы получения и очистки эндогенных или рекомбинантных углеводов, липидов, нуклеиновых кислот или белковых продуктов из культивируемых клеток; и (iv) способы использования современных методик культивирования тканей растений с трансгенными клетками растений для получения трансгенных растений или культур трансгенных тканей растений.

[0106] Растения по настоящему изобретению могут передавать потомству ДНК объекта MON95275, включая трансген, встроенный в объект кукурузы MON95275. В контексте данного документа «потомство» включает любое растение, клетку растения, семя и/или регенерируемую часть растения, содержащую ДНК объекта MON95275, полученную от растения-предка и/или содержащую молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Растения, потомство и семена могут быть гомозиготными или гетерозиготными по трансгену объекта MON95275. Потомство может быть выращено из семян растения, содержащего объект кукурузы MON95275, и/или из семян растения, оплодотворенного пыльцой растения, содержащего объект кукурузы MON95275.

[0107] Потомство растений может подвергаться самоопылению (также известному как «селфинг») для получения настоящей племенной линии растений, т.е. растений, гомозиготных по трансгену. Селфинг соответствующего потомства может давать растения, гомозиготные по обоим добавленным экзогенным генам.

[0108] В качестве альтернативы, растения-потомки могут подвергаться ауткроссированию, например, скрещиваться с другим неродственным растением для получения сортовых или гибридных семян или растений. Другое неродственное растение может быть трансгенным или нетранс генным. Таким образом, сортовые или гибридные семена или растения по настоящему изобретению могут быть получены посредством полового скрещивания первого родителя, в котором отсутствует специфическая и уникальная ДНК объекта кукурузы MON95275, со вторым родителем, содержащим объект кукурузы MON95275, в результате чего получают гибрид, содержащий специфическую и уникальную ДНК объекта кукурузы MON95275. Каждый предок может быть гибридом или инбредным/разновидным, при условии, что скрещивание или селекция обеспечивают растение или семя по настоящему изобретению, т.е. семя, содержащее по меньшей мере один аллель, содержащий ДНК объекта кукурузы MON95275 и/или молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Таким образом, два разных трансгенных растения могут быть скрещены для получения гибридного потомства, которое содержит два независимо сегрегирующих добавленных экзогенных гена. Например, MON95275, содержащая Cry75Aal, Vip4Da2 и DvSnf7, специфичную дцРНК, придающую устойчивость к насекомым кукурузе, можно скрещивать с другими трансгенными растениями кукурузы для получения растения, обладающего характеристиками обоих трансгенных предков. Одним из примеров этого может быть скрещивание MON95275, содержащей Cry75Aal, Vip4Da2 и DvSnf7, специфическую опосредованную супрессию гена дцРНК, придающую жесткокрылым устойчивость к кукурузе, с растением, имеющим один или более дополнительных признаков, таких как устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым или засухоустойчивость, в результате чего в потомстве или семенах растений, которые обладают устойчивостью к жесткокрылым насекомым-вредителям и имеют по меньшей мере один или более дополнительных признаков. Также предполагается обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссирование с нетрансгенным растением, как и вегетативное размножение. Описания других методов селекции, которые обычно используются для разных признаков и культур, можно найти в одной из нескольких ссылок, например, Fehr, в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

[0109] Растения, потомство, семена, клетки и части растений по настоящему изобретению могут также содержать один или более дополнительных признаков кукурузы или трансгенных объектов, в частности те, которые были введены посредством скрещивания растения кукурузы, содержащего объект кукурузы MON95275, с другим растением кукурузы, содержащим дополнительный признак(-и) или трансгенные объекты. Такие признаки или трансгенные объекты включают без ограничения повышенную устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную устойчивость к засухе, повышенное качество семян, улучшенное качество питания, производство гибридных семян или заболевания, или устойчивость к грибкам. Трансгенные объекты кукурузы известны специалистам в данной области. Например, список таких признаков предоставлен Службой инспекции здоровья животных и растений (APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA), и его можно найти на веб-сайте aphis.usda.gov во всемирной сети. Таким образом, два или более трансгенных объекта могут быть объединены в семя потомства или растение посредством скрещивания двух родительских растений, каждое из которых содержит один или более трансгенных объектов, сбора семени потомства и отбора семени потомства или растений, которые содержат два или более трансгенных объекта. Данные стадии могут повторяться до тех пор, пока не будет достигнута необходимая комбинация трансгенных объектов в потомстве. Также предполагается обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссирование с нетрансгенным растением и вегетативное размножение.

[0110] Также предоставляется часть растения, полученная из растений кукурузы, содержащая объект MON95275. В контексте данного документа термин «растительная часть» относится к любой части растения, состоящей из материала, полученного из растения кукурузы, содержащего объект MON95275. Части растений включают без ограничения семена, пыльцу, семязачатки, рыльца, колос, пыльник, початок, ткань корня, ткань стебля и ткань листа. Части растения могут быть жизнеспособными, нежизнеспособными, регенерируемыми и/или нерегенерируемыми.

[0111] Кроме того, предлагается товарный продукт, полученный из растений кукурузы, содержащий объект MON95275 и содержащий поддающееся обнаружению количество нуклеиновой кислоты, специфичной для объекта MON95275. В контексте данного документа термин «товарный продукт» относится к любой композиции или продукту, который состоит из материала, полученного из растения кукурузы, целых или обработанных семян кукурузы, или одной или более клеток растения и/или частей растения, содержащих ДНК объекта кукурузы MON95275. Нежизнеспособные товарные продукты включают без ограничения нежизнеспособные семена, целые или обработанные семена, части семян и части растений; корма для животных, включающие кукурузу, кукурузное масло, кукурузную муку, кукурузный крахмал, кукурузные хлопья, кукурузные отруби, макаронные изделия из кукурузы, кукурузную биомассу и топливные продукты, произведенные с использованием кукурузы и частей кукурузы. Жизнеспособные товарные продукты включают без ограничения семена, растения и растительные клетки. Таким образом, растения кукурузы, содержащие объект MON95275, можно использовать для производства любого товарного продукта, обычно получаемого из кукурузы. Любой такой товарный продукт, полученный из растений кукурузы, содержащих объект MON95275, может содержать по меньшей мере поддающееся обнаружению количество специфической и уникальной ДНК, соответствующей объекту кукурузы MON95275, и, в частности, может содержать поддающееся обнаружению количество полинуклеотидов, содержащих молекулу ДНК, имеющих по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Можно использовать любой стандартный метод обнаружения молекул нуклеотидов, включая раскрытые в данном документе способы обнаружения. Товарный продукт подпадает под действие данного изобретения, если в нем содержится какое-либо обнаруживаемое количество молекулы ДНК, имеющей по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 в товарном продукте.

[0112] Следовательно, растения кукурузы, клетки растений кукурузы, семена кукурузы, части растений кукурузы (такие как пыльца, семяпочка, рыльца, колос, пыльник, початок, ткань корня, ткань стебля, ткань листа), потомство растений кукурузы и товарные продукты по настоящему изобретению, полезны, помимо прочего, для выращивания растений с целью получения семян и/или частей растений, содержащих объект кукурузы MON95275, для сельскохозяйственных целей, получения потомства, содержащего объект кукурузы MON95275, для селекции растений, использования с микробиологическими методиками для промышленных и исследовательских целей и продажа потребителям.

[0113] Предложены способы получения устойчивого к насекомым растения кукурузы, содержащего ДНК, специфичную и уникальную для объекта MON95275 по настоящему изобретению. Трансгенные растения, используемые в данных способах, могут быть гомозиготными или гетерозиготными по трансгену. Потомство растений, полученное посредством данных способов, может быть сортовым или гибридным растением; может быть выращен из семян растения, содержащего объект кукурузы MON95275, и/или из семян растения, оплодотворенного пыльцой растения, содержащего объект кукурузы MON95275; и могут быть гомозиготными или гетерозиготными по трансгену. Потомство растений может быть впоследствии самоопылено для получения истинной селекционной линии растений, т.е. растений, гомозиготных по трансгену, или, в качестве альтернативы, может быть проведено ауткроссирование, например, скрещивание с другим неродственным растением для получения сортовых или гибридных семян или растений.

[0114] Предложены способы обнаружения ДНК, полученной из клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы, содержащих объект кукурузы MON95275, в образце. Один способ включает (i) экстракцию образца ДНК по меньшей мере из одной клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы; (ii) приведение образца ДНК в контакт по меньшей мере с одним праймером, способным продуцировать последовательность ДНК, специфичной для ДНК объекта MON95275, в условиях, подходящих для секвенирования ДНК; (iii) проведение реакции секвенирования ДНК; а затем (iv) подтверждение того, что нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, характерную для объекта MON95275, содержащейся в нем конструкции, такой как выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Другой способ включает (i) экстракцию образца ДНК из менее чем одной клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы; (ii) приведение образца ДНК в контакт с парой праймеров, которая способна продуцировать ампликон из ДНК объекта MON95275 в условиях, подходящих для амплификации ДНК; (iii) проведение реакции амплификации ДНК; а затем (iv) обнаружение молекулы ампликона и/или подтверждение того, что нуклеотидная последовательность ампликона содержит нуклеотидную последовательность, специфичную для объекта MON95275, например, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6. Ампликон должен быть специфичным для объекта MON95275, например, ампликон, содержащий SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6. Обнаружение в ампликоне нуклеотидной последовательности, специфичной для объекта кукурузы MON95275, является определяющим и/или диагностическим признаком наличия в образце ДНК, специфичной для объекта кукурузы MON95275. Пример пары праймеров, которая способна продуцировать ампликон из ДНК объекта MON95275 в условиях, подходящих для амплификации ДНК, представлен как SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16. Другие пары праймеров могут быть легко сконструированы специалистом в данной области и будут давать ампликон, содержащий SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6, причем такая пара праймеров содержит по меньшей мере один праймер в геномной области, фланкирующий вставку, и второй праймер во вставке. Другой способ обнаружения ДНК, полученной из клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы, содержащего объект кукурузы MON95275, в образце включает (i) экстракцию образца ДНК из менее чем одной клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы; (ii) взаимодействие образца ДНК с ДНК-зондом, специфичным для ДНК объекта MON95275; (iii) возможность гибридизации зонда и образца ДНК в строгих условиях гибридизации; а затем (iv) обнаружение гибридизации между зондом и образцом ДНК-мишени. Пример последовательности ДНК-зонда, специфичного для объекта MON95275, представлен как SEQ ID NO:17. Другие зонды могут быть легко сконструированы специалистом в данной области, и они будут содержать по меньшей мере один фрагмент геномной ДНК, фланкирующий вставку, и по меньшей мере один фрагмент ДНК-вставки, такой как последовательность, описанная в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:10. Обнаружение гибридизации зонда с образцом ДНК является диагностическим признаком наличия в образце ДНК, специфичной для объекта кукурузы MON95275. Отсутствие гибридизации в качестве альтернативы является диагностическим признаком отсутствия в образце ДНК, специфической для объекта кукурузы MON95275.

[0115] Представлены наборы для обнаружения ДНК, которые полезны для идентификации ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце, а также могут применяться для способов селекции растений кукурузы, содержащих соответствующую ДНК объекта. Такие наборы содержат ДНК-праймеры и/или зонды, включающие фрагменты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Один пример такого набора содержит по меньшей мере одну молекулу ДНК достаточной длины из непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO:10, которая функционирует в качестве ДНК-зонда, пригодного для обнаружения наличия и/или отсутствия ДНК, полученной из трансгенных растений кукурузы, содержащих объект MON95275 в образце. ДНК, полученная из трансгенных растений кукурузы, содержащих объект MON95275, будет состоять из молекулы ДНК, имеющей по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Представлена молекула ДНК, достаточная для использования в качестве ДНК-зонда, которая полезна для определения, обнаружения или диагностики присутствия и/или отсутствия ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце, представленная как SEQ ID NO:17. Другие зонды могут быть легко разработаны специалистом в данной области и должны включать по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по меньшей мере 35, по меньшей мере 36, по меньшей мере 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39, или по меньшей мере 40 последовательных нуклеотидов SEQ ID NO:10 и быть достаточно уникальными для ДНК объекта кукурузы MON95275 для идентификации ДНК, полученной из объекта.

[0116] Другой тип набора содержит пару праймеров, пригодных для получения ампликона, пригодного для обнаружения присутствия и/или отсутствия ДНК, полученной из трансгенного объекта кукурузы MON95275, в образце. В таком наборе можно применять способ, включающий приведение образца целевой ДНК в контакт с парой праймеров, как описано в данном документе, затем проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, достаточной для получения ампликона, содержащего молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, а затем определение присутствия и/или отсутствие ампликона. Такой способ может также включать секвенирование ампликона или его фрагмента, что будет определяющим, т.е. диагностическим, для наличия специфической ДНК объекта кукурузы MON95275 в образце целевой ДНК. Другие пары праймеров могут быть легко разработаны специалистом в данной области и должны включать по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, или по меньшей мере 30 последовательных нуклеотидов последовательности, представленной без ограничения в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, и быть достаточно уникальными для ДНК объекта кукурузы MON95275 для идентификации ДНК, полученной из объекта.

[0117] Наборы и способы детекции по настоящему изобретению полезны, среди прочего, для идентификации объекта кукурузы MON95275, отбора сортов или гибридов растений, содержащих объект кукурузы MON95275, обнаружения присутствия ДНК, полученной из трансгенного растения кукурузы, содержащего объект MON95275, в образце, и контрольные образцы на присутствие и/или отсутствие растений кукурузы, содержащих объект MON95275, или частей растений, полученных из растений кукурузы, содержащих объект MON95275.

[0118] Последовательности вставки гетерологичной ДНК, последовательности, соединения или фланкирующие последовательности от объекта кукурузы MON95275 можно проверить (и при необходимости скорректировать) посредством амплификации такой последовательности от объекта с использованием праймеров, полученных из последовательности, представленной в данном документе, с последующим стандартным секвенированием ДНК ампликона или клонированной ДНК.

[0119] Предложены способы определения зиготности трансгенного аллеля ДНК, полученного из клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы, содержащего объект кукурузы MON95275, в образце. Один способ включает (i) экстракцию образца ДНК из по меньшей мере одной клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы; (ii) приведение образца ДНК в контакт с парой праймеров, которая способна продуцировать первый ампликон, диагностический для объекта MON95275; (iii) взаимодействие образца ДНК с парой праймеров, которая способна продуцировать второй ампликон, диагностический для нативной геномной ДНК кукурузы, не содержащей объект MON95275; (iv) проведение реакции амплификации ДНК; а затем (v) обнаружение ампликонов, при этом наличие только первого ампликона является диагностическим признаком гомозиготной ДНК объекта MON95275 в образце, а наличие как первого ампликона, так и второго ампликона является диагностическим признаком растения кукурузы, гетерозиготного по аллелю объекта MON95275. Иллюстративный набор пар праймеров представлен как SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16, которые продуцируют диагностический ампликон для объекта MON95275; и SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22, которые продуцируют ампликон, диагностический для геномной ДНК кукурузы дикого типа, не содержащей объект MON95275. Набор зондов также может быть включен в такой способ амплификации для использования в формате ПЦР в реальном времени с использованием наборов пар праймеров, описанных выше. Примерный набор зондов представлен как SEQ ID NO:17 (диагностический для ампликона для объекта MON95275) и SEQ ID NO:23 (диагностический для ампликона для геномной ДНК кукурузы дикого типа, не содержащей объект MON95275).

[0120] Другой способ определения зиготности включает (i) экстракцию образца ДНК из по меньшей мере одной клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы; (ii) приведение образца ДНК в контакт с набором зондов, который содержит по меньшей мере первый зонд, специфически гибридизующийся с ДНК объекта MON95275, и по меньшей мере второй зонд, специфически гибридизующийся с геномной ДНК кукурузы, которая была нарушена вставкой гетерологичной ДНК объекта MON95275 и не гибридизуется с ДНК объекта MON95275; (iii) гибридизацию набора зондов с образцом в строгих условиях гибридизации, при этом обнаружение гибридизации только первого зонда в условиях гибридизации является диагностическим для гомозиготного аллеля ДНК объекта MON95275 в образце; и при этом обнаружение гибридизации как первого зонда, так и второго зонда в условиях гибридизации является диагностическим для гетерозиготного аллеля объекта MON95275 в образце ДНК.

[0121] Еще один способ определения зиготности включает (i) экстракцию образца ДНК из по меньшей мере одной клетки кукурузы, ткани кукурузы, семян кукурузы или растения кукурузы; (ii) взаимодействие образца ДНК с парой праймеров, способной продуцировать ампликон, диагностический для аллеля объекта MON95275; (iii) приведение образца ДНК в контакт с парой праймеров, которая способна продуцировать ампликон внутреннего стандарта, о котором известно, что он однокопийный и гомозиготный в растении кукурузы; (iv) приведение образца ДНК в контакт с набором зондов, который содержит по меньшей мере первый зонд, специфически гибридизующийся с аллелем объекта MON95275, и по меньшей мере второй зонд, специфически гибридизующийся с внутренним стандартом геномной ДНК, о котором известно, что он однокопийный и гомозиготный у растения кукурузы; (v) проведение реакции амплификации ДНК с использованием ПЦР в реальном времени и определение порогов цикла (значения Ct) ампликона, соответствующего кодирующей токсин последовательности, и однокопийного гомозиготного внутреннего стандарта; (vi) вычисление разницы (ΔCt) между значением Ct однокопийного гомозиготного ампликона внутреннего стандарта и значением Ct токсина, кодирующего последовательность ампликона; и (vii) определение зиготности, где ΔCt около нуля (0) указывает на гомозиготность вставленной Т-ДНК, a ΔCt около единицы (1) указывает на гетерозиготность вставленной Т-ДНК. Гетерозиготные и гомозиготные объекты различаются по единице значения ΔCt, равной примерно единице (1). Учитывая нормальную изменчивость, наблюдаемую в ПЦР в реальном времени вследствие множества факторов, таких как эффективность амплификации и идеальные температуры отжига, диапазон «около одного (1)» определяется как ΔCt от 0,75 до 1,25. Пары праймеров и зонды для вышеуказанного способа определения зиготности могут амплифицировать и обнаруживать ампликоны с аллеля объекта MON95275 и внутреннего стандарта. Иллюстративные пара праймеров для обнаружения ампликонов, соответствующих аллелю объекта MON95275 и внутреннего стандарта, представлены в виде SEQ ID NO:15 в сочетании с SEQ ID NO:16 (аллель объекта MON95275) и SEQ ID NO:18 в сочетании с SEQ ID NO:19 (внутренний стандарт). Прилагаемые иллюстративные зонды представлены как SEQ ID NO:17 (аллель объекта MON95275) и SEQ ID NO:20 (внутренний стандарт).

Информация о депозите

[0122] Депонирование иллюстративного образца семян кукурузы, содержащих объект MON95275, было произведено 21 августа 2019 г. в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной по адресу: 10801 University Boulevard, Манассас, Вирджиния, США, почтовый индекс 20110. Депозит принят и ему присвоен номер доступа АТСС РТА-126049. Доступ к депозитам будет открыт во время рассмотрения заявки Уполномоченному по патентам и товарным знакам и лицам, определенным Уполномоченным, имеющим право на это по запросу. После выдачи патента все ограничения на доступность для общественности будут безвозвратно сняты. Депозит будет храниться в депозитарии в течение тридцати (30) лет, или пяти (5) лет после последнего запроса, или в течение срока действия патента, в зависимости от того, что будет дольше, и будет заменен по мере необходимости в течение этого периода.

ПРИМЕРЫ

[0123] Следующие примеры включены для более полного описания данного изобретения, полученного в результате конструирования и испытания 163 конструкций, производства около 2300 объектов и анализа сотен тысяч отдельных растений за 6 лет посредством тщательного молекулярного, агрономического и полевых испытаний, необходимых для создания и отбора объекта кукурузы MON95275.

[0124] Специалистам в данной области в свете настоящего описания должно быть понятно, что в конкретных описанных вариантах осуществления можно сделать множество изменений и при этом получить такой же или схожий результат без отклонения от сущности и объема изобретения.

ПРИМЕР 1

Испытание экспрессионной кассеты, дизайн конструкции, испытание растений и выбор конструкции

[0125] Часто бывает необходимо создавать и отбирать большое количество конструкций экспрессии генов и трансформационных объектов для идентификации конструкции, а затем объекта, который демонстрирует оптимальную экспрессию интродуцированных интересующих генов, а также не дает агрономических или фенотипических побочных типов.

[0126] По этим причинам разработка трансгенного растения кукурузы, продуцирующего инсектицидные белки, активные против жесткокрылых насекомых без каких-либо негативных последствий для агрономии, урожайности или жизнеспособности при стэкинге, потребовала обширных исследований, разработок и анализа. В частности, за 6-летний период было разработано, испытано и проанализировано более 4531 экспериментального и коммерческого трансгенного объекта, полученного из 163 различных конструкций плазмидных векторов.

[0127] В данном примере описано проектирование и испытание на растениях кукурузы 163 различных конструкций для определения предпочтительной конструкции для создания объектов. Каждая конструкция различалась в отношении последовательного кодирования инсектицидных белков и регуляторных элементов транскрипции, и их испытывали для выбора предпочтительной конструкции для использования при экспрессии инсектицидных белков у растений. Каждая конструкция имела уникальную конфигурацию, отличающуюся составом кассеты для экспрессии (как инсектицидные белки, дцРНК, так и элементы экспрессии), ориентацией, а также тем, были ли белки мишенями для встраивания в хлоропласты.

[0128] На начальном этапе проверки концепции и стадии разработки было использовано 160 конструкций, содержащих различные комбинации 26 различных промоторов, 14 различных энхансеров, 14 различных интронов, 16 различных последовательностей кодирования токсинов насекомых, 16 различных кодирующих последовательностей дцРНК и 14 различных 3'-UTR для создания более 2000 трансформируемых объектов. После первоначальной молекулярной характеристики на наличие трансгена (трансгенов) было отобрано 1875 отдельных трансформированных объектов кукурузы для дальнейшей характеристики и испытания эффективности. Данные объекты оценивали на предмет фенотипических или агрономических отклонений, уровня экспрессии белков-токсинов насекомых и эффективности против выбранных видов жесткокрылых насекомых-вредителей. Полученные данные об эффективности и экспрессии белка вместе с любой информацией, касающейся фенотипических и агрономических отклонений, были использованы для исключения неэффективных белков, элементов экспрессии и комбинаций, и были использованы для разработки меньшего числа бинарных коммерческих трансформационных плазмидных конструкций, которые будут использоваться на следующем этапе разработки. Данный этап проверки концепции при разработке MON95275 обозначен как «Преобразование и анализ РОС» на временной шкале, представленной на фиг. 3.

[0129] На следующей фазе разработки были созданы 3 новых конструкции. Данные конструкции включали комбинации от 1 до 2 кассет экспрессии трансгена токсина насекомых и 1 кассеты экспрессии дцРНК в различных ориентациях (конвергентной или дивергентной). Данные 3 конструкции использовали для создания трансформированных объектов (также называемых «трансформантами»). После образования побегов в культуре было отобрано подмножество трансформированных объектов на основе визуальных характеристик и раннего молекулярного анализа. После начальной трансформации 2531 трансформант переносили в почву. 1496 объектов удаляли после начальной молекулярной характеристики. Из оставшихся 1035 объектов 427 удаляли на основании наблюдений за здоровьем растений. Остальные 608 объектов пересаживали в горшки и выращивали в теплице (GH) для дальнейшего анализа. Образцы листьев каждого объекта использовали для измерения экспрессии специфической для DvSnf7 дцРНК с использованием анализа QuantiGene® и выражали в виде фемтограмм РНК DvSnf7 на общее количество микрограммов РНК (фг РНК DvSnf7/MKr). Диапазон экспрессии 1000-3000 фг DvSnf7 дцРНК/мкг РНК использовали для отбора объектов для дальнейшего исследования. Из оставшихся 608 объектов у 425 обнаружена экспрессия DvSnf7 дцРНК с диапазоном экспрессии 1000-3000 фг DvSnf7 дцРНК/мкг РНК. 19 из оставшихся 425 объектов были устранены вследствие отсутствия экспрессии белков токсина насекомых, в результате чего для дальнейшего анализа и характеристики оставалось 406 объектов. Объекты R0 оставляли для самоопыления и получения семян Ri. Основываясь на наблюдениях за здоровьем растений и возвратом семян, 152 объекта были удалены, в общей сложности осталось 254 объекта для дальнейшего изучения. После дальнейшей молекулярной характеристики 102 объекта были удалены, оставив в общей сложности 152 объекта для питомника Ri для изучения эффективности, дополнительной молекулярной характеристики, исследований экспрессии, а также анализа возврата семян и сегрегации. Данная коммерческая трансформация и стадия скрининга Ro в разработке объекта MON95275 идентифицируется как «Комм, скрининг TFN Ro» на временной шкале, представленной на фиг. 3.

[0130] Поскольку испытания растений относительно злакового корневого червя являются деструктивными анализами, требующими удаления растения из горшка для оценки общего повреждения корней, растения R₀ используются для получения семян R₁, таким образом, чтобы было достаточно семян для продолжения поколений каждого выбранного вида для дальнейшей оценки эффективности и агрономических оценок, а также для дальнейшей молекулярной характеристики. Растения, образованные из семян R₁, оценивали относительно эффективности против западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi, NCR). На основании исследований эффективности, дополнительной молекулярной характеристики, исследований экспрессии, анализа возврата семян и сегрегации 57 объектов, полученных из 3 конструкций, были переданы для дальнейшего анализа. Данный этап эффективности/молекулярного скрининга R₁ идентифицируется как «Скрининг GH/мол.» на фиг. 3. После стадии эффективности/молекулярного скрининга R₁ объекты, полученные из одной конструкции (Конструкция-2 в таблице 2), были удалены на основании решений, касающихся конфигурации конструкции и кассет для экспрессии токсина.

[0131] В таблице 2 показано количество объектов, оставшихся в соответствии с каждой конструкцией для каждой стадии отбора, описанного выше, в соответствии с каждой конструкцией. Плазмидная конструкция рМ95275 была конструкцией, использованной при трансформации, которая продуцировала объект кукурузы MON95275.

[0132] Полевые испытания эффективности в США в 2017 году сократили общее количество объектов до 14 из конструкции-1 и конструкции рМ95275 на основе эффективности, фенотипических наблюдений и молекулярных исследований, таких как интеграция места введения.

[0133] Объекты, полученные из конструкции-1 в таблице 2, были удалены на основании решений, касающихся экспрессии инсектицидного белка.

[0134] Таким образом, многочисленные раунды испытания и сравнения различных конструкций показали, что объекты, полученные с использованием трансгенной кассеты, представленной как SEQ ID NO: 13, конструкции рМ95275, обеспечивают предпочтительную эффективность против видов жесткокрылых вредителей западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi, NCR), и предпочтительные молекулярные характеристики и агрономические характеристики.

ПРИМЕР 2

Полевые испытания, молекулярные испытания и выбор объекта

[0135] В данном примере описана молекулярная характеристика, анализ и тестирование в полевых испытаниях объектов, созданных с использованием конструкции рМ95275 в нескольких местах в течение нескольких лет, что привело к выбору окончательного объекта, MON95275.

[0136] В таблице 3 проиллюстрирован процесс, применяемый для выбора объекта MON95275. При коммерческом скрининге трансформации Ro было получено и отобрано для выращивания сто сорок (140) трансформированных R0 объектов из конструкции рМ95275. После количественного определения экспрессии DvSnf7 были удалены 3 объекта, которые не соответствовали критериям диапазона экспрессии 1000 3000 фг DvSnf7 дцРНК/мкг РНК, в результате чего для дальнейшего анализа осталось 137 объектов. Остальные 137 объектов были проанализированы относительно экспрессии токсинов Cry75Aa1 и Vip4Da2, а 7 объектов были удалены на основании анализов, в результате чего оставалось 130 объектов для скрининга R₀. После скрининга R₀ 52 объекта были удалены вследствие плохого возврата семян или здоровья растений, оставляя в общей сложности 78 для дальнейшей молекулярной характеристики. После молекулярной характеристики оставалось 56 объектов.

[0137] Остальные 56 объектов были отправлены в питомник R₁ для дальнейшего испытания. Из питомника R₁ дополнительно 8 объектов были удалены вследствие плохого возврата семян и анализа сегрегации, а 21 объект был исключен вследствие проблем, связанных с экспрессией белка и молекулярной характеристикой, в результате чего осталось 19 объектов.

[0138] Остальные 19 объектов перешли к фазе скрещивания R2/F1 Cre, в которой маркерную кассету СР4 удаляли в результате размножения. В ходе фазы скрещивания R2/F1 Cre 12 объектов были удалены, 7 вследствие дополнительной молекулярной характеристики и 5 вследствие опасений относительно агрономических характеристик и других молекулярных исследований.

[0139] Остальные 7 объектов отправились на полевые испытания в США в 2017 году. После полевых испытаний 3 из оставшихся 7 объектов были удалены, 1 в результате неправильного фенотипа, наблюдаемого в полевых условиях, и 2, которые показали худшие результаты, чем другие, в отношении эффективности и агрономии, оставив 4 объекта для полевых испытаний в США в 2018 году. В ходе полевых испытаний в США в 2018 году 1 объект был удален вследствие неправильного паттерна транскрипции кассеты для экспрессии DvSnf7 дцРНК и 1 вследствие агрономических показателей, в результате чего осталось 2 объекта, объект 1 и объект MON95275. После дальнейшего анализа агрономических характеристик объектов, полученных в результате многочисленных полевых испытаний в США и Аргентине, объект MON95275 выбирали в качестве объекта для коммерциализации, поскольку его оценивали как дцРНК выше, чем объект 1, при сравнении всех характеристик молекулярной характеристики, экспрессии белка и дцРНК DvSnf7, эффективности и агрономии каждого события.

ПРИМЕР 3

Cre-вырезание кассеты для селекции глифосата в объекте кукурузы MON95275

[0140] В данном примере описано удаление кассеты для селекции глифосата из объекта кукурузы MON95275 посредством Cre-вырезания in vivo. Кассету для селекции глифосата использовали для отбора трансформированных объектов. Посредством удаления кассеты для селекции был создан «безмаркерный» объект, в котором в конечном объекте оставались только кассеты для экспрессии инсектицидного белка.

[0141] Незрелые зародыши кукурузы сорта LH244 трансформировали с использованием процесса трансформации, опосредованного Agrobacterium, с использованием конструкции рМ95275 (представленной как SEQ ID NO: 13 и проиллюстрированной на фиг.2). Конструкция рМ95275 содержит 4 кассеты для экспрессии: 2 кассеты экспрессии для экспрессии инсектицидных белков Сгу75Аа1 и Vip4Da2, 1 кассету для экспрессии для экспрессии дцРНК DvSnf7 и одну кассету для селекции трансформированных клеток растений посредством селекции глифосата. Кассету для селекции фланкировали с обеих сторон Cre-рекомбиназой LoxP, распознающей последовательно.

[0142] После трансформации трансформанты R₀ подвергались самоопылению в течение 2 поколений, в течение которых многие объекты были удалены на основе различных анализов, таких как эффективность, экспрессия DvSnf7, экспрессия белка, возврат семян и здоровье растения, а также молекулярная характеристика. В поколении R2 оставалось 19 объектов от первоначальных 140 объектов. 19 гомозиготных объектов поколения R2 были скрещены с элитной линией трансформированных растений кукурузы, экспрессирующих фермент Cre-рекомбиназу, полученный из фага Enterobacteria Р1.

[0143] Данный этап, в ходе которого объекты поколения R2 были скрещены с растениями, экспрессирующими Се-рекомбиназу, обозначен как «Cre Cross» на временной шкале, представленной на фиг. 3. В частности, на данном этапе гомозиготные по SEQ ID NO:13 растения поколения R₂ без кисточек (женские) подвергали перекрестному опылению с трансгенными растениями кукурузы (мужскими), гомозиготными по трансгенной кассете, используемой для экспрессии фермента Cre-рекомбиназы. Пыльца мужского донора, экспрессирующая Cre-рекомбиназу, прорастает после высаживания на ткань рыльцев женского растения, содержащей SEQ ID NO:13. Как только пыльцевая трубка попадает в зародышевый мешок, пыльцевая трубка разрывается, освобождая два спермия мужского донора, экспрессирующего Cre-рекомбиназу. Ядро одного спермия сливается с ядром яйцеклетки, образуя зиготу. Другое ядро спермия сливается с одним из двух полярных ядер, которое, в свою очередь, сливается с другим полярным ядром, тем самым образуя первичное ядро эндосперма.

[0144] Таким образом, при использовании в качестве донора мужской пыльцы растения, экспрессирующего Cre-рекомбиназу, и зародыш, и эндосперм полученного скрещивания будут экспрессировать Сге-рекомбиназу по мере того, как клетки делятся и развиваются и становятся зерном кукурузы (т.е., семенем). Сге-рекомбиназа связывается с инвертированными повторами в сайте LoxP и катализирует кроссинговер в спейсерной области из восьми пар оснований двух сайтов LoxP, фланкирующих кассету для экспрессии, что приводит к вырезанию маркерной кассеты с одним сайтом LoxP, остающимся в интегрированной Т-ДНК вследствие рекомбинации (см. фиг. 2, «Вставленная Т-ДНК после Cre-вырезания»).

[0145] Потомство F₁, полученное в результате Cre-скрещивания, отбирали по отсутствию кассеты для селекции СР4 и позволяли самоопыляться. Данный этап, в ходе которого потомству F₁ было позволено самоопыляться, обозначена как «F₁ Self» на временной шкале, представленной на фиг. 3. В ходе данного процесса два аллеля - аллель Cre-рекомбиназы и аллель Т-ДНК - использовались для генерации объекта MON95275 - сегрегации в полученной популяции F₂, в результате чего получается гомозиготное или гетерозиготное потомство по одному или обоим аллелям.

[0146] Отбирали потомство F₂, демонстрирующее отсутствие аллеля Cre-рекомбиназы и гомозиготность по SEQ ID NO:9, трансгенную вставку Т-ДНК после Cre-эксцизии. Это отобранное потомство F₂ подвергали самоопылению, давая поколение F₃, гомозиготное по SEQ ID NO:9. Данный этап, в ходе которого потомству F₂ было позволено самоопыляться, обозначена как «F₂ Self» на временной шкале, представленной на фиг. 3.

[0147] В результате дальнейшего самоопыления были получены семена потомства F₃ (семена F₄), которые были проверены на чистоту и были обозначены как «семена золотого стандарта». F₄ был первым поколением семян золотого стандарта. Семена золотого стандарта представляют собой семена, которые были проверены на чистоту для обеспечения отсутствия объектов, отличных от MON95275. Данный этап, в ходе которого потомству F3 было позволено самоопыляться, обозначена как «F₃ Self» на временной шкале, представленной на фиг. 3.

[0148] Удаление маркерной кассеты селекции глифосата не влияло на экспрессию Cry75Aal, Vip4Da2 и DvSnf7 дцРНК. Удаление кассеты для селекции глифосата из объекта кукурузы MON95275 посредством Cre-вырезания обеспечивало трансгенный объект кукурузы, устойчивый к жесткокрылым вредителям, без добавления толерантности к глифосату в конечном объекте. Данный «безмаркерный» объект обеспечивает гибкость при построении селекционных штабелей кукурузы с другими трансгенными объектами кукурузы для обеспечения множества продуктов, включающих объект MON95275, и позволяет использовать несколько вариантов для обеспечения дополнительных признаков в конечных коммерческих селекционных штабелях.

ПРИМЕР 4

Объект кукурузы MON95275 демонстрирует устойчивость к жесткокрылым насекомым-вредителям западного кукурузного жука и северного кукурузного жука

[0149] В данном примере описана активность объекта кукурузы MON95275 против жесткокрылых насекомых-вредителей. Белки токсинов насекомых Сгу75Аа1 и Vip4Da2 и DvSnf7 дцРНК при совместной экспрессии в объекте кукурузы MON95275 обеспечивают устойчивость к западному кукурузному жуку (Diabrotica virgifera virgifera, WCR) и северному кукурузному жуку (Diabrotica barberi, NCR).

MON95275 демонстрирует устойчивость к западному кукурузному жуку в теплице и в полевых условиях.

[0150] После трансформации и введения конструкции рМ95275 объекты этапа R₀ переносили в теплицу и позволяли им самоопыляться и производить семена. Отобранные семена R₁ высевали в горшки и выращивали в теплице. Яйца от западного кукурузного жука (WCR) инкубировали в течение примерно 10 дней для обеспечения вылупления в течение 4 дней после инокуляции. Анализировали 6 растений для каждого объекта. Растения инокулировали примерно на стадии от V2 до V3. В каждый горшок инокулировали около 2000 яиц. Растения выращивали после заражения в течение примерно 28 дней. Затем растения вынимали из горшков и тщательно промывали корни для удаления всей земли. Повреждение корней каждого растения оценивали по шкале оценки повреждений от 0 до 3, как представлено в таблице 4. Сравнение проводили с отрицательным контролем дикого типа того же сорта, что и трансформанты. Рейтинг повреждения корня (RDR) 0-0,75 представляет хорошую эффективность, RDR 0,76-1,5 представляет среднюю эффективность, a RDR 1,6-3,0 представляет низкую или плохую эффективность.

[00100] Как видно из таблицы 5, объект кукурузы MON95275 продемонстрировал значительную эффективность по сравнению с отрицательным контролем.

[0151] В США были проведены полевые испытания эффективности для оценки устойчивости объекта кукурузы MON95275 к WCR. Полевые испытания были проведены в 8 отдельных местах, о которых известно, что они заражены WCR: Коулсбург, Айова, Фэрбанк, Айова, Индепенденс, Айова, Ли, Небраска, Пилджер, Небраска, Роанок, Иллинойс, Роуэн, Айова и Шелби, Небраска. Гибридные растения, полученные посредством скрещивания инбредного объекта кукурузы MON95275 (LH244) с сортом кукурузы 93IDI3, выращены на засаженных WCR полях. Объект кукурузы MON95275 все еще содержал кассету маркера СР4 в данном полевом испытании. Кроме того, также выращивали два отрицательных контроля; (1) гибрид кукурузы MON89034 (93IDI3) × LH244, устойчивый к чешуекрылым, и (2) нетрансгенный гибрид кукурузы 93IDI3 × LH244.

[0152] Испытания в каждом месте были заложены в виде рандомизированного полного блочного дизайна. Участки были заблокированы повторно и внутри данного блока, расположение участков было рандомизировано. Оба объекта MON95275 и контроли были представлены один раз в каждом блоке. Размеры блока, такие как количество столбцов в строке по количеству диапазонов в глубину, варьировали в зависимости от расположения, в зависимости от размера и формы поля. Каждая запись была равномерно распределена по полю для компенсации любых различий в давлении WCR, которые могут возникнуть. Приблизительно по 10 растений для MON95275 и контроля выкапывали приблизительно на стадии VT. Корни тщательно промывали и каждому растению присваивали рейтинг повреждения корней (RDR) от 0,1 до 3,00, представленный в таблице 6.

[0153] В таблицах 7 и 8 показаны средние оценки повреждения корней для объекта кукурузы MON95275 и двух отрицательных контролей, соответствующих каждому полю.

[0154] Как видно из таблиц 7 и 8, объект кукурузы MON95275 обеспечивал устойчивость к WCR по сравнению с отрицательным контролем. В то время как в большинстве случаев контрольные образцы понесли ущерб, который потенциально мог привести к экономическим потерям на основе шкалы RDR, представленной в таблице 6, объект кукурузы MON95275 продемонстрировал устойчивость к WCR и только понес ущерб, который можно было бы считать неэкономическим во всех местах.

[0155] Летом 2018 г. были проведены полевые испытания эффективности в 5 районах США, где известно о заражении WCR, для оценки устойчивости объектов кукурузы MON95275 к WCR; Данди, Айова, Ли, Нью-Йорк, Онейда, Айова, Пилгер, Нью-Йорк, и Кингсли, Айова. Были проведены полевые испытания и проведены оценки повреждения корней, как описано выше. Анализировали как маркер-положительные, так и не содержащие маркеры объекты кукурузы MON95275 вместе с двумя ранее описанными негативными контролями. В таблицах 9 и 10 показаны средние оценки повреждения корней для маркерных и не содержащих маркеры объектов кукурузы MON95275 и двух отрицательных контролей, соответствующих каждому полю.

[0156] Как видно из таблиц 9 и 10, как маркер-положительные, так и не содержащие маркеры объекты кукурузы MON 95275 продемонстрировали устойчивость к WCR по сравнению с отрицательным контролем. Во всех местах, кроме одного, повреждение маркера и не содержащего маркеры объекта кукурузы MON95275 было нерентабельным. Повреждения в Пилгере, Небраска были выше, но все же намного ниже, чем повреждения отрицательных контролей в данном месте.

[0157] Объект кукурузы MON95275 обеспечивает устойчивость к западному кукурузному жуку (Diabrotica virgifera virgifera), что было продемонстрировано в теплице и в двух полевых испытаниях в США.

MON95275 обеспечивает устойчивость к северному кукурузному жука в полевых условиях.

[0158] Летом 2017 года в Хоукай, Айова, было проведено единственное полевое испытание на поле, известном как зараженное северным кукурузным жуком (NCR). Маркер-положительный гибрид объекта кукурузы MON95275 и два отрицательных контроля, как описано выше, выращивали на нескольких делянках в полевых условиях аналогично тому, как это было сделано для западного кукурузного жука. Оценку повреждения корней оценивали для объекта MON95275 и двух отрицательных контролей с использованием той же шкалы, которая представлена в таблице 6. В таблице 11 показаны средние оценки повреждения корней и диапазоны RDR для маркер-положительного объекта кукурузы MON95275 и отрицательного контроля.

[0159] Как видно из приведенной выше таблицы 11, среднее значение RDR для маркер-положительного MON95275 было ниже, чем для отрицательного контроля MON89034 (93IDI3) x LH244. Средний RDR был низким для нетрансгенного контроля, что позволяет предположить, что давление NCR в полевых условиях было низким.

[0160] Летом 2018 года полевые испытания были проведены в трех (3) отдельных местах, о которых известно, что они заражены NCR, Белмонд, Айова, Бенсон, Миннесота, и Колтон, Южная Дакота. Полевые испытания проводили в соответствии с описанием выше. Таблицы 12 и 13 показывают средний диапазон RDR и RDR для трех (3) местоположений.

[0161] Как видно из таблиц 12 и 13, объект кукурузы MON95275 обладал устойчивостью к NCR. Например, в Бенсоне, штат Миннесота, давление NCR было высоким, как видно из высоких средних RDR отрицательных контролей, но средний RDR был ниже экономического ущерба в объекте кукурузы MON95275. Во всех трех (3) местах MON95275 продемонстрировал устойчивость к NCR по сравнению с двумя отрицательными контролями.

[0162] MON95275 обеспечивает устойчивость к северному кукурузному жуку (Diabrotica barberi).

ПРИМЕР 5

Объект кукурузы MON95275 обеспечивает стабильную урожайность и агрономические показатели, аналогичные нетрансформированным растениям кукурузы LH244

[0163] Данный пример демонстрирует, что трансгенный объект кукурузы MON95275 обеспечивает стабильную урожайность и сходные агротехнические показатели в полевых условиях с нетрансформированными растениями кукурузы LH244.

[0164] Полевые испытания проводились с растениями, соответствующими MON95275, до Cre-вырезания кассеты для селекции глифосата и после Cre-вырезания для определения различных аспектов урожайности и агрономии по сравнению с контрольными растениями. Измерения урожайности были рассчитаны и выражены в бушелях на акр (буш/акр). Высоту растения и высоту початка измеряли в дюймах (дюйм). 50% сброса пыльцы и 50% опушения початка кукурузы были выражены в днях после посева (DAP).

[0165] В вегетационный период 2017 г. в США определяли урожайность и агротехнические мероприятия для инбредов и гибридов MON95275 до Cre-вырезания кассеты маркера глифосата. В таблицах 14 и 15 показана урожайность и агрономические характеристики, измеренные для инбредов и гибридов MON95275, соответственно. Отрицательным контролем для инбредных сравнений был нетрансформированный сорт LH244. Гибриды, содержащие MON95275, были созданы посредством перекрестного опыления инбредной MON95275 с сортом кукурузы 93IDI3, а контроль представлял собой скрещивание MON 89034 (93IDI3) × LH244.

[0166] Как видно из таблиц 15 и 16, урожайность и другие агротехнические показатели для MON95275 в полевых испытаниях в США в 2017 г. были относительно одинаковыми как для инбредов, так и для гибридов по сравнению с контролями. Вариабельность между инбредами и гибридами и их соответствующими контролями находилась в допустимых пределах и продемонстрировала отсутствие отрицательного влияния на урожайность и другие агрономические характеристики, вызванного вставкой Т-ДНК в геном кукурузы объекта MON95275.

[0167] В вегетационный период 2018 г. в США определяли урожайность и агротехнические мероприятия для инбредов и гибридов MON95275 до Cre-вырезания и после Cre-вырезания кассеты маркера глифосата. В таблицах 16 и 17 показана урожайность и агрономические характеристики, измеренные для MON95275-положительных и безмаркерных инбредов и гибридов, соответственно.

[0168] Как видно из таблиц 16 и 17, урожайность и другие агротехнические показатели для MON95275, как маркер-положительного, так и не содержащего маркер, в полевых испытаниях в США в 2018 г. были относительно одинаковыми как для инбредов, так и для гибридов по сравнению с контролями. Вариабельность между инбредами и гибридами и их соответствующими контролями находилась в допустимых пределах и продемонстрировала отсутствие отрицательного влияния на урожайность и другие агрономические характеристики, вызванного вставкой Т-ДНК в геном кукурузы объекта MON95275.

[0169] Урожайность и агрономические показатели также изучались в Аргентине в течение вегетационного периода с 2018 по 2019 год для инбредов без маркеров MON95275. В таблице 18 показана урожайность и агрономические характеристики, измеренные для безмаркерных инбредов MON95275.

[0170] Как видно из таблицы 18, урожайность и другие агротехнические показатели были относительно одинаковыми для не содержащих маркер инбредных и контрольных сортов из полевых испытаний в Аргентине в 2018-2019 гг. Вариабельность между инбредами и контролем находилась в допустимых пределах и свидетельствовала об отсутствии негативного влияния на урожайность и другие агрономические характеристики, вызванного вставкой Т-ДНК в геном кукурузы объекта MON95275.

ПРИМЕР 6

Объект-специфичные конечные анализы TAQMAN® объекта кукурузы MON95275

[0171] В следующем примере описаны способы, подходящие для идентификации присутствия MON95275 в образце кукурузы. Пара праймеров для ПЦР и зонд были разработаны с целью идентификации уникального соединения, образованного между геномной ДНК кукурузы и вставленной ДНК MON95275 в объект-специфичной конечной TAQMAN® ПЦР. Примеры условий, используемых для определения присутствия MON95275 в образце кукурузы в ПЦР TAQMAN® по конечной точке, специфичной для объекта, описаны в таблице 19 и таблице 20.

[0172] Последовательность олигонуклеотид но го прямого праймера SQ20267 (SEQ ID NO:15) идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 15706-15732 в SEQ ID NO:10. Последовательность олигонуклеотидного обратного праймера SQ51355 (SEQ ID NO:16) идентична обратной последовательности нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 15756-15779 в SEQ ID NO:10. Последовательность олигонуклеотидного зонда РВ10263 (SEQ ID NO:17) идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей положениям 15734-15752 в SEQ ID NO:10. Праймеры SQ20267 (SEQ ID NO:15) и SQ51355 (SEQ ID NO:16) с зондом РВ10263 (SEQ ID NO:17), которые могут быть флуоресцентно мечены (например, флуоресцентная метка 6-FAM™), могут быть использованы в конечном анализе TAQMAN® ПЦР для определения присутствия ДНК, полученной из MON95275, в образце.

[0173] В дополнение к SQ20267 (SEQ ID NO:15), SQ51355 (SEQ ID NO:16) и PB10263 (SEQ ID NO:17) специалистам в данной области должно быть очевидно, что другие праймеры и/или зонды могут быть сконструированы либо для амплификации, либо для гибридизации с последовательностями в SEQ ID N0:10, которые являются уникальными и пригодными для обнаружения присутствия ДНК, полученной из MON95275, в образце.

[0174] В соответствии со стандартной лабораторной практикой молекулярной биологии были разработаны ПЦР-анализы для идентификации объекта для обнаружения MON95275 в образце. Параметры либо стандартного ПЦР-анализа, либо ПЦР-анализа TAQMAN® были оптимизированы для каждого набора пар праймеров и зондов (например, зондов, помеченных флуоресцентной меткой, такой как 6-FAM™), используемых для обнаружения присутствия ДНК, полученной из MON95275, в образце. Контроль для реакции ПЦР включает праймеры внутреннего контроля и зонд внутреннего контроля (например, меченный® VIC), специфичный к области генома кукурузы, которая используется в качестве внутреннего контроля, и представляют собой праймеры SQ20222 (SEQ ID NO:18), SQ20221 (SEQ ID NO:19), и зонд с меткой VIC® РВ50298 (SEQ ID NO:20).

[0175] Как правило, параметры, которые были оптимизированы для обнаружения MON95275 в образце, включали концентрацию праймера и зонда, количество матричной ДНК и параметры цикла амплификации ПЦР. Контроли для данного анализа включают положительный контроль из кукурузы, содержащей MON95275, отрицательный контроль из нетрансгенной кукурузы и отрицательный контроль, не содержащий матричной ДНК.

ПРИМЕР 7

Анализы для определения зиготности объекта кукурузы MON95275 с использованием TAQMAN®

[0176] В следующем примере описаны способы, полезные для определения зиготности объекта MON95275. Пары праймеров для ПЦР и зонд предназначены для выявления специфических свойств аллелей, положительных по вставке Т-ДНК, которая дала начало объекту MON95275, и пары праймеров для ПЦР и зонд созданы в качестве внутреннего контрольного зонда, специфичного к области генома кукурузы, которая используется в качестве внутреннего контроля и представлена в геноме кукурузы как гомозиготная.

[0177] Пары праймеров для ПЦР и зонда, специфичные к аллелю трансгена MON95275, описанные в примере 6, праймеры для ПЦР SQ20267 (SEQ ID NO:15), SQ51355 (SEQ ID NO:16), 6-ЕАМ™-меченый зонд PB10263 (SEQ ID NO:17) и пары праймеров для ПЦР и зонд, специфичный для внутреннего контроля, праймеры SQ20222 (SEQ ID NO:18), SQ20221 (SEQ ID NO:19), и VIC®-меченый зонд РВ50298 (SEQ ID NO:20) используют в реакции ПЦР в реальном времени, такой как реакция, описанная в примере 6.

[0178] После амплификации определяют пороги цикла (значения Ct) для ампликона, соответствующего вставленному аллелю MON95275, и однокопийному гомозиготному внутреннему стандарту. Определяют разницу (ΔCt) между значением Ct однокопийного гомозиготного ампликона внутреннего стандарта и значением Ct ампликона со вставленным аллелем MON95275. Что касается зиготности, ΔCt около нуля (0) указывает на гомозиготность вставленной MON95275 Т-ДНК, a ΔCt около единицы (1) указывает на гетерозиготность вставленной MON95275 Т-ДНК. Отсутствие ампликона, соответствующего вставленному аллелю MON95275, указывает на то, что образец является нулевым для вставленного Т-ДНК MON95275. Значения Ct в способе термического усиления TAQMAN® будут иметь некоторую изменчивость вследствие множества факторов, таких как эффективность усиления и идеальные температуры отжига. Следовательно, диапазон «около одного (1)» определяется как ΔCt от 0,75 до 1,25.

ПРИМЕР 8

Анализы для определения зиготности объекта кукурузы MON95275 с использованием TAQMAN®

[0179] В следующем примере описан способ, используемый для определения зиготности объекта MON95275 в образце кукурузы.

[0180] Пара праймеров для ПЦР и зонд предназначены для выявления специфических свойств аллелей, положительных и отрицательных по вставке Т-ДНК, давшей начало объекту MON95275. Примеры условий, которые могут быть использованы в специфичной к объекту ПЦР зиготности TAQMAN®, приведены в таблицах 21 и 22. Для данного анализа с образцом смешивают четыре разных праймера и два разных зонда. Пары праймеров ДНК, используемые в анализе зиготности, представляют собой (1) праймеры SQ20267 (SEQ ID NO:15) и SQ51355 (SEQ ID NO:16); и (2) праймеры PNEG95275_F (SEQ ID NO:21) и PNEG95275_R (SEQ ID NO:22). Зонды, используемые в анализе зиготности, представляют собой 6FAM™-меченый зонд РВ10263 (SEQ ID NO:17) и VIC®-меченый зонд PRBNEG95275 (SEQ ID NO:23). Праймеры SQ20267 (SEQ ID NO:15) и SQ51355 (SEQ ID NO:16) продуцируют первый ампликон, который можно идентифицировать по связыванию с меченым 6FAM™ зондом РВ10263 (SEQ ID NO:17), и обнаруживанное связывание зонда к ампликону является диагностическим признаком наличия ДНК объекта MON95275 в образце, содержащем ДНК кукурузы. Праймеры PNEG95275_F (SEQ ID NO:21) и PNEG95275_R (SEQ ID NO:22) продуцируют второй ампликон, который можно идентифицировать по связыванию с VIC®-меченым зондом PRBNEG95275 (SEQ ID NO:23), и обнаруженное связывание зонда ампликона является диагностическим при отсутствии ДНК объекта MON95275, когда в образце, содержащем ДНК кукурузы, отсутствует копия MON95275; т.е. данный второй набор праймеров и зондов является диагностическим для аллеля дикого типа.

[0181] Если три праймера и два зонда смешивают вместе в реакции ПЦР с ДНК, выделенной из растения, гетерозиготного по объекту MON95275, флуоресцентный сигнал обнаруживается как от меченого 6FAM™ зонда РВ10263 (SEQ ID NO: 17), так и от VIC®-меченого зонда PRBNEG95275 (SEQ ID NO:23), и обнаружение обоих флуорофоров в результате такой реакции термической амплификации свидетельствует о диагностике растения, гетерозиготного по объекту MON95275. Если три праймера и два зонда смешивают вместе в реакции ПЦР с ДНК, выделенной из растения, гомозиготного по объекту MON95275, флуоресцентный сигнал обнаруживается только от меченого 6FAM™ зонда РВ10263 (SEQ ID NO: 17), а не от VIC®-меченого зонда PRBNEG95275 (SEQ ID NO:23). Если три праймера и два зонда смешивают вместе в реакции ПЦР с ДНК, выделенной из растения, которое является нулевым для MON95275 (т.е., дикий тип), флуоресцентный сигнал обнаруживается только от VIC®-меченого зонда PRBNEG95275 (SEQ ID NO:23). Образцы матричной ДНК и контроли для данного анализа представляют собой положительный контроль из кукурузы, содержащей ДНК MON95275 (как из известного гомозиготного, так и из известного гетерозиготного образца), отрицательный контроль из нетрансгенной кукурузы и отрицательный контроль, который не содержит ДНК-матрицы.

ПРИМЕР 9

Идентификация объекта кукурузы MON95275 в любом объекте разведения MON95275

[0182] В следующем примере описано, как можно идентифицировать ДНК объекта MON95275 в потомстве любой селекционной деятельности с использованием объекта кукурузы MON95275. Например, объект MON95275 может быть объединен посредством размножения или интрогрессии на месте с другими объектами, известными в данной области для борьбы с вредителями кукурузного жука, такими как любой из следующих объектов кукурузы, включая без ограничения MON863, MON88017, DAS-59122-7, DP-004114-3, DP23211 и MIR604. Объект MON95275 также может быть объединен посредством размножения или интрогрессии на месте с другими трансгенными объектами кукурузы, известными в данной области для борьбы с вредителями, отличными от кукурузных корневых червей, такими как объекты, включая без ограничения MON810, ТС1507, MON89034, MON95379 и MIR162 среди тех, которые придают устойчивость к чешуекрылым, или к объектам, которые обеспечивают экспрессию белков, придающих устойчивость к любому количеству гербицидов, известных в данной области.

[0183] Пары ДНК-праймеров используются для получения ампликона, диагностического для объекта кукурузы MON95275. Диагностический ампликон для ДНК объекта MON95275 содержит по меньшей мере одну последовательность соединений. Последовательности соединений для специфической ДНК объекта MON95275 являются следующими: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, и SEQ ID NO:6 ([1], [2], [3], [4], [5] и [6], соответственно, на фиг. 1). SEQ ID NO:l представляет собой последовательность из пятидесяти (50) нуклеотидов, представляющую 5'-области соединения геномной ДНК кукурузы и экспрессионной кассеты интегрированного трансгена. SEQ ID NO:l расположена в SEQ ID NO:10 в позиции нуклеотида 1049-1098. SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность из пятидесяти (50) нуклеотидов, представляющую 3'-области соединения геномной ДНК кукурузы и экспрессионной кассеты интегрированного трансгена. SEQ ID NO:2 расположена в SEQ ID NO:10 в позиции нуклеотида 15731-15780. SEQ ID NO:3 представляет собой последовательность из ста (100) нуклеотидов, представляющую 5'-области соединения геномной ДНК кукурузы и экспрессионной кассеты интегрированного трансгена. SEQ ID NO:3 расположена в SEQ ID NO:10 в позиции нуклеотида 1024-1123. SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность из ста (100) нуклеотидов, представляющую 3'-области соединения геномной ДНК кукурузы и экспрессионной кассеты интегрированного трансгена. SEQ ID NO:4 расположена в SEQ ID NO:10 в позиции нуклеотида 15706-15805. SEQ ID NO:5 представляет собой последовательность из двухсот (200) нуклеотидов, представляющую 5'-области соединения геномной ДНК кукурузы и экспрессионной кассеты интегрированного трансгена. SEQ ID NO:5 расположена в SEQ ID NO:10 в позиции нуклеотида 974-1173. SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность из двухсот (200) нуклеотидов, представляющую 3'-области соединения геномной ДНК кукурузы и экспрессионной кассеты интегрированного трансгена. SEQ ID NO:6 расположена в SEQ ID N):10 в позиции нуклеотида 15656-15855.

[0184] Пары праймеров, которые будут производить диагностику ампликона для объекта MON95275, включают пары праймеров, основанные на фланкирующей последовательности (SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12) и вставленной Т-ДНК (SEQ ID NO:9). Для получения диагностического ампликона, в котором обнаружена SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:5, можно сконструировать молекулу прямого праймера на основе 5'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы (SEQ ID NO:11) из оснований 1-1073 и молекулы обратного праймера, основанной на вставленной Т-ДНК (SEQ ID NO:9) из положений с 1074 по 15755, в которой молекулы праймера имеют достаточную длину смежных нуклеотидов для специфической гибридизации с SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:9. Для получения диагностического ампликона, в котором обнаружена SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:6, можно сконструировать молекулу прямого праймера на основе встроенной Т-ДНК (SEQ ID NO:9) из положений 1074-15755 и молекулу обратного праймера, основанную на З'-фланкирующей геномной ДНК кукурузы (SEQ ID NO:12) из положений 15756-16861, в которой молекулы праймера имеют достаточную длину смежных нуклеотидов для специфической гибридизации с SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:12.

[0185] Для практических целей следует разработать праймеры, которые производят ампликоны ограниченного диапазона размеров, предпочтительно, от 200 до 1000 оснований. Ампликоны меньшего размера, как правило, более надежно продуцируются в реакциях термической амплификации, допускают более короткое время цикла и могут быть легко разделены и визуализированы на агарозном или акриламидном гелях или адаптированы для использования в анализах, подобных TAQMAN®. Кроме того, ампликоны, полученные с использованием указанных пар праймеров, могут быть клонированы в векторы, размножены, выделены и упорядочены по порядку или могут быть непосредственно упорядочены по порядку с использованием способов, хорошо известными в данной области. Любая пара праймеров, полученная из комбинаций SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:9, которые применимы в способе амплификации ДНК для получения ампликона, диагностического для ДНК или потомства объекта MON95275, является аспектом данного изобретения. Любая одиночная выделенная молекула полинуклеотидного праймера ДНК, содержащая не менее одиннадцати (11) смежных нуклеотидов SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:12 или их комплементов, которая может быть использована в способе амплификации ДНК для получения ампликона ДНК объекта MON95275 или его потомство, содержащее такую ДНК, является аспектом данного изобретения.

[0186] Пример условий амплификации для данного анализа проиллюстрирован в таблицах 19 и 20. Любая модификация данных способов или использование ДНК-праймеров, гомологичных или комплементарных SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, или ДНК последовательности генетических элементов, содержащихся в трансгенной вставке (SEQ ID NO:9) ДНК объекта MON95275, которые производят диагностический ампликон для ДНК объекта MON95275, находятся в пределах данной области техники. Диагностический ампликон содержит молекулу ДНК, гомологичную или комплементарную по меньшей мере одному трансгенному/геномному соединению ДНК или его существенной части.

[0187] Анализ образца ткани растения объекта MON95275 должен включать положительный контроль ткани растения, содержащего ДНК объекта MON95275, отрицательный контроль растения кукурузы, не содержащего ДНК объекта MON95275 {например, LH244), и отрицательный контроль, не содержащий геномной ДНК кукурузы. Пара праймеров будет амплифицировать эндогенную молекулу ДНК кукурузы и будет служить внутренним контролем условий амплификации ДНК. Дополнительный праймер последовательности может быть выбран из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:9 специалистами в области способов амплификации ДНК. Условия, выбранные для получения ампликона посредством способов, представленных в таблице 19 и таблице 20, могут отличаться, но в результате получается ампликон, диагностический для ДНК объекта MON95275. Использование последовательностей ДНК-праймера или с модификациями способов из таблицы 23 и таблицы 24 входит в объем данного изобретения. Ампликон, продуцируемый по меньшей мере одним ДНК-праймером последовательности, полученной из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:9, который является диагностическим для объекта MON95275, является аспектом данного изобретения.

[0188] Наборы для обнаружения ДНК, которые содержат по меньшей мере один праймер ДНК достаточной длины из смежных нуклеотидов, полученных из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:9, который при использовании в способе амплификации ДНК дает ампликон, диагностический для ДНК объекта MON95275, или потомство, содержащее такую ДНК, является аспектом данного изобретения. Растение или семя кукурузы, геном которого будет продуцировать ампликон, диагностический для ДНК объекта MON95275, при испытании посредством способа амплификации ДНК, является аспектом данного изобретения. Анализ ампликона объекта MON95275 можно проводить с использованием ПЦР-системы Applied Biosystems GeneAmp™ 9700, Stratagene Robocycler®, градиентного термоциклера Eppendorf® Mastercycler® или любой другой системы амплификации, которую можно использовать для получения ампликона, диагностического для ДНК объекта MON95275, как показано в таблице 24.

[0189] Все публикации и опубликованные патентные документы, цитируемые в данном описании и являющиеся существенными для данного изобретения, включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были специально и отдельно указаны для включения посредством ссылки.

[0190] Проиллюстрировав и описав основные идеи данного изобретения, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что изобретение может быть изменено по схеме и деталям без отклонения от этих основных идей. Заявлены все модификации, находящиеся в пределах сущности и объема прилагаемой формулы данного изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЛЛС

<120> ТРАНСГЕННЫЙ ОБЪЕКТ КУКУРУЗЫ MON95275 И СПОСОБЫ ЕГО ОБНАРУЖЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

<130> MONS:480WO

<150> US 63/014 771

<151> 24.04.2020

<160> 26

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 50 нуклеотидов, представляющая 5’-участок соединения

геномной ДНК кукурузы и интегрированной

кассеты экспрессии трансгена.

<400> 1

ttcaggtctg tagcagccgg cccgatcaaa cactgatagt ttcccggtaa 50

<210> 2

<211> 50

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 50 нуклеотидов, представляющая 3’-участок соединения

интегрированной кассеты экспрессии трансгена и

геномной ДНК кукурузы.

<400> 2

atcatactca ttgctgatcc atgtaactat aacacagagg ctggccaacc 50

<210> 3

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 100 нуклеотидов, представляющая 5’-участок соединения

геномной ДНК кукурузы и интегрированной

кассеты экспрессии трансгена.

<400> 3

ccgtcccttt tttggcgcat gaagtttcag gtctgtagca gccggcccga tcaaacactg 60

atagtttccc ggtaactata acggtcctaa ggtagcgact 100

<210> 4

<211> 100

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 100 нуклеотидов, представляющая 3’-участок соединения

интегрированной кассеты экспрессии трансгена и

геномной ДНК кукурузы.

<400> 4

ctctttcttt ttctccatat tgaccatcat actcattgct gatccatgta actataacac 60

agaggctggc caacctggag gcgcagcggc gccacaaggt 100

<210> 5

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 200 нуклеотидов, представляющая 5’-участок соединения

геномной ДНК кукурузы и интегрированной

кассеты экспрессии трансгена.

<400> 5

gactccaatt ttttatgaag acgggtcaaa actcaacaaa tcaacggata ccgtcccttt 60

tttggcgcat gaagtttcag gtctgtagca gccggcccga tcaaacactg atagtttccc 120

ggtaactata acggtcctaa ggtagcgact taggctgagc ccgggcaggc ctacccataa 180

tacccataat agctgtttgc 200

<210> 6

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 200 нуклеотидов, представляющая 3’-участок соединения

интегрированной кассеты экспрессии трансгена и

геномной ДНК кукурузы.

<400> 6

ataacgctgc ggacatctac atttttgaat tgaaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt 60

ttctccatat tgaccatcat actcattgct gatccatgta actataacac agaggctggc 120

caacctggag gcgcagcggc gccacaaggt ccagatctcg ttcatcctgg ccacgttgct 180

cgcgactccg aggacgtgca 200

<210> 7

<211> 1226

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 1226 нуклеотидов, представляющая 5’-участок соединения

геномной ДНК кукурузы и интегрированной

кассеты экспрессии трансгена.

<400> 7

gaacatttgg cggaagaaca tgttttaagg gctagtttgg aagctcaatt ttcccaagag 60

attcttattt tcccaaggga aaataaacta atttcccttg tgaaaatgaa aatcccttgg 120

aataacgtgg ttcccaaact aaacctaagg gctttttttt atcattgtgt caaacagttt 180

accagctaat tttagtacct taacatttaa ataggtcagc taaaaaagta gctaattgtt 240

agccgaagaa ctgataaatt atttgtccat tagctatttg accttactaa tagatattaa 300

taaatcatat aaatagtcaa gtcttcaaat ataccctgac taatatttgc tagttaatta 360

tttattttct gattaattat tagccactgc taaacaataa gtcagtacga cccaaacaag 420

gcctagttac tactcctatc cataaaaaaa agttgtttga ccattttgac gccaaattta 480

accggcttat attaccaaaa tatttgaaaa aacattaaaa acagttgctg gttaaagtaa 540

attgtatgat aaactaaatc ggaatgaaaa taaataatag ttataatttt ttaataagat 600

gagccagtca aatttgacaa aaagttaaac cgatattctt tctggaacgg aaggagtaga 660

ctgtgttaat gttatgatat tgtgagcaag agagaagggg gtcgatagca acgacccaag 720

tgagtgggag gaggaaggtt ggggcgacga tgttgtgggg agggtgaagg atgatctaaa 780

taatattgtt cgctggattt gagtgagtaa gagcaacccc aacagtttag atataaatcc 840

tagctaaatt tagagtcttg ccaagagatt tttatttttt caaaaaaata gtttattttt 900

ctttgggaaa tagaaatctc ttggaacaat agtgttttta aactagtctt ggcgtttgta 960

aagaagatag atagactcca attttttatg aagacgggtc aaaactcaac aaatcaacgg 1020

ataccgtccc ttttttggcg catgaagttt caggtctgta gcagccggcc cgatcaaaca 1080

ctgatagttt cccggtaact ataacggtcc taaggtagcg acttaggctg agcccgggca 1140

ggcctaccca taatacccat aatagctgtt tgccaatcgt tcttcttggc gcgccgttgt 1200

caatcaattg gcaagtcata aaatgc 1226

<210> 8

<211> 1207

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 1 207 нуклеотидов, представляющая 3’-участок

соединения

интегрированной кассеты экспрессии трансгена и

геномной ДНК кукурузы.

<400> 8

aataacgctg cggacatcta catttttgaa ttgaaaaaaa attggtaatt actctttctt 60

tttctccata ttgaccatca tactcattgc tgatccatgt aactataaca cagaggctgg 120

ccaacctgga ggcgcagcgg cgccacaagg tccagatctc gttcatcctg gccacgttgc 180

tcgcgactcc gaggacgtgc aggccactcg tcgtagctct acctcggcag cctctgtcgc 240

gactccgagg acgtgcaggc cgcgcagctc gcgcgctcct tccgtgccct ctccggtttt 300

gtgattccct gcgccctctc cggcttcgcc gccgcatccg ggtttacgtg gtggtgggcc 360

accgcagtcc caccatccgc gaggcagcca gcagggcccc cgcgctcgac gataggctgc 420

tgaagcccct cgcccatcac cgtcttctgg ggcgtgccta ctgcgaggag gatggggtct 480

tccacaccat gccacaaggt gttcgacgct cgttccaact ccgacgcgca gcctgtctgc 540

tcgcccatca ccggccacct gtctggacgc gcagcctgct gcgtcaacat gctcagcagc 600

atcaactgct caagaagcta caccaacatc actcctcttc ctccacgggg gactggattc 660

gccattggta cctgctgctt catgctcaac caacaccctt cttgccaagg atgatggaga 720

ttatatgaac cggtgtttca gttggtgttg gaagtcccca tggttacatc cagatcagtc 780

ggaatttaga gacttcctcc aatggtcttc ttggcatttc caatttgtca ggtgcagagc 840

atcacagtta ccaattcctt ggccaccacc tataacattg cgtttggtta gagatgacct 900

tgttgtgatg ccagtgattc caagtatgct attgttatct cagtgctatt tcagtggagt 960

agaatgtgtg ctgacaacta tagatccatt attttctaaa ttttgtgctg agagagagct 1020

gttctggaag ccaccttggc aacctccagt tcctaacacc agatctgaga taccgttgtt 1080

gatagagttt gtccatctta ctacaggagt ctgtgatact ctgcatatgg ttactgaatt 1140

tcctaagcaa tactttgttg gcctgcttgt gctgattaca agggaatttt tcatgtctgg 1200

gagaata 1207

<210> 9

<211> 14682

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 14682 нуклеотидов, соответствующая трансгенной

вставленной Т-ДНК объекта кукурузы MON95275.

<400> 9

tcaaacactg atagtttccc ggtaactata acggtcctaa ggtagcgact taggctgagc 60

ccgggcaggc ctacccataa tacccataat agctgtttgc caatcgttct tcttggcgcg 120

ccgttgtcaa tcaattggca agtcataaaa tgcattaaaa aatattttca tactcaacta 180

caaatccatg agtataacta taattataaa gcaatgatta gaatctgaca aggattctgg 240

aaaattacat aaaggaaagt tcataaatgt ctaaaacaca agaggacata cttgtattca 300

gtaacatttg cagcttttct aggtctgaaa atatatttgt tgcctagtga ataagcataa 360

tggtacaact acaagtgttt tactcctcat attaacttcg gtcattagag gccacgattt 420

gacacatttt tactcaaaac aaaatgtttg catatctctt ataatttcaa attcaacaca 480

caacaaataa gagaaaaaac aaataatatt aatttgagaa tgaacaaaag gaccatatca 540

ttcattaact cttctccatc catttccatt tcacagttcg atagcgaaaa ccgaataaaa 600

aacacagtaa attacaagca caacaaatgg tacaagaaaa acagttttcc caatgccata 660

atactcaaac tcagtaggat tctggtgtgt gcgcaatgaa actgatgcat tgaacttgac 720

gaacgttgtc gaaaccgatg atacgaacga aagctaggcc tcagcgagta ccgctggcga 780

tctaatccat gatatcgtga acatcatcta cattcaaatt cttatgagct ttcttaaggg 840

catctgcagc atttttcata gaatctaata cagcagtatt tgtgctagct ccttcgaggg 900

cttccctctg catttcaata gttgtaaggg ttccatctat ttgtagttgg gtcttttcca 960

atcgtttctt ctttttgagg gcttggagtg caactctttt atttttcgac gcatttttct 1020

ttgcgctcct gcaggcggcc gcgtggatga ggagttaatc ggtcgtgtga gagtagtgat 1080

cgagtggatg tcgtcgagag tgatgagtgt tgatgttgtt agtgatatgt ggtagaaggt 1140

atcgtgataa agcgttaacg cgatcgcagt acttgcaaag aaaaatgcgt cgaaaaataa 1200

aagagttgca ctccaagccc tcaaaaagaa gaaacgattg gaaaagaccc aactacaaat 1260

agatggaacc cttacaacta ttgaaatgca gagggaagcc ctcgaaggag ctagcacaaa 1320

tactgctgta ttagattcta tgaaaaatgc tgcagatgcc cttaagaaag ctcataagaa 1380

tttgaatgta gatgatgttc acgatatcat ggatggtatc gcacagcgac tgctgaggga 1440

cgtcgagctc ccgcttggta tctgcattac aatgaaatga gcaaagacta tgtgagtaac 1500

actggtcaac actagggaga aggcatcgag caagatacgt atgtaaagag aagcaatata 1560

gtgtcagttg gtagatacta gataccatca ggaggtaagg agagcaacaa aaaggaaact 1620

ctttattttt aaattttgtt acaacaaaca agcagatcaa tgcatcaaaa tactgtcagt 1680

acttatttct tcagacaaca atatttaaaa caagtgcatc tgatcttgac ttatggtcac 1740

aataaaggag cagagataaa catcaaaatt tcgtcattta tatttattcc ttcaggcgtt 1800

aacaatttaa cagcacacaa acaaaaacag aataggaata tctaattttg gcaaataata 1860

agctctgcag acgaacaaat tattatagta tcgcctataa tatgaatccc tatactattg 1920

acccatgtag tatgaagcct gtgcctaaat taacagcaaa cttctgaatc caagtgccct 1980

ataacaccaa catgtgctta aataaatacc gctaagcacc aaattacaca tttctcgtat 2040

tgctgtgtag gttctatctt cgtttcgtac taccatgtcc ctatattttg ctgctacaaa 2100

ggacggcaag taatcagcac aggcagaaca cgatttcaga gtgtaattct agatccagct 2160

aaaccactct cagcaatcac cacacaagag agcattcaga gaaacgtggc agtaacaaag 2220

gcagagggcg gagtgagcgc gtaccgaaga cggtcgtacg gaaaatagag agagatagat 2280

ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata 2340

tagaggaaga gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 2400

tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc 2460

tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tgaacgatag 2520

cctttccttt atcgcaatga tggactttgt aggagccacc ttccttttct actgtccttt 2580

ccatgaagtg acagatagat gggcaatgga atccgaggag gtttcctgat attacccttt 2640

gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata ttcttggagt 2700

agacgagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta 2760

aaagactctg tatgaactgt ccgccagtct tcacggcgag ttctgttaga tcctcgatct 2820

gaatttttga ctccttgctg atggacggtg tggagggagg tgctttcgtg cttggcggca 2880

tgcacgggta atcggcaacg catgtgtgct ttgagcgttg cctggttgtc atgggataca 2940

ggacaacaac catcgtcatg tggagatcga tcgagatata ggatcggagc aagttgacaa 3000

atcatgtcaa aatcactcaa cgaggtagca tgttgtataa acagatcaat gcagaaatac 3060

attagtgcta gctggaattg ttccgatcag ctggcgctat tattatttta tcgaaactga 3120

tgcgtgtgcg tgctcgcctt attttgtgtt ctgcgggggc ggctcccgcg aatacctatt 3180

atttctgtga gcgctccctt caaaagtgac atgattttat atatccctct acgatacgac 3240

gaccagatca agctaccact accaccgaaa tcaggacctc tgctaaccgg tggcccagac 3300

cggacaaaag ttattgcatt gtatatgggt agggtttatg tccattttac atcgcgcata 3360

gtacgcacaa tttctgttgg cccatcaata tataccgagt gtgctgcagc ctatagtgat 3420

agagttttac ttaattctaa gcctaggatc cgaacagtga ttggaaatcc ttagttacag 3480

tctgacagta taaaggtcac tctcactacc tggtagtaga gccatgaccc ggtgctgata 3540

tcactatcag gtacagccat aaccacagtg ctagtggaaa tatcactacg tactaggcca 3600

atctataatc tgatgagaac acatatagtt gacatagtcg atacgtaccc atgttatgag 3660

tcccgagtga ctgtcaagga catgatttga gttttggtaa gtgtgtgttg gacaaatcga 3720

agcatgagta gggttcatgg cctgtgattt gtactagtct aactaactaa attatcgtgt 3780

acaaccgttg atctgagagg gtcccgcgct gcaaatctat tgtaatactc cctgtcgtaa 3840

tactgtgtta atttgtgctc agtcggacgg ctcagacttt acggtgatat aaacctttac 3900

tgagctgaac tcgacctgga gatcgaatcg accccgcagg tgttccgaag cgtaccacgg 3960

cgagcgttag gtctaagcaa aagccacacc cttcacagaa cgaaggagtt tcgcgaagtc 4020

acgctgattt aaaaagagcg ggccactttt tccactcttg gtcaacagaa aaaggcggac 4080

gagttcagat ttaaggccag ctgcacgccg atcagcagat tcgacgttac ccgcggagag 4140

aaggctgcct gctacttccc agtcgaaagt ggtgtagttc aagtgatctc taaagctaag 4200

gctccgctgg tcctagtcgt taattaccga gcagctctcc ggcgtacaga accacgaagt 4260

tacttcttga ggtgaagcgt aagtggtggt gagggtaagt agttggaagc agaagcctta 4320

agtgatacaa tctggcttcc accttgtcgg aactcgttaa aatttccctt gattacaata 4380

taagtacctg cctgatcgtt ctggtagcct gatcgatttt tatttttggg ctacgggcaa 4440

ttgctcgcaa tttattgaag tcgcacgggc gcgaaagaag acgttgttct ctctgcttgc 4500

tagaagccgc ggataagcga ttctatccga tatttaagac ccgtgtagac cagcagacgt 4560

gagtgggccg tttccagaaa ccgtctctcc ttgcgacgat agatccgata gtaagtaact 4620

tcacccctga tcaacggcgt agtcgcctgt ctggttcgga tctgtataga tttggcggat 4680

tccgcttgcg aaatctttag cagcttaggt ccggagcccc cggtggatct ggctgttcag 4740

cggcacggtc caatctcctt agctcctctg tgaacagcag tcgaactcta agattcttga 4800

tacgcgcaac acgggccttg gcgagcctgg ggataactcg cgaggacgct ctcgccgcgc 4860

taaagcgtgc gatcacaccg ctccgacaag tgactttgcc aaatctagaa agagagacta 4920

cactgcttgc cggtgcagtc ttgatccacc ttggaggggc tgacgctaac taactaaggc 4980

gcgcctgcct actaggcctc gacccttgtt cgtcactgct gacgtctttt tctccattat 5040

tggaggatga gtcactgcaa gctgtaaagc ttgtattatt gctagtggag gccccacctg 5100

cacatgccga gcaattatga ttgtcggcca gtagcttttt gagctgtttg cagagcaata 5160

acttagtgga tgtccccacc attacatcgt tattgatgat gctttcttca aaggaagata 5220

agatgctgac atcctgtctg gagattgtcg ctccatagtg actcgtgatc aatactcttt 5280

catgtgagta attgattttt atctttgttt ctccgttgat ggcctactag gccaaatgga 5340

tgaaacaact tggaccaatc agagatggcc acgtcagctc ccgatcgtcg taaccgacca 5400

aacccgatcg ataacggttt aggctccaat acaccgtcgg taccacccgg tcgctatcat 5460

ctgcccccgt cccaacgcta ttggtatcgt ccgcccctat atcggtcggt agcccagtcc 5520

accgtcgggg ccaatcgtcc cctgctgcgt ccgctcgtgt cggtaccgat cgccaaaaac 5580

gccacgtcaa cggcactgcg gtaccgaccg ccgctggcac cggccttagc gggccacacg 5640

accgatcgct gttgtacgga cgtagaggtg aatcatgcga ttgaattttc gctagaggaa 5700

agttatcatc ttattatctc caaccctcct tcctacggct ggatccgacg aaaatttacc 5760

ctggacggtg ccagtaacaa ttgcaggtct cactcacgtg ctaaatccag caatcaaaca 5820

cgaaggaata tacgtgatct ggccagaaca tgcaagagaa taatacagta gtgttagagt 5880

acgaaaccta cacgattcaa cgaattaatc aatgggttca cgttcacggg tatgctcgcg 5940

cacgtccaaa atccaacgac atttttataa gcggcatgat ccagacgggc cagctcgagc 6000

accacatggc gtggctccat ctcgcatccc ccatcaccgc tataaatacc attggccatg 6060

cacacccgca ctcccacaca gcacaagcag cagcagcagc agcagctcga tcgaactagc 6120

ttagctacta cgtgcgcgtg caacaagcag ctcgatcgat cgccctcacg gtaatttctt 6180

ctcccaaaat aaacctaatc tttaatctgt tgcctgtcta ctcttcctat ctgttgctaa 6240

aaatttgaat ttggtatgtg caggaggact taattaaggg acccaccgcc atgtcatcca 6300

cggacgtgca agagcgcctg cgggacttgg cgcgcgaaga cgaggcggga acgttcaacg 6360

aggcttggaa caccaacttc aagccgtcgg acgagcagca attcagctac tcgccgacgg 6420

agggaattgt cttcctcacg ccgcctaaga acgtcatcgg tgagcggcgc atctcccagt 6480

acaaggtgaa caatgcctgg gcaactctgg agggctctcc caccgaggcg agcggtacgc 6540

cgttgtacgc gggcaagaat gtactggaca actcgaaagg cacaatggac caggagttgc 6600

ttacacccga gttcaactac acctacacgg agagcacgag caacacgacg acgcacggcc 6660

tcaaactcgg cgtgaagacc accgcgacca tgaagttccc tatcgctcaa ggctcgatgg 6720

aggcgagcac cgagtacaat ttccagaact cctccaccga taccaagacc aaacaagtgt 6780

cttacaagtc tccgagccag aagattaagg ttcctgcggg caagacgtac cgcgtgctgg 6840

cgtacctgaa caccggctct atctctggcg aggctaacct gtacgcgaac gtcggcggca 6900

tcgcgtggcg ggtctcgcca ggctatccta acggcggcgg cgtgaacatc ggcgctgtcc 6960

tgaccaagtg ccagcagaag ggttggggcg acttccgcaa cttccagccc tccgggcgcg 7020

acgtcatcgt gaagggtcag ggcaccttca agtccaacta cggcaccgac ttcatcctta 7080

agattgagga catcaccgac agcaagctcc gcaacaacaa cggctccggg acggtcgtac 7140

aggagatcaa ggtgccactc atccgcaccg agatttgata ggggtccccg gtccgatgaa 7200

gtgccatcat gccatggatg cggggtgaaa gctcgcggcg tcgaatataa tctccggttc 7260

cagtttcagc tactatggcg actcgtgtcg tgtgtgtgtg gttactctgc ttttgtatgt 7320

ttggtaatgg tgtgtgcgct gttgtccaga gtttcatggt ggtactgctt cctagcagtg 7380

ttgtgtacta gtctcggtac tttgcctgta tgttgagctc ggctcagtat gttctgggag 7440

tgaataaata aaaataaaaa aaaccagata ttgtagtata ctaactgccg ttgctctgtt 7500

tcatccacat acacagaatc ctatgaactg atctttgtgg ggacttggga gccatctgct 7560

cggatcttct tcatgggatt ctctcaattt ctcctcattt ttctaaggct gtgtgtttag 7620

atgtagggag aaaagttttt ggattgtaca tcgtgttggg tactaattta gtctactact 7680

ccgtccgtga atagatgaca ttttctttcg gtgttgttcg tcgtgccaca aagttttgaa 7740

tttatttata tgcaatcctg caggtgttta aacacctgca ggtctgcatg ttcagttagc 7800

acaagcaggt tgcagcttca ccaaacacat acagtcggcc attgctgctt caccaaacat 7860

aaacactacc tgttggagct acaccaaaca cttgcactga ccaaagaaca ttaatagatc 7920

atcaggactg ttcaagtaat cacgcatgac aagatagaaa gcagcaggtc cccttccttc 7980

tcaaagtagc ctgcagcttc attctttggt tcaccattac ataaacagca aaaccagaaa 8040

tagcagacaa taattcctcc tctaggtaaa taaccagaca cagtaatacc ctcacaagta 8100

ccacttatta ggacagtaca atacaaatga tagcaagggg cagatcaaga atcacaacac 8160

agaagccaca aaacatgata agcgcagcag accaaaagct tcttctcaaa gggcgcccgg 8220

accgtcagtt gttggtctgg ctgtacatga catccgactt ctgaatccac ttgtgtagca 8280

ccttcaggtc cttcccgccg accgtcgccc agagctctac gctagcatct ttcgtcgggt 8340

aggtcccgcc gttagggttc ttgagattaa acgtaatctg gaacaagaac gggctcggct 8400

tgctgacggt ctggaccttc ttgccgttca cgcggatctt gtagctcgac acgttgttgt 8460

agaagatgtc gggcagcttg tacaggctga ggccggagta caggtttgga ttctctgaga 8520

gataccacca gcctgagaat ttgtgggcgt cgatcataac tttctcgatc tcggactcgc 8580

caagctcagc gactttcact ttgaggttgt cgttcttctc gtcaacggcg tagagctcca 8640

taggcgtgat cgcagtgatg ctgccgtacg tcaccgtccg cttcccgttg gcgtccagag 8700

gcggcgcagg gatgatgcta ccgaggcggc cgttgatctt ccactggtat cggatcttgc 8760

tactcggcac gcgagtgaac gtggcaccga tcaccatctc gtcgttggag ccgaaggacc 8820

acttctcaaa gatgtgtttc ttctgcaggt tctcgttggt cttccactcg atcacggaga 8880

catcgtcgaa gtgcaggttg gcgttcccgt tattcttcag gccgatgatc ttgaagtatt 8940

cagggttatt gaacgtgttg aaggagaact ccgctatctt ccacttcccg ccggtcacct 9000

tcccggaaac cttcgcgcct tgcccgttgc cggagctgtt gtcagcgtag aagacgacct 9060

cgttgctccc agtggtgctg gcggtgcgca cgtacgcccg cacagtgtag gaggtgtatg 9120

gcttcagctg cgggtttgac atcgccgtgc cgtgcccgtc agtgccgatc cgcccgcgct 9180

tcttgccggt gtagcctccg gattcttggt aggtgtagta ccacaggttc tctgaggtct 9240

cgaagtcgta gtacttgatc gggacgtgta gcgtgatctt catgccgcgc ttccacttca 9300

cgtcgtacac cgtcttgccg ggcatctggt tcagctggcg ctcgatttct ttcttcgtgt 9360

tctcgtccgt gatgaggttg atggaaggct catcaatgaa gatgtccttc tcaccctggt 9420

ccgtgtagta cagtctgccg tccttctcct gagcgttaaa cgccttcttg atggcctcct 9480

tgatggtgat ctccggagtc ttgtcctccg gatcgttcat gttcttcgcc gcgacccggc 9540

gctcgaggct atccttgccc gtgccgaggt taagagtaag gctcccactg acagcgtcaa 9600

tgtttgtccg gatcgggtcc cactcgcctc cgggtatcac ctggcctttc tcgtcgagga 9660

taccgtactg gccgcggttc tgcgtagtct cgatgttgag aatctccgtg cccgcctgga 9720

tcttgtccag ctgctcggcg ttgatcgcta tcttcacggt gcccgcctcg ttggccttgt 9780

ctagggagat aggagcctgg cccttctgcg gataggtgtc gccggcaccg agcgagttgc 9840

cgatctggtt agggccggcg gtgatcgtgg tgatgctgtc gcctgagttc tggaagacga 9900

agttggtggt cggcttcagg tcgtagatgg gcgcggtgcc accattgtaa tagcgcacgt 9960

tcgcgttgag atacgccctc tcggcagtgt tgatccctat ctgcgaactc caggtagtag 10020

agtcggtgtc ggccacactt gtggacgacg accagctgtg ggtgtacttt ggtgagattg 10080

agaaactgaa gcccttgtcg ctgaagccca ggctgccgcc gatctcgacg gtgttggtcg 10140

tggtgtcggt cttagttgta gtcttgctct ttgtatccgc gttgccctcc gtcaccgtat 10200

cgttcttgct gaagtggagc ttctccattc cgacgccaac ggagggatag gcggccacta 10260

gaggatcgcg cgcctcatac ttcgtagcag cgggcatgtg cccagtcacc ttctcgaagt 10320

cggtgtacgg gtctttgacc gtacgggcgt ggtaagggtt gctcacgtac ttcttgtagc 10380

cttctgcact gtaggcgtcg ttccacggca cgatctgctg gttacggaag gtgtatcctt 10440

tctcttccca ttcatcaggg atgcagtcgt tgtcggtgtc caccggcgtg gacatcgact 10500

gcttctcgcc gttctcttgc tggcggtcga agaggttgta gttcgggaag aagctctggg 10560

tctccttctc cgcgagagag ttcgccttct cgctgaaatt cgggctcagt atgtacttct 10620

ccgggatctg ttccttctgc gcgttgttca tcgaccagaa gagctgtagg tccggcaggg 10680

tgttggaggt gttcctgtac tcgatcttaa tctcgtagac ctggtttgcc tctagtttga 10740

ggttcttctg gatgctcgcc tggttgatga ccgtctcgcc attgatctgg aggattacgt 10800

tctcgtcgga ggatgtggag aggcggtact cgccggtctg cgggctcttc aggttgccca 10860

tccaccgaat ggactggatc tgctgggcgt ccgtgttgat gcgagccttg ttcatgaggt 10920

tggacttctc gcccacctgg atgaacatga gctccttgaa ggttgagtcc ttgaagtaga 10980

agccgaccag gccgatgacc gtcgcttgct cactcttgga ggagacaatg ttctgcatgg 11040

tggtggccgg ccaagtaacg gtccgctacc ctgcaagagg tagcaaaaaa ggggtatcag 11100

ttaacagcaa gtgtatcctg ctagatagta gctgtacaag ggaaccagta agcatcgtaa 11160

acataaaagt tttgaaggca tatcaactga acctttatat ttgtgcatct ataagtcaat 11220

aaaaacaaca tatgtacaga gcttactgcc aggcaaaagt gggattcatt tcaccgacta 11280

ggctaatgtt gtactccctc cgttccaaat tgtaggtcgt tttgactttt ctagattcat 11340

agatattatt atgcacctag acatacacta tatctagatg cataataata tctatgaacc 11400

tacaaaagtc aaaacgacct acaatttgga acggagagag taagaaataa tctgataact 11460

tgcggactgt tgtttccaac atttataaaa atgtgtaaag taccataacc aaacattcgt 11520

ataactaaac atgataggaa aagactagca ttgctttgaa aaagtagtgt acatgtactg 11580

gccaatctaa caagcttttt tgttgtctaa aatgtgacct gcagagcaac aaaaatcaca 11640

tgctgaactt ttcagcctaa catttggtgc catgaaacat cactaagttg tcactaattt 11700

tgggtggtat gtgctcaata gctattcatg acaaggaaac atcctaacat gcagatatgc 11760

tttccaaata gctctctccg aatgaaccac acacggattt ttacactctg gtagttcaat 11820

cacaccaaat taactatccg cgactttcat ccaaccatgt taccagttac cgcaactatc 11880

tggacttgct agacagagca tcacgaagct ctcccagact cccagtcaag caggaaacta 11940

gaacgtcgga gctgggaagt agtcaagcag tcacacccca agggctcgtg catcgccagc 12000

aacacgtaag cgcattcagg cacatcacag tcaccattcc taggtacgta gctcagagag 12060

cctcctcgca cggcagtccc gcaaacacac atcaggcgtg cgcacaaaat cagacgcatc 12120

ggcacgcaga aacgctacag atcaggaaca ggacggagtt catcaagcac agacgtcaga 12180

cgaacaccct agcaccaacc acgaagcacg atccgctggc ggatcgcgcg gtacccgccc 12240

cggatctggc gggagcaccg gaggcaagtg accagaacgc atgagcaaac cgcagatctc 12300

gagccaggcc gctcagatct gagcgccaaa cactcgaaaa atgctggagc aggagctagt 12360

gcgtggggag atcgcgagta gaggggctcc agggagcgga ggggaggggg aggaggagat 12420

taccggggag gccggcctgc tgcagagtac agaaagcact tgcttgatca ctagcgcgaa 12480

gcagaggtgt gcctgccctt agtattaact gatcactaag cgcttgtgat ggttcgtggt 12540

ggcgcttgat tgttgcattt ataggagaac catcggcgca gtgccgatta ttgtaatagc 12600

agtgttgttg tgtgagttta cattcccgtg agcatgagtg catgtgaggg cgattattaa 12660

ttagatggct gatcaatgca gaacagcgca agtggccaag attgctccac tggtggatgc 12720

atgttgatgt ttgttctcgc ttgatggttg atcattttta ttcagtttag gacgaacttg 12780

tcatatgggt tggctgcttg tatctagtaa cgtgatcgag tgctaaacat cagcagaggt 12840

atcatggtga tgcatggacg gtggacgccc aagttgttga acagttgaag tatttttttt 12900

tctgcacttc acgggatcca agcgcagagc tatgcataat tgcatatagc ggtgggtacg 12960

ggtgcaccct tgcatggtaa aactgaatgc gctcagaagg caattgcaat cactaaaatt 13020

tgctttagct ctgttcctga tcgggtcaag gtttattatg ttcagttgga acattcaaag 13080

ttagaggctt gaatttgctt aaaaagcatt cccacaaaca acggtgggtg ccctttttgt 13140

atgacgtact gttggctaga tggttccgct tgtttatgaa aaaagagtgt actaataaat 13200

ttacccgaac tcttcactac cgcagataac tcttttgccg agtgcttcat gcacttcaca 13260

aagtccagaa aacacttggc aagctccaag cttaagaaac ataaatgacg tgcataagtt 13320

caaaaatagt ttaatacaag actaagatgt ccaaaagaac ggtaaattat attaaaataa 13380

tacttcttat aatagatcaa tgctatcgaa tagcccactt cactctttaa gcatacataa 13440

attttcaatt atatcataaa atttctacgt cctactgcgt ttcaaccata tttcagcatg 13500

acaattatag taatacaaaa caagaattga attgcttgaa tgtaaatgtt caaagtaaag 13560

aaggattatt aatatgatga tgttttatcg agatatcaga gagtcaacac tcctcattga 13620

tccttgttag agcacccatg taagtgtgtc gctccccctt catccgtgca agcaggatca 13680

aatgctctct agaaggaacg tgggcatcta agagagggat gaatccgaac ataactggga 13740

tttttggagg attctgatga aaccatttac cctaacttga gataactgga gtaaaagatc 13800

cttactgtcc accatttctt gtgatgggtt aaaatccctc ttgccggaga gacctatctc 13860

tatcaggtga tatgcctggt agctgtttcc ttcttcccaa tctggcaggc ccttgttcgt 13920

cactgctgac gtctttttcc tcattattgg aggatgagtc actgcaagct gtaaagcttg 13980

tattattgct ggtggaggcc ccaccttcac atgctgagca tttatggttg tcggccaata 14040

atttcttcag ctgtttgcaa agcaataatt ttgtagatgt ccctacatca actttggcat 14100

gtgcaatgct ttcttcaaag gaagataaga tgtcaacatc ttgtctggag attggtgctc 14160

cgtagtgact catgatcaat acctttttct gtgcgtaatt gatcttgatt tttgtcttcc 14220

cgtcgatggc gcgccaagaa gaacgattgg caaacagcta ttatgggtat tatgggtagg 14280

cctgcccaaa ctagggataa cagggtaata ggtctcacgc ggcaaatcct accacctcat 14340

ttaaatagag tgaggttgat ttgcggccgc tataacttcg tataatgtat gctatacgaa 14400

gttatgtcga ctcgtggtgg ccgcatcgat cgtgaagttt ctcatctaag cccccatttg 14460

gacgtgaatg tagacacgtc gaaataaaga tttccgaatt agaataattt gtttattgct 14520

ttcgcctata aatacgacgg atcgtaattt gtcgttttat caaaatgtac tttcatttta 14580

taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa aattggtaat tactctttct 14640

ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg ta 14682

<210> 10

<211> 16861

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 16861 нуклеотидов, соответствующая

нуклеотидной последовательности contig 5' геномной фланкирующей нулеотидной

последовательности ДНК, вставленной последовательности нуклеотидов Т-ДНК в

объекте

MON95275, и 3'-геномной фланкирующей нуклеотидной последовательности.

<400> 10

gaacatttgg cggaagaaca tgttttaagg gctagtttgg aagctcaatt ttcccaagag 60

attcttattt tcccaaggga aaataaacta atttcccttg tgaaaatgaa aatcccttgg 120

aataacgtgg ttcccaaact aaacctaagg gctttttttt atcattgtgt caaacagttt 180

accagctaat tttagtacct taacatttaa ataggtcagc taaaaaagta gctaattgtt 240

agccgaagaa ctgataaatt atttgtccat tagctatttg accttactaa tagatattaa 300

taaatcatat aaatagtcaa gtcttcaaat ataccctgac taatatttgc tagttaatta 360

tttattttct gattaattat tagccactgc taaacaataa gtcagtacga cccaaacaag 420

gcctagttac tactcctatc cataaaaaaa agttgtttga ccattttgac gccaaattta 480

accggcttat attaccaaaa tatttgaaaa aacattaaaa acagttgctg gttaaagtaa 540

attgtatgat aaactaaatc ggaatgaaaa taaataatag ttataatttt ttaataagat 600

gagccagtca aatttgacaa aaagttaaac cgatattctt tctggaacgg aaggagtaga 660

ctgtgttaat gttatgatat tgtgagcaag agagaagggg gtcgatagca acgacccaag 720

tgagtgggag gaggaaggtt ggggcgacga tgttgtgggg agggtgaagg atgatctaaa 780

taatattgtt cgctggattt gagtgagtaa gagcaacccc aacagtttag atataaatcc 840

tagctaaatt tagagtcttg ccaagagatt tttatttttt caaaaaaata gtttattttt 900

ctttgggaaa tagaaatctc ttggaacaat agtgttttta aactagtctt ggcgtttgta 960

aagaagatag atagactcca attttttatg aagacgggtc aaaactcaac aaatcaacgg 1020

ataccgtccc ttttttggcg catgaagttt caggtctgta gcagccggcc cgatcaaaca 1080

ctgatagttt cccggtaact ataacggtcc taaggtagcg acttaggctg agcccgggca 1140

ggcctaccca taatacccat aatagctgtt tgccaatcgt tcttcttggc gcgccgttgt 1200

caatcaattg gcaagtcata aaatgcatta aaaaatattt tcatactcaa ctacaaatcc 1260

atgagtataa ctataattat aaagcaatga ttagaatctg acaaggattc tggaaaatta 1320

cataaaggaa agttcataaa tgtctaaaac acaagaggac atacttgtat tcagtaacat 1380

ttgcagcttt tctaggtctg aaaatatatt tgttgcctag tgaataagca taatggtaca 1440

actacaagtg ttttactcct catattaact tcggtcatta gaggccacga tttgacacat 1500

ttttactcaa aacaaaatgt ttgcatatct cttataattt caaattcaac acacaacaaa 1560

taagagaaaa aacaaataat attaatttga gaatgaacaa aaggaccata tcattcatta 1620

actcttctcc atccatttcc atttcacagt tcgatagcga aaaccgaata aaaaacacag 1680

taaattacaa gcacaacaaa tggtacaaga aaaacagttt tcccaatgcc ataatactca 1740

aactcagtag gattctggtg tgtgcgcaat gaaactgatg cattgaactt gacgaacgtt 1800

gtcgaaaccg atgatacgaa cgaaagctag gcctcagcga gtaccgctgg cgatctaatc 1860

catgatatcg tgaacatcat ctacattcaa attcttatga gctttcttaa gggcatctgc 1920

agcatttttc atagaatcta atacagcagt atttgtgcta gctccttcga gggcttccct 1980

ctgcatttca atagttgtaa gggttccatc tatttgtagt tgggtctttt ccaatcgttt 2040

cttctttttg agggcttgga gtgcaactct tttatttttc gacgcatttt tctttgcgct 2100

cctgcaggcg gccgcgtgga tgaggagtta atcggtcgtg tgagagtagt gatcgagtgg 2160

atgtcgtcga gagtgatgag tgttgatgtt gttagtgata tgtggtagaa ggtatcgtga 2220

taaagcgtta acgcgatcgc agtacttgca aagaaaaatg cgtcgaaaaa taaaagagtt 2280

gcactccaag ccctcaaaaa gaagaaacga ttggaaaaga cccaactaca aatagatgga 2340

acccttacaa ctattgaaat gcagagggaa gccctcgaag gagctagcac aaatactgct 2400

gtattagatt ctatgaaaaa tgctgcagat gcccttaaga aagctcataa gaatttgaat 2460

gtagatgatg ttcacgatat catggatggt atcgcacagc gactgctgag ggacgtcgag 2520

ctcccgcttg gtatctgcat tacaatgaaa tgagcaaaga ctatgtgagt aacactggtc 2580

aacactaggg agaaggcatc gagcaagata cgtatgtaaa gagaagcaat atagtgtcag 2640

ttggtagata ctagatacca tcaggaggta aggagagcaa caaaaaggaa actctttatt 2700

tttaaatttt gttacaacaa acaagcagat caatgcatca aaatactgtc agtacttatt 2760

tcttcagaca acaatattta aaacaagtgc atctgatctt gacttatggt cacaataaag 2820

gagcagagat aaacatcaaa atttcgtcat ttatatttat tccttcaggc gttaacaatt 2880

taacagcaca caaacaaaaa cagaatagga atatctaatt ttggcaaata ataagctctg 2940

cagacgaaca aattattata gtatcgccta taatatgaat ccctatacta ttgacccatg 3000

tagtatgaag cctgtgccta aattaacagc aaacttctga atccaagtgc cctataacac 3060

caacatgtgc ttaaataaat accgctaagc accaaattac acatttctcg tattgctgtg 3120

taggttctat cttcgtttcg tactaccatg tccctatatt ttgctgctac aaaggacggc 3180

aagtaatcag cacaggcaga acacgatttc agagtgtaat tctagatcca gctaaaccac 3240

tctcagcaat caccacacaa gagagcattc agagaaacgt ggcagtaaca aaggcagagg 3300

gcggagtgag cgcgtaccga agacggtcgt acggaaaata gagagagata gatttgtaga 3360

gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga 3420

agagtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt acgtcagtgg agatatcaca 3480

tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt 3540

gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga tagcctttcc 3600

tttatcgcaa tgatggactt tgtaggagcc accttccttt tctactgtcc tttccatgaa 3660

gtgacagata gatgggcaat ggaatccgag gaggtttcct gatattaccc tttgttgaaa 3720

agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atattcttgg agtagacgag 3780

agtgtcgtgc tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg tcattgagtc gtaaaagact 3840

ctgtatgaac tgtccgccag tcttcacggc gagttctgtt agatcctcga tctgaatttt 3900

tgactccttg ctgatggacg gtgtggaggg aggtgctttc gtgcttggcg gcatgcacgg 3960

gtaatcggca acgcatgtgt gctttgagcg ttgcctggtt gtcatgggat acaggacaac 4020

aaccatcgtc atgtggagat cgatcgagat ataggatcgg agcaagttga caaatcatgt 4080

caaaatcact caacgaggta gcatgttgta taaacagatc aatgcagaaa tacattagtg 4140

ctagctggaa ttgttccgat cagctggcgc tattattatt ttatcgaaac tgatgcgtgt 4200

gcgtgctcgc cttattttgt gttctgcggg ggcggctccc gcgaatacct attatttctg 4260

tgagcgctcc cttcaaaagt gacatgattt tatatatccc tctacgatac gacgaccaga 4320

tcaagctacc actaccaccg aaatcaggac ctctgctaac cggtggccca gaccggacaa 4380

aagttattgc attgtatatg ggtagggttt atgtccattt tacatcgcgc atagtacgca 4440

caatttctgt tggcccatca atatataccg agtgtgctgc agcctatagt gatagagttt 4500

tacttaattc taagcctagg atccgaacag tgattggaaa tccttagtta cagtctgaca 4560

gtataaaggt cactctcact acctggtagt agagccatga cccggtgctg atatcactat 4620

caggtacagc cataaccaca gtgctagtgg aaatatcact acgtactagg ccaatctata 4680

atctgatgag aacacatata gttgacatag tcgatacgta cccatgttat gagtcccgag 4740

tgactgtcaa ggacatgatt tgagttttgg taagtgtgtg ttggacaaat cgaagcatga 4800

gtagggttca tggcctgtga tttgtactag tctaactaac taaattatcg tgtacaaccg 4860

ttgatctgag agggtcccgc gctgcaaatc tattgtaata ctccctgtcg taatactgtg 4920

ttaatttgtg ctcagtcgga cggctcagac tttacggtga tataaacctt tactgagctg 4980

aactcgacct ggagatcgaa tcgaccccgc aggtgttccg aagcgtacca cggcgagcgt 5040

taggtctaag caaaagccac acccttcaca gaacgaagga gtttcgcgaa gtcacgctga 5100

tttaaaaaga gcgggccact ttttccactc ttggtcaaca gaaaaaggcg gacgagttca 5160

gatttaaggc cagctgcacg ccgatcagca gattcgacgt tacccgcgga gagaaggctg 5220

cctgctactt cccagtcgaa agtggtgtag ttcaagtgat ctctaaagct aaggctccgc 5280

tggtcctagt cgttaattac cgagcagctc tccggcgtac agaaccacga agttacttct 5340

tgaggtgaag cgtaagtggt ggtgagggta agtagttgga agcagaagcc ttaagtgata 5400

caatctggct tccaccttgt cggaactcgt taaaatttcc cttgattaca atataagtac 5460

ctgcctgatc gttctggtag cctgatcgat ttttattttt gggctacggg caattgctcg 5520

caatttattg aagtcgcacg ggcgcgaaag aagacgttgt tctctctgct tgctagaagc 5580

cgcggataag cgattctatc cgatatttaa gacccgtgta gaccagcaga cgtgagtggg 5640

ccgtttccag aaaccgtctc tccttgcgac gatagatccg atagtaagta acttcacccc 5700

tgatcaacgg cgtagtcgcc tgtctggttc ggatctgtat agatttggcg gattccgctt 5760

gcgaaatctt tagcagctta ggtccggagc ccccggtgga tctggctgtt cagcggcacg 5820

gtccaatctc cttagctcct ctgtgaacag cagtcgaact ctaagattct tgatacgcgc 5880

aacacgggcc ttggcgagcc tggggataac tcgcgaggac gctctcgccg cgctaaagcg 5940

tgcgatcaca ccgctccgac aagtgacttt gccaaatcta gaaagagaga ctacactgct 6000

tgccggtgca gtcttgatcc accttggagg ggctgacgct aactaactaa ggcgcgcctg 6060

cctactaggc ctcgaccctt gttcgtcact gctgacgtct ttttctccat tattggagga 6120

tgagtcactg caagctgtaa agcttgtatt attgctagtg gaggccccac ctgcacatgc 6180

cgagcaatta tgattgtcgg ccagtagctt tttgagctgt ttgcagagca ataacttagt 6240

ggatgtcccc accattacat cgttattgat gatgctttct tcaaaggaag ataagatgct 6300

gacatcctgt ctggagattg tcgctccata gtgactcgtg atcaatactc tttcatgtga 6360

gtaattgatt tttatctttg tttctccgtt gatggcctac taggccaaat ggatgaaaca 6420

acttggacca atcagagatg gccacgtcag ctcccgatcg tcgtaaccga ccaaacccga 6480

tcgataacgg tttaggctcc aatacaccgt cggtaccacc cggtcgctat catctgcccc 6540

cgtcccaacg ctattggtat cgtccgcccc tatatcggtc ggtagcccag tccaccgtcg 6600

gggccaatcg tcccctgctg cgtccgctcg tgtcggtacc gatcgccaaa aacgccacgt 6660

caacggcact gcggtaccga ccgccgctgg caccggcctt agcgggccac acgaccgatc 6720

gctgttgtac ggacgtagag gtgaatcatg cgattgaatt ttcgctagag gaaagttatc 6780

atcttattat ctccaaccct ccttcctacg gctggatccg acgaaaattt accctggacg 6840

gtgccagtaa caattgcagg tctcactcac gtgctaaatc cagcaatcaa acacgaagga 6900

atatacgtga tctggccaga acatgcaaga gaataataca gtagtgttag agtacgaaac 6960

ctacacgatt caacgaatta atcaatgggt tcacgttcac gggtatgctc gcgcacgtcc 7020

aaaatccaac gacattttta taagcggcat gatccagacg ggccagctcg agcaccacat 7080

ggcgtggctc catctcgcat cccccatcac cgctataaat accattggcc atgcacaccc 7140

gcactcccac acagcacaag cagcagcagc agcagcagct cgatcgaact agcttagcta 7200

ctacgtgcgc gtgcaacaag cagctcgatc gatcgccctc acggtaattt cttctcccaa 7260

aataaaccta atctttaatc tgttgcctgt ctactcttcc tatctgttgc taaaaatttg 7320

aatttggtat gtgcaggagg acttaattaa gggacccacc gccatgtcat ccacggacgt 7380

gcaagagcgc ctgcgggact tggcgcgcga agacgaggcg ggaacgttca acgaggcttg 7440

gaacaccaac ttcaagccgt cggacgagca gcaattcagc tactcgccga cggagggaat 7500

tgtcttcctc acgccgccta agaacgtcat cggtgagcgg cgcatctccc agtacaaggt 7560

gaacaatgcc tgggcaactc tggagggctc tcccaccgag gcgagcggta cgccgttgta 7620

cgcgggcaag aatgtactgg acaactcgaa aggcacaatg gaccaggagt tgcttacacc 7680

cgagttcaac tacacctaca cggagagcac gagcaacacg acgacgcacg gcctcaaact 7740

cggcgtgaag accaccgcga ccatgaagtt ccctatcgct caaggctcga tggaggcgag 7800

caccgagtac aatttccaga actcctccac cgataccaag accaaacaag tgtcttacaa 7860

gtctccgagc cagaagatta aggttcctgc gggcaagacg taccgcgtgc tggcgtacct 7920

gaacaccggc tctatctctg gcgaggctaa cctgtacgcg aacgtcggcg gcatcgcgtg 7980

gcgggtctcg ccaggctatc ctaacggcgg cggcgtgaac atcggcgctg tcctgaccaa 8040

gtgccagcag aagggttggg gcgacttccg caacttccag ccctccgggc gcgacgtcat 8100

cgtgaagggt cagggcacct tcaagtccaa ctacggcacc gacttcatcc ttaagattga 8160

ggacatcacc gacagcaagc tccgcaacaa caacggctcc gggacggtcg tacaggagat 8220

caaggtgcca ctcatccgca ccgagatttg ataggggtcc ccggtccgat gaagtgccat 8280

catgccatgg atgcggggtg aaagctcgcg gcgtcgaata taatctccgg ttccagtttc 8340

agctactatg gcgactcgtg tcgtgtgtgt gtggttactc tgcttttgta tgtttggtaa 8400

tggtgtgtgc gctgttgtcc agagtttcat ggtggtactg cttcctagca gtgttgtgta 8460

ctagtctcgg tactttgcct gtatgttgag ctcggctcag tatgttctgg gagtgaataa 8520

ataaaaataa aaaaaaccag atattgtagt atactaactg ccgttgctct gtttcatcca 8580

catacacaga atcctatgaa ctgatctttg tggggacttg ggagccatct gctcggatct 8640

tcttcatggg attctctcaa tttctcctca tttttctaag gctgtgtgtt tagatgtagg 8700

gagaaaagtt tttggattgt acatcgtgtt gggtactaat ttagtctact actccgtccg 8760

tgaatagatg acattttctt tcggtgttgt tcgtcgtgcc acaaagtttt gaatttattt 8820

atatgcaatc ctgcaggtgt ttaaacacct gcaggtctgc atgttcagtt agcacaagca 8880

ggttgcagct tcaccaaaca catacagtcg gccattgctg cttcaccaaa cataaacact 8940

acctgttgga gctacaccaa acacttgcac tgaccaaaga acattaatag atcatcagga 9000

ctgttcaagt aatcacgcat gacaagatag aaagcagcag gtccccttcc ttctcaaagt 9060

agcctgcagc ttcattcttt ggttcaccat tacataaaca gcaaaaccag aaatagcaga 9120

caataattcc tcctctaggt aaataaccag acacagtaat accctcacaa gtaccactta 9180

ttaggacagt acaatacaaa tgatagcaag gggcagatca agaatcacaa cacagaagcc 9240

acaaaacatg ataagcgcag cagaccaaaa gcttcttctc aaagggcgcc cggaccgtca 9300

gttgttggtc tggctgtaca tgacatccga cttctgaatc cacttgtgta gcaccttcag 9360

gtccttcccg ccgaccgtcg cccagagctc tacgctagca tctttcgtcg ggtaggtccc 9420

gccgttaggg ttcttgagat taaacgtaat ctggaacaag aacgggctcg gcttgctgac 9480

ggtctggacc ttcttgccgt tcacgcggat cttgtagctc gacacgttgt tgtagaagat 9540

gtcgggcagc ttgtacaggc tgaggccgga gtacaggttt ggattctctg agagatacca 9600

ccagcctgag aatttgtggg cgtcgatcat aactttctcg atctcggact cgccaagctc 9660

agcgactttc actttgaggt tgtcgttctt ctcgtcaacg gcgtagagct ccataggcgt 9720

gatcgcagtg atgctgccgt acgtcaccgt ccgcttcccg ttggcgtcca gaggcggcgc 9780

agggatgatg ctaccgaggc ggccgttgat cttccactgg tatcggatct tgctactcgg 9840

cacgcgagtg aacgtggcac cgatcaccat ctcgtcgttg gagccgaagg accacttctc 9900

aaagatgtgt ttcttctgca ggttctcgtt ggtcttccac tcgatcacgg agacatcgtc 9960

gaagtgcagg ttggcgttcc cgttattctt caggccgatg atcttgaagt attcagggtt 10020

attgaacgtg ttgaaggaga actccgctat cttccacttc ccgccggtca ccttcccgga 10080

aaccttcgcg ccttgcccgt tgccggagct gttgtcagcg tagaagacga cctcgttgct 10140

cccagtggtg ctggcggtgc gcacgtacgc ccgcacagtg taggaggtgt atggcttcag 10200

ctgcgggttt gacatcgccg tgccgtgccc gtcagtgccg atccgcccgc gcttcttgcc 10260

ggtgtagcct ccggattctt ggtaggtgta gtaccacagg ttctctgagg tctcgaagtc 10320

gtagtacttg atcgggacgt gtagcgtgat cttcatgccg cgcttccact tcacgtcgta 10380

caccgtcttg ccgggcatct ggttcagctg gcgctcgatt tctttcttcg tgttctcgtc 10440

cgtgatgagg ttgatggaag gctcatcaat gaagatgtcc ttctcaccct ggtccgtgta 10500

gtacagtctg ccgtccttct cctgagcgtt aaacgccttc ttgatggcct ccttgatggt 10560

gatctccgga gtcttgtcct ccggatcgtt catgttcttc gccgcgaccc ggcgctcgag 10620

gctatccttg cccgtgccga ggttaagagt aaggctccca ctgacagcgt caatgtttgt 10680

ccggatcggg tcccactcgc ctccgggtat cacctggcct ttctcgtcga ggataccgta 10740

ctggccgcgg ttctgcgtag tctcgatgtt gagaatctcc gtgcccgcct ggatcttgtc 10800

cagctgctcg gcgttgatcg ctatcttcac ggtgcccgcc tcgttggcct tgtctaggga 10860

gataggagcc tggcccttct gcggataggt gtcgccggca ccgagcgagt tgccgatctg 10920

gttagggccg gcggtgatcg tggtgatgct gtcgcctgag ttctggaaga cgaagttggt 10980

ggtcggcttc aggtcgtaga tgggcgcggt gccaccattg taatagcgca cgttcgcgtt 11040

gagatacgcc ctctcggcag tgttgatccc tatctgcgaa ctccaggtag tagagtcggt 11100

gtcggccaca cttgtggacg acgaccagct gtgggtgtac tttggtgaga ttgagaaact 11160

gaagcccttg tcgctgaagc ccaggctgcc gccgatctcg acggtgttgg tcgtggtgtc 11220

ggtcttagtt gtagtcttgc tctttgtatc cgcgttgccc tccgtcaccg tatcgttctt 11280

gctgaagtgg agcttctcca ttccgacgcc aacggaggga taggcggcca ctagaggatc 11340

gcgcgcctca tacttcgtag cagcgggcat gtgcccagtc accttctcga agtcggtgta 11400

cgggtctttg accgtacggg cgtggtaagg gttgctcacg tacttcttgt agccttctgc 11460

actgtaggcg tcgttccacg gcacgatctg ctggttacgg aaggtgtatc ctttctcttc 11520

ccattcatca gggatgcagt cgttgtcggt gtccaccggc gtggacatcg actgcttctc 11580

gccgttctct tgctggcggt cgaagaggtt gtagttcggg aagaagctct gggtctcctt 11640

ctccgcgaga gagttcgcct tctcgctgaa attcgggctc agtatgtact tctccgggat 11700

ctgttccttc tgcgcgttgt tcatcgacca gaagagctgt aggtccggca gggtgttgga 11760

ggtgttcctg tactcgatct taatctcgta gacctggttt gcctctagtt tgaggttctt 11820

ctggatgctc gcctggttga tgaccgtctc gccattgatc tggaggatta cgttctcgtc 11880

ggaggatgtg gagaggcggt actcgccggt ctgcgggctc ttcaggttgc ccatccaccg 11940

aatggactgg atctgctggg cgtccgtgtt gatgcgagcc ttgttcatga ggttggactt 12000

ctcgcccacc tggatgaaca tgagctcctt gaaggttgag tccttgaagt agaagccgac 12060

caggccgatg accgtcgctt gctcactctt ggaggagaca atgttctgca tggtggtggc 12120

cggccaagta acggtccgct accctgcaag aggtagcaaa aaaggggtat cagttaacag 12180

caagtgtatc ctgctagata gtagctgtac aagggaacca gtaagcatcg taaacataaa 12240

agttttgaag gcatatcaac tgaaccttta tatttgtgca tctataagtc aataaaaaca 12300

acatatgtac agagcttact gccaggcaaa agtgggattc atttcaccga ctaggctaat 12360

gttgtactcc ctccgttcca aattgtaggt cgttttgact tttctagatt catagatatt 12420

attatgcacc tagacataca ctatatctag atgcataata atatctatga acctacaaaa 12480

gtcaaaacga cctacaattt ggaacggaga gagtaagaaa taatctgata acttgcggac 12540

tgttgtttcc aacatttata aaaatgtgta aagtaccata accaaacatt cgtataacta 12600

aacatgatag gaaaagacta gcattgcttt gaaaaagtag tgtacatgta ctggccaatc 12660

taacaagctt ttttgttgtc taaaatgtga cctgcagagc aacaaaaatc acatgctgaa 12720

cttttcagcc taacatttgg tgccatgaaa catcactaag ttgtcactaa ttttgggtgg 12780

tatgtgctca atagctattc atgacaagga aacatcctaa catgcagata tgctttccaa 12840

atagctctct ccgaatgaac cacacacgga tttttacact ctggtagttc aatcacacca 12900

aattaactat ccgcgacttt catccaacca tgttaccagt taccgcaact atctggactt 12960

gctagacaga gcatcacgaa gctctcccag actcccagtc aagcaggaaa ctagaacgtc 13020

ggagctggga agtagtcaag cagtcacacc ccaagggctc gtgcatcgcc agcaacacgt 13080

aagcgcattc aggcacatca cagtcaccat tcctaggtac gtagctcaga gagcctcctc 13140

gcacggcagt cccgcaaaca cacatcaggc gtgcgcacaa aatcagacgc atcggcacgc 13200

agaaacgcta cagatcagga acaggacgga gttcatcaag cacagacgtc agacgaacac 13260

cctagcacca accacgaagc acgatccgct ggcggatcgc gcggtacccg ccccggatct 13320

ggcgggagca ccggaggcaa gtgaccagaa cgcatgagca aaccgcagat ctcgagccag 13380

gccgctcaga tctgagcgcc aaacactcga aaaatgctgg agcaggagct agtgcgtggg 13440

gagatcgcga gtagaggggc tccagggagc ggaggggagg gggaggagga gattaccggg 13500

gaggccggcc tgctgcagag tacagaaagc acttgcttga tcactagcgc gaagcagagg 13560

tgtgcctgcc cttagtatta actgatcact aagcgcttgt gatggttcgt ggtggcgctt 13620

gattgttgca tttataggag aaccatcggc gcagtgccga ttattgtaat agcagtgttg 13680

ttgtgtgagt ttacattccc gtgagcatga gtgcatgtga gggcgattat taattagatg 13740

gctgatcaat gcagaacagc gcaagtggcc aagattgctc cactggtgga tgcatgttga 13800

tgtttgttct cgcttgatgg ttgatcattt ttattcagtt taggacgaac ttgtcatatg 13860

ggttggctgc ttgtatctag taacgtgatc gagtgctaaa catcagcaga ggtatcatgg 13920

tgatgcatgg acggtggacg cccaagttgt tgaacagttg aagtattttt ttttctgcac 13980

ttcacgggat ccaagcgcag agctatgcat aattgcatat agcggtgggt acgggtgcac 14040

ccttgcatgg taaaactgaa tgcgctcaga aggcaattgc aatcactaaa atttgcttta 14100

gctctgttcc tgatcgggtc aaggtttatt atgttcagtt ggaacattca aagttagagg 14160

cttgaatttg cttaaaaagc attcccacaa acaacggtgg gtgccctttt tgtatgacgt 14220

actgttggct agatggttcc gcttgtttat gaaaaaagag tgtactaata aatttacccg 14280

aactcttcac taccgcagat aactcttttg ccgagtgctt catgcacttc acaaagtcca 14340

gaaaacactt ggcaagctcc aagcttaaga aacataaatg acgtgcataa gttcaaaaat 14400

agtttaatac aagactaaga tgtccaaaag aacggtaaat tatattaaaa taatacttct 14460

tataatagat caatgctatc gaatagccca cttcactctt taagcataca taaattttca 14520

attatatcat aaaatttcta cgtcctactg cgtttcaacc atatttcagc atgacaatta 14580

tagtaataca aaacaagaat tgaattgctt gaatgtaaat gttcaaagta aagaaggatt 14640

attaatatga tgatgtttta tcgagatatc agagagtcaa cactcctcat tgatccttgt 14700

tagagcaccc atgtaagtgt gtcgctcccc cttcatccgt gcaagcagga tcaaatgctc 14760

tctagaagga acgtgggcat ctaagagagg gatgaatccg aacataactg ggatttttgg 14820

aggattctga tgaaaccatt taccctaact tgagataact ggagtaaaag atccttactg 14880

tccaccattt cttgtgatgg gttaaaatcc ctcttgccgg agagacctat ctctatcagg 14940

tgatatgcct ggtagctgtt tccttcttcc caatctggca ggcccttgtt cgtcactgct 15000

gacgtctttt tcctcattat tggaggatga gtcactgcaa gctgtaaagc ttgtattatt 15060

gctggtggag gccccacctt cacatgctga gcatttatgg ttgtcggcca ataatttctt 15120

cagctgtttg caaagcaata attttgtaga tgtccctaca tcaactttgg catgtgcaat 15180

gctttcttca aaggaagata agatgtcaac atcttgtctg gagattggtg ctccgtagtg 15240

actcatgatc aatacctttt tctgtgcgta attgatcttg atttttgtct tcccgtcgat 15300

ggcgcgccaa gaagaacgat tggcaaacag ctattatggg tattatgggt aggcctgccc 15360

aaactaggga taacagggta ataggtctca cgcggcaaat cctaccacct catttaaata 15420

gagtgaggtt gatttgcggc cgctataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgt 15480

cgactcgtgg tggccgcatc gatcgtgaag tttctcatct aagcccccat ttggacgtga 15540

atgtagacac gtcgaaataa agatttccga attagaataa tttgtttatt gctttcgcct 15600

ataaatacga cggatcgtaa tttgtcgttt tatcaaaatg tactttcatt ttataataac 15660

gctgcggaca tctacatttt tgaattgaaa aaaaattggt aattactctt tctttttctc 15720

catattgacc atcatactca ttgctgatcc atgtaactat aacacagagg ctggccaacc 15780

tggaggcgca gcggcgccac aaggtccaga tctcgttcat cctggccacg ttgctcgcga 15840

ctccgaggac gtgcaggcca ctcgtcgtag ctctacctcg gcagcctctg tcgcgactcc 15900

gaggacgtgc aggccgcgca gctcgcgcgc tccttccgtg ccctctccgg ttttgtgatt 15960

ccctgcgccc tctccggctt cgccgccgca tccgggttta cgtggtggtg ggccaccgca 16020

gtcccaccat ccgcgaggca gccagcaggg cccccgcgct cgacgatagg ctgctgaagc 16080

ccctcgccca tcaccgtctt ctggggcgtg cctactgcga ggaggatggg gtcttccaca 16140

ccatgccaca aggtgttcga cgctcgttcc aactccgacg cgcagcctgt ctgctcgccc 16200

atcaccggcc acctgtctgg acgcgcagcc tgctgcgtca acatgctcag cagcatcaac 16260

tgctcaagaa gctacaccaa catcactcct cttcctccac gggggactgg attcgccatt 16320

ggtacctgct gcttcatgct caaccaacac ccttcttgcc aaggatgatg gagattatat 16380

gaaccggtgt ttcagttggt gttggaagtc cccatggtta catccagatc agtcggaatt 16440

tagagacttc ctccaatggt cttcttggca tttccaattt gtcaggtgca gagcatcaca 16500

gttaccaatt ccttggccac cacctataac attgcgtttg gttagagatg accttgttgt 16560

gatgccagtg attccaagta tgctattgtt atctcagtgc tatttcagtg gagtagaatg 16620

tgtgctgaca actatagatc cattattttc taaattttgt gctgagagag agctgttctg 16680

gaagccacct tggcaacctc cagttcctaa caccagatct gagataccgt tgttgataga 16740

gtttgtccat cttactacag gagtctgtga tactctgcat atggttactg aatttcctaa 16800

gcaatacttt gttggcctgc ttgtgctgat tacaagggaa tttttcatgt ctgggagaat 16860

a 16861

<210> 11

<211> 1073

<212> ДНК

<213> Zea mays

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1073)

<223> Последовательность из 1073 нуклеотидов, представляющая 5'-фланкирующую

геномную ДНК

кукурузы до встроенной Т-ДНК.

<400> 11

gaacatttgg cggaagaaca tgttttaagg gctagtttgg aagctcaatt ttcccaagag 60

attcttattt tcccaaggga aaataaacta atttcccttg tgaaaatgaa aatcccttgg 120

aataacgtgg ttcccaaact aaacctaagg gctttttttt atcattgtgt caaacagttt 180

accagctaat tttagtacct taacatttaa ataggtcagc taaaaaagta gctaattgtt 240

agccgaagaa ctgataaatt atttgtccat tagctatttg accttactaa tagatattaa 300

taaatcatat aaatagtcaa gtcttcaaat ataccctgac taatatttgc tagttaatta 360

tttattttct gattaattat tagccactgc taaacaataa gtcagtacga cccaaacaag 420

gcctagttac tactcctatc cataaaaaaa agttgtttga ccattttgac gccaaattta 480

accggcttat attaccaaaa tatttgaaaa aacattaaaa acagttgctg gttaaagtaa 540

attgtatgat aaactaaatc ggaatgaaaa taaataatag ttataatttt ttaataagat 600

gagccagtca aatttgacaa aaagttaaac cgatattctt tctggaacgg aaggagtaga 660

ctgtgttaat gttatgatat tgtgagcaag agagaagggg gtcgatagca acgacccaag 720

tgagtgggag gaggaaggtt ggggcgacga tgttgtgggg agggtgaagg atgatctaaa 780

taatattgtt cgctggattt gagtgagtaa gagcaacccc aacagtttag atataaatcc 840

tagctaaatt tagagtcttg ccaagagatt tttatttttt caaaaaaata gtttattttt 900

ctttgggaaa tagaaatctc ttggaacaat agtgttttta aactagtctt ggcgtttgta 960

aagaagatag atagactcca attttttatg aagacgggtc aaaactcaac aaatcaacgg 1020

ataccgtccc ttttttggcg catgaagttt caggtctgta gcagccggcc cga 1073

<210> 12

<211> 1106

<212> ДНК

<213> Zea mays

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1106)

<223> Последовательность из 1106 нуклеотидов, представляющая 3'-фланкирующую

геномную ДНК

кукурузы после встроенной Т-ДНК.

<400> 12

actataacac agaggctggc caacctggag gcgcagcggc gccacaaggt ccagatctcg 60

ttcatcctgg ccacgttgct cgcgactccg aggacgtgca ggccactcgt cgtagctcta 120

cctcggcagc ctctgtcgcg actccgagga cgtgcaggcc gcgcagctcg cgcgctcctt 180

ccgtgccctc tccggttttg tgattccctg cgccctctcc ggcttcgccg ccgcatccgg 240

gtttacgtgg tggtgggcca ccgcagtccc accatccgcg aggcagccag cagggccccc 300

gcgctcgacg ataggctgct gaagcccctc gcccatcacc gtcttctggg gcgtgcctac 360

tgcgaggagg atggggtctt ccacaccatg ccacaaggtg ttcgacgctc gttccaactc 420

cgacgcgcag cctgtctgct cgcccatcac cggccacctg tctggacgcg cagcctgctg 480

cgtcaacatg ctcagcagca tcaactgctc aagaagctac accaacatca ctcctcttcc 540

tccacggggg actggattcg ccattggtac ctgctgcttc atgctcaacc aacacccttc 600

ttgccaagga tgatggagat tatatgaacc ggtgtttcag ttggtgttgg aagtccccat 660

ggttacatcc agatcagtcg gaatttagag acttcctcca atggtcttct tggcatttcc 720

aatttgtcag gtgcagagca tcacagttac caattccttg gccaccacct ataacattgc 780

gtttggttag agatgacctt gttgtgatgc cagtgattcc aagtatgcta ttgttatctc 840

agtgctattt cagtggagta gaatgtgtgc tgacaactat agatccatta ttttctaaat 900

tttgtgctga gagagagctg ttctggaagc caccttggca acctccagtt cctaacacca 960

gatctgagat accgttgttg atagagtttg tccatcttac tacaggagtc tgtgatactc 1020

tgcatatggt tactgaattt cctaagcaat actttgttgg cctgcttgtg ctgattacaa 1080

gggaattttt catgtctggg agaata 1106

<210> 13

<211> 19612

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность из 19612 нуклеотидов, представляющая трансгенную кассету,

содержащуюся в бинарном плазмидном векторе трансформации, используемом для

трансформации кукурузы с получением объекта кукурузы MON95275.

<400> 13

aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc 60

cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120

gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc 180

actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 240

ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 300

gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt tcccggtaac tataacggtc ctaaggtagc 360

gacttaggct gagcccgggc aggcctaccc ataataccca taatagctgt ttgccaatcg 420

ttcttcttgg cgcgccgttg tcaatcaatt ggcaagtcat aaaatgcatt aaaaaatatt 480

ttcatactca actacaaatc catgagtata actataatta taaagcaatg attagaatct 540

gacaaggatt ctggaaaatt acataaagga aagttcataa atgtctaaaa cacaagagga 600

catacttgta ttcagtaaca tttgcagctt ttctaggtct gaaaatatat ttgttgccta 660

gtgaataagc ataatggtac aactacaagt gttttactcc tcatattaac ttcggtcatt 720

agaggccacg atttgacaca tttttactca aaacaaaatg tttgcatatc tcttataatt 780

tcaaattcaa cacacaacaa ataagagaaa aaacaaataa tattaatttg agaatgaaca 840

aaaggaccat atcattcatt aactcttctc catccatttc catttcacag ttcgatagcg 900

aaaaccgaat aaaaaacaca gtaaattaca agcacaacaa atggtacaag aaaaacagtt 960

ttcccaatgc cataatactc aaactcagta ggattctggt gtgtgcgcaa tgaaactgat 1020

gcattgaact tgacgaacgt tgtcgaaacc gatgatacga acgaaagcta ggcctcagcg 1080

agtaccgctg gcgatctaat ccatgatatc gtgaacatca tctacattca aattcttatg 1140

agctttctta agggcatctg cagcattttt catagaatct aatacagcag tatttgtgct 1200

agctccttcg agggcttccc tctgcatttc aatagttgta agggttccat ctatttgtag 1260

ttgggtcttt tccaatcgtt tcttcttttt gagggcttgg agtgcaactc ttttattttt 1320

cgacgcattt ttctttgcgc tcctgcaggc ggccgcgtgg atgaggagtt aatcggtcgt 1380

gtgagagtag tgatcgagtg gatgtcgtcg agagtgatga gtgttgatgt tgttagtgat 1440

atgtggtaga aggtatcgtg ataaagcgtt aacgcgatcg cagtacttgc aaagaaaaat 1500

gcgtcgaaaa ataaaagagt tgcactccaa gccctcaaaa agaagaaacg attggaaaag 1560

acccaactac aaatagatgg aacccttaca actattgaaa tgcagaggga agccctcgaa 1620

ggagctagca caaatactgc tgtattagat tctatgaaaa atgctgcaga tgcccttaag 1680

aaagctcata agaatttgaa tgtagatgat gttcacgata tcatggatgg tatcgcacag 1740

cgactgctga gggacgtcga gctcccgctt ggtatctgca ttacaatgaa atgagcaaag 1800

actatgtgag taacactggt caacactagg gagaaggcat cgagcaagat acgtatgtaa 1860

agagaagcaa tatagtgtca gttggtagat actagatacc atcaggaggt aaggagagca 1920

acaaaaagga aactctttat ttttaaattt tgttacaaca aacaagcaga tcaatgcatc 1980

aaaatactgt cagtacttat ttcttcagac aacaatattt aaaacaagtg catctgatct 2040

tgacttatgg tcacaataaa ggagcagaga taaacatcaa aatttcgtca tttatattta 2100

ttccttcagg cgttaacaat ttaacagcac acaaacaaaa acagaatagg aatatctaat 2160

tttggcaaat aataagctct gcagacgaac aaattattat agtatcgcct ataatatgaa 2220

tccctatact attgacccat gtagtatgaa gcctgtgcct aaattaacag caaacttctg 2280

aatccaagtg ccctataaca ccaacatgtg cttaaataaa taccgctaag caccaaatta 2340

cacatttctc gtattgctgt gtaggttcta tcttcgtttc gtactaccat gtccctatat 2400

tttgctgcta caaaggacgg caagtaatca gcacaggcag aacacgattt cagagtgtaa 2460

ttctagatcc agctaaacca ctctcagcaa tcaccacaca agagagcatt cagagaaacg 2520

tggcagtaac aaaggcagag ggcggagtga gcgcgtaccg aagacggtcg tacggaaaat 2580

agagagagat agatttgtag agagagactg gtgatttcag cgtgtcctct ccaaatgaaa 2640

tgaacttcct tatatagagg aagagtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct 2700

tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc 2760

tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc 2820

atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggact ttgtaggagc caccttcctt 2880

ttctactgtc ctttccatga agtgacagat agatgggcaa tggaatccga ggaggtttcc 2940

tgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt 3000

gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt 3060

gtcattgagt cgtaaaagac tctgtatgaa ctgtccgcca gtcttcacgg cgagttctgt 3120

tagatcctcg atctgaattt ttgactcctt gctgatggac ggtgtggagg gaggtgcttt 3180

cgtgcttggc ggcatgcacg ggtaatcggc aacgcatgtg tgctttgagc gttgcctggt 3240

tgtcatggga tacaggacaa caaccatcgt catgtggaga tcgatcgaga tataggatcg 3300

gagcaagttg acaaatcatg tcaaaatcac tcaacgaggt agcatgttgt ataaacagat 3360

caatgcagaa atacattagt gctagctgga attgttccga tcagctggcg ctattattat 3420

tttatcgaaa ctgatgcgtg tgcgtgctcg ccttattttg tgttctgcgg gggcggctcc 3480

cgcgaatacc tattatttct gtgagcgctc ccttcaaaag tgacatgatt ttatatatcc 3540

ctctacgata cgacgaccag atcaagctac cactaccacc gaaatcagga cctctgctaa 3600

ccggtggccc agaccggaca aaagttattg cattgtatat gggtagggtt tatgtccatt 3660

ttacatcgcg catagtacgc acaatttctg ttggcccatc aatatatacc gagtgtgctg 3720

cagcctatag tgatagagtt ttacttaatt ctaagcctag gatccgaaca gtgattggaa 3780

atccttagtt acagtctgac agtataaagg tcactctcac tacctggtag tagagccatg 3840

acccggtgct gatatcacta tcaggtacag ccataaccac agtgctagtg gaaatatcac 3900

tacgtactag gccaatctat aatctgatga gaacacatat agttgacata gtcgatacgt 3960

acccatgtta tgagtcccga gtgactgtca aggacatgat ttgagttttg gtaagtgtgt 4020

gttggacaaa tcgaagcatg agtagggttc atggcctgtg atttgtacta gtctaactaa 4080

ctaaattatc gtgtacaacc gttgatctga gagggtcccg cgctgcaaat ctattgtaat 4140

actccctgtc gtaatactgt gttaatttgt gctcagtcgg acggctcaga ctttacggtg 4200

atataaacct ttactgagct gaactcgacc tggagatcga atcgaccccg caggtgttcc 4260

gaagcgtacc acggcgagcg ttaggtctaa gcaaaagcca cacccttcac agaacgaagg 4320

agtttcgcga agtcacgctg atttaaaaag agcgggccac tttttccact cttggtcaac 4380

agaaaaaggc ggacgagttc agatttaagg ccagctgcac gccgatcagc agattcgacg 4440

ttacccgcgg agagaaggct gcctgctact tcccagtcga aagtggtgta gttcaagtga 4500

tctctaaagc taaggctccg ctggtcctag tcgttaatta ccgagcagct ctccggcgta 4560

cagaaccacg aagttacttc ttgaggtgaa gcgtaagtgg tggtgagggt aagtagttgg 4620

aagcagaagc cttaagtgat acaatctggc ttccaccttg tcggaactcg ttaaaatttc 4680

ccttgattac aatataagta cctgcctgat cgttctggta gcctgatcga tttttatttt 4740

tgggctacgg gcaattgctc gcaatttatt gaagtcgcac gggcgcgaaa gaagacgttg 4800

ttctctctgc ttgctagaag ccgcggataa gcgattctat ccgatattta agacccgtgt 4860

agaccagcag acgtgagtgg gccgtttcca gaaaccgtct ctccttgcga cgatagatcc 4920

gatagtaagt aacttcaccc ctgatcaacg gcgtagtcgc ctgtctggtt cggatctgta 4980

tagatttggc ggattccgct tgcgaaatct ttagcagctt aggtccggag cccccggtgg 5040

atctggctgt tcagcggcac ggtccaatct ccttagctcc tctgtgaaca gcagtcgaac 5100

tctaagattc ttgatacgcg caacacgggc cttggcgagc ctggggataa ctcgcgagga 5160

cgctctcgcc gcgctaaagc gtgcgatcac accgctccga caagtgactt tgccaaatct 5220

agaaagagag actacactgc ttgccggtgc agtcttgatc caccttggag gggctgacgc 5280

taactaacta aggcgcgccg gcctactagg cctcgaccct tgttcgtcac tgctgacgtc 5340

tttttctcca ttattggagg atgagtcact gcaagctgta aagcttgtat tattgctagt 5400

ggaggcccca cctgcacatg ccgagcaatt atgattgtcg gccagtagct ttttgagctg 5460

tttgcagagc aataacttag tggatgtccc caccattaca tcgttattga tgatgctttc 5520

ttcaaaggaa gataagatgc tgacatcctg tctggagatt gtcgctccat agtgactcgt 5580

gatcaatact ctttcatgtg agtaattgat ttttatcttt gtttctccgt tgatggccta 5640

ctaggccaaa tggatgaaac aacttggacc aatcagagat ggccacgtca gctcccgatc 5700

gtcgtaaccg accaaacccg atcgataacg gtttaggctc caatacaccg tcggtaccac 5760

ccggtcgcta tcatctgccc ccgtcccaac gctattggta tcgtccgccc ctatatcggt 5820

cggtagccca gtccaccgtc ggggccaatc gtcccctgct gcgtccgctc gtgtcggtac 5880

cgatcgccaa aaacgccacg tcaacggcac tgcggtaccg accgccgctg gcaccggcct 5940

tagcgggcca cacgaccgat cgctgttgta cggacgtaga ggtgaatcat gcgattgaat 6000

tttcgctaga ggaaagttat catcttatta tctccaaccc tccttcctac ggctggatcc 6060

gacgaaaatt taccctggac ggtgccagta acaattgcag gtctcactca cgtgctaaat 6120

ccagcaatca aacacgaagg aatatacgtg atctggccag aacatgcaag agaataatac 6180

agtagtgtta gagtacgaaa cctacacgat tcaacgaatt aatcaatggg ttcacgttca 6240

cgggtatgct cgcgcacgtc caaaatccaa cgacattttt ataagcggca tgatccagac 6300

gggccagctc gagcaccaca tggcgtggct ccatctcgca tcccccatca ccgctataaa 6360

taccattggc catgcacacc cgcactccca cacagcacaa gcagcagcag cagcagcagc 6420

tcgatcgaac tagcttagct actacgtgcg cgtgcaacaa gcagctcgat cgatcgccct 6480

cacggtaatt tcttctccca aaataaacct aatctttaat ctgttgcctg tctactcttc 6540

ctatctgttg ctaaaaattt gaatttggta tgtgcaggag gacttaatta agggacccac 6600

cgccatgtca tccacggacg tgcaagagcg cctgcgggac ttggcgcgcg aagacgaggc 6660

gggaacgttc aacgaggctt ggaacaccaa cttcaagccg tcggacgagc agcaattcag 6720

ctactcgccg acggagggaa ttgtcttcct cacgccgcct aagaacgtca tcggtgagcg 6780

gcgcatctcc cagtacaagg tgaacaatgc ctgggcaact ctggagggct ctcccaccga 6840

ggcgagcggt acgccgttgt acgcgggcaa gaatgtactg gacaactcga aaggcacaat 6900

ggaccaggag ttgcttacac ccgagttcaa ctacacctac acggagagca cgagcaacac 6960

gacgacgcac ggcctcaaac tcggcgtgaa gaccaccgcg accatgaagt tccctatcgc 7020

tcaaggctcg atggaggcga gcaccgagta caatttccag aactcctcca ccgataccaa 7080

gaccaaacaa gtgtcttaca agtctccgag ccagaagatt aaggttcctg cgggcaagac 7140

gtaccgcgtg ctggcgtacc tgaacaccgg ctctatctct ggcgaggcta acctgtacgc 7200

gaacgtcggc ggcatcgcgt ggcgggtctc gccaggctat cctaacggcg gcggcgtgaa 7260

catcggcgct gtcctgacca agtgccagca gaagggttgg ggcgacttcc gcaacttcca 7320

gccctccggg cgcgacgtca tcgtgaaggg tcagggcacc ttcaagtcca actacggcac 7380

cgacttcatc cttaagattg aggacatcac cgacagcaag ctccgcaaca acaacggctc 7440

cgggacggtc gtacaggaga tcaaggtgcc actcatccgc accgagattt gataggggtc 7500

cccggtccga tgaagtgcca tcatgccatg gatgcggggt gaaagctcgc ggcgtcgaat 7560

ataatctccg gttccagttt cagctactat ggcgactcgt gtcgtgtgtg tgtggttact 7620

ctgcttttgt atgtttggta atggtgtgtg cgctgttgtc cagagtttca tggtggtact 7680

gcttcctagc agtgttgtgt actagtctcg gtactttgcc tgtatgttga gctcggctca 7740

gtatgttctg ggagtgaata aataaaaata aaaaaaacca gatattgtag tatactaact 7800

gccgttgctc tgtttcatcc acatacacag aatcctatga actgatcttt gtggggactt 7860

gggagccatc tgctcggatc ttcttcatgg gattctctca atttctcctc atttttctaa 7920

ggctgtgtgt ttagatgtag ggagaaaagt ttttggattg tacatcgtgt tgggtactaa 7980

tttagtctac tactccgtcc gtgaatagat gacattttct ttcggtgttg ttcgtcgtgc 8040

cacaaagttt tgaatttatt tatatgcaat cctgcaggtg tttaaacacc tgcaggtctg 8100

catgttcagt tagcacaagc aggttgcagc ttcaccaaac acatacagtc ggccattgct 8160

gcttcaccaa acataaacac tacctgttgg agctacacca aacacttgca ctgaccaaag 8220

aacattaata gatcatcagg actgttcaag taatcacgca tgacaagata gaaagcagca 8280

ggtccccttc cttctcaaag tagcctgcag cttcattctt tggttcacca ttacataaac 8340

agcaaaacca gaaatagcag acaataattc ctcctctagg taaataacca gacacagtaa 8400

taccctcaca agtaccactt attaggacag tacaatacaa atgatagcaa ggggcagatc 8460

aagaatcaca acacagaagc cacaaaacat gataagcgca gcagaccaaa agcttcttct 8520

caaagggcgc ccggaccgtc agttgttggt ctggctgtac atgacatccg acttctgaat 8580

ccacttgtgt agcaccttca ggtccttccc gccgaccgtc gcccagagct ctacgctagc 8640

atctttcgtc gggtaggtcc cgccgttagg gttcttgaga ttaaacgtaa tctggaacaa 8700

gaacgggctc ggcttgctga cggtctggac cttcttgccg ttcacgcgga tcttgtagct 8760

cgacacgttg ttgtagaaga tgtcgggcag cttgtacagg ctgaggccgg agtacaggtt 8820

tggattctct gagagatacc accagcctga gaatttgtgg gcgtcgatca taactttctc 8880

gatctcggac tcgccaagct cagcgacttt cactttgagg ttgtcgttct tctcgtcaac 8940

ggcgtagagc tccataggcg tgatcgcagt gatgctgccg tacgtcaccg tccgcttccc 9000

gttggcgtcc agaggcggcg cagggatgat gctaccgagg cggccgttga tcttccactg 9060

gtatcggatc ttgctactcg gcacgcgagt gaacgtggca ccgatcacca tctcgtcgtt 9120

ggagccgaag gaccacttct caaagatgtg tttcttctgc aggttctcgt tggtcttcca 9180

ctcgatcacg gagacatcgt cgaagtgcag gttggcgttc ccgttattct tcaggccgat 9240

gatcttgaag tattcagggt tattgaacgt gttgaaggag aactccgcta tcttccactt 9300

cccgccggtc accttcccgg aaaccttcgc gccttgcccg ttgccggagc tgttgtcagc 9360

gtagaagacg acctcgttgc tcccagtggt gctggcggtg cgcacgtacg cccgcacagt 9420

gtaggaggtg tatggcttca gctgcgggtt tgacatcgcc gtgccgtgcc cgtcagtgcc 9480

gatccgcccg cgcttcttgc cggtgtagcc tccggattct tggtaggtgt agtaccacag 9540

gttctctgag gtctcgaagt cgtagtactt gatcgggacg tgtagcgtga tcttcatgcc 9600

gcgcttccac ttcacgtcgt acaccgtctt gccgggcatc tggttcagct ggcgctcgat 9660

ttctttcttc gtgttctcgt ccgtgatgag gttgatggaa ggctcatcaa tgaagatgtc 9720

cttctcaccc tggtccgtgt agtacagtct gccgtccttc tcctgagcgt taaacgcctt 9780

cttgatggcc tccttgatgg tgatctccgg agtcttgtcc tccggatcgt tcatgttctt 9840

cgccgcgacc cggcgctcga ggctatcctt gcccgtgccg aggttaagag taaggctccc 9900

actgacagcg tcaatgtttg tccggatcgg gtcccactcg cctccgggta tcacctggcc 9960

tttctcgtcg aggataccgt actggccgcg gttctgcgta gtctcgatgt tgagaatctc 10020

cgtgcccgcc tggatcttgt ccagctgctc ggcgttgatc gctatcttca cggtgcccgc 10080

ctcgttggcc ttgtctaggg agataggagc ctggcccttc tgcggatagg tgtcgccggc 10140

accgagcgag ttgccgatct ggttagggcc ggcggtgatc gtggtgatgc tgtcgcctga 10200

gttctggaag acgaagttgg tggtcggctt caggtcgtag atgggcgcgg tgccaccatt 10260

gtaatagcgc acgttcgcgt tgagatacgc cctctcggca gtgttgatcc ctatctgcga 10320

actccaggta gtagagtcgg tgtcggccac acttgtggac gacgaccagc tgtgggtgta 10380

ctttggtgag attgagaaac tgaagccctt gtcgctgaag cccaggctgc cgccgatctc 10440

gacggtgttg gtcgtggtgt cggtcttagt tgtagtcttg ctctttgtat ccgcgttgcc 10500

ctccgtcacc gtatcgttct tgctgaagtg gagcttctcc attccgacgc caacggaggg 10560

ataggcggcc actagaggat cgcgcgcctc atacttcgta gcagcgggca tgtgcccagt 10620

caccttctcg aagtcggtgt acgggtcttt gaccgtacgg gcgtggtaag ggttgctcac 10680

gtacttcttg tagccttctg cactgtaggc gtcgttccac ggcacgatct gctggttacg 10740

gaaggtgtat cctttctctt cccattcatc agggatgcag tcgttgtcgg tgtccaccgg 10800

cgtggacatc gactgcttct cgccgttctc ttgctggcgg tcgaagaggt tgtagttcgg 10860

gaagaagctc tgggtctcct tctccgcgag agagttcgcc ttctcgctga aattcgggct 10920

cagtatgtac ttctccggga tctgttcctt ctgcgcgttg ttcatcgacc agaagagctg 10980

taggtccggc agggtgttgg aggtgttcct gtactcgatc ttaatctcgt agacctggtt 11040

tgcctctagt ttgaggttct tctggatgct cgcctggttg atgaccgtct cgccattgat 11100

ctggaggatt acgttctcgt cggaggatgt ggagaggcgg tactcgccgg tctgcgggct 11160

cttcaggttg cccatccacc gaatggactg gatctgctgg gcgtccgtgt tgatgcgagc 11220

cttgttcatg aggttggact tctcgcccac ctggatgaac atgagctcct tgaaggttga 11280

gtccttgaag tagaagccga ccaggccgat gaccgtcgct tgctcactct tggaggagac 11340

aatgttctgc atggtggtgg ccggccaagt aacggtccgc taccctgcaa gaggtagcaa 11400

aaaaggggta tcagttaaca gcaagtgtat cctgctagat agtagctgta caagggaacc 11460

agtaagcatc gtaaacataa aagttttgaa ggcatatcaa ctgaaccttt atatttgtgc 11520

atctataagt caataaaaac aacatatgta cagagcttac tgccaggcaa aagtgggatt 11580

catttcaccg actaggctaa tgttgtactc cctccgttcc aaattgtagg tcgttttgac 11640

ttttctagat tcatagatat tattatgcac ctagacatac actatatcta gatgcataat 11700

aatatctatg aacctacaaa agtcaaaacg acctacaatt tggaacggag agagtaagaa 11760

ataatctgat aacttgcgga ctgttgtttc caacatttat aaaaatgtgt aaagtaccat 11820

aaccaaacat tcgtataact aaacatgata ggaaaagact agcattgctt tgaaaaagta 11880

gtgtacatgt actggccaat ctaacaagct tttttgttgt ctaaaatgtg acctgcagag 11940

caacaaaaat cacatgctga acttttcagc ctaacatttg gtgccatgaa acatcactaa 12000

gttgtcacta attttgggtg gtatgtgctc aatagctatt catgacaagg aaacatccta 12060

acatgcagat atgctttcca aatagctctc tccgaatgaa ccacacacgg atttttacac 12120

tctggtagtt caatcacacc aaattaacta tccgcgactt tcatccaacc atgttaccag 12180

ttaccgcaac tatctggact tgctagacag agcatcacga agctctccca gactcccagt 12240

caagcaggaa actagaacgt cggagctggg aagtagtcaa gcagtcacac cccaagggct 12300

cgtgcatcgc cagcaacacg taagcgcatt caggcacatc acagtcacca ttcctaggta 12360

cgtagctcag agagcctcct cgcacggcag tcccgcaaac acacatcagg cgtgcgcaca 12420

aaatcagacg catcggcacg cagaaacgct acagatcagg aacaggacgg agttcatcaa 12480

gcacagacgt cagacgaaca ccctagcacc aaccacgaag cacgatccgc tggcggatcg 12540

cgcggtaccc gccccggatc tggcgggagc accggaggca agtgaccaga acgcatgagc 12600

aaaccgcaga tctcgagcca ggccgctcag atctgagcgc caaacactcg aaaaatgctg 12660

gagcaggagc tagtgcgtgg ggagatcgcg agtagagggg ctccagggag cggaggggag 12720

ggggaggagg agattaccgg ggaggccggc ctgctgcaga gtacagaaag cacttgcttg 12780

atcactagcg cgaagcagag gtgtgcctgc ccttagtatt aactgatcac taagcgcttg 12840

tgatggttcg tggtggcgct tgattgttgc atttatagga gaaccatcgg cgcagtgccg 12900

attattgtaa tagcagtgtt gttgtgtgag tttacattcc cgtgagcatg agtgcatgtg 12960

agggcgatta ttaattagat ggctgatcaa tgcagaacag cgcaagtggc caagattgct 13020

ccactggtgg atgcatgttg atgtttgttc tcgcttgatg gttgatcatt tttattcagt 13080

ttaggacgaa cttgtcatat gggttggctg cttgtatcta gtaacgtgat cgagtgctaa 13140

acatcagcag aggtatcatg gtgatgcatg gacggtggac gcccaagttg ttgaacagtt 13200

gaagtatttt tttttctgca cttcacggga tccaagcgca gagctatgca taattgcata 13260

tagcggtggg tacgggtgca cccttgcatg gtaaaactga atgcgctcag aaggcaattg 13320

caatcactaa aatttgcttt agctctgttc ctgatcgggt caaggtttat tatgttcagt 13380

tggaacattc aaagttagag gcttgaattt gcttaaaaag cattcccaca aacaacggtg 13440

ggtgcccttt ttgtatgacg tactgttggc tagatggttc cgcttgttta tgaaaaaaga 13500

gtgtactaat aaatttaccc gaactcttca ctaccgcaga taactctttt gccgagtgct 13560

tcatgcactt cacaaagtcc agaaaacact tggcaagctc caagcttaag aaacataaat 13620

gacgtgcata agttcaaaaa tagtttaata caagactaag atgtccaaaa gaacggtaaa 13680

ttatattaaa ataatacttc ttataataga tcaatgctat cgaatagccc acttcactct 13740

ttaagcatac ataaattttc aattatatca taaaatttct acgtcctact gcgtttcaac 13800

catatttcag catgacaatt atagtaatac aaaacaagaa ttgaattgct tgaatgtaaa 13860

tgttcaaagt aaagaaggat tattaatatg atgatgtttt atcgagatat cagagagtca 13920

acactcctca ttgatccttg ttagagcacc catgtaagtg tgtcgctccc ccttcatccg 13980

tgcaagcagg atcaaatgct ctctagaagg aacgtgggca tctaagagag ggatgaatcc 14040

gaacataact gggatttttg gaggattctg atgaaaccat ttaccctaac ttgagataac 14100

tggagtaaaa gatccttact gtccaccatt tcttgtgatg ggttaaaatc cctcttgccg 14160

gagagaccta tctctatcag gtgatatgcc tggtagctgt ttccttcttc ccaatctggc 14220

aggcccttgt tcgtcactgc tgacgtcttt ttcctcatta ttggaggatg agtcactgca 14280

agctgtaaag cttgtattat tgctggtgga ggccccacct tcacatgctg agcatttatg 14340

gttgtcggcc aataatttct tcagctgttt gcaaagcaat aattttgtag atgtccctac 14400

atcaactttg gcatgtgcaa tgctttcttc aaaggaagat aagatgtcaa catcttgtct 14460

ggagattggt gctccgtagt gactcatgat caataccttt ttctgtgcgt aattgatctt 14520

gatttttgtc ttcccgtcga tggcgcgcca agaagaacga ttggcaaaca gctattatgg 14580

gtattatggg taggcctgcc caaactaggg ataacagggt aataggtctc acgcggcaaa 14640

tcctaccacc tcatttaaat agagtgaggt tgatttgcgg ccgctataac ttcgtataat 14700

gtatgctata cgaagttatc ctagggacaa caacatgctt ctcatcaaca tggagggaag 14760

agggagggag aaagtgtcgc ctggtcacct ccattgtcac actagccact ggccagctct 14820

cccacaccac caatgccagg ggcgagcttt agcacagcca ccgcttcacc tccaccaccg 14880

cactacccta gcttcgccca acagccaccg tcaacgcctc ctctccgtca acataagaga 14940

gagagagaag aggagagtag ccatgtgggg aggaggaata gtacatgggg cctaccgttt 15000

ggcaagttat tttgggttgc caagttaggc caataagggg agggatttgg ccatccggtt 15060

ggaaaggtta ttggggtagt atctttttac tagaattgtc aaaaaaaaat agtttgagag 15120

ccatttggag aggatgttgc ctgttagagg tgctcttagg acatcaaatt ccataaaaac 15180

atcagaaaaa ttctctcgat gaagatttat aaccactaaa actgccctca attcgaaggg 15240

agttcaaaac aattaaaatc atgttcgaat tgagtttcaa tttcacttta acccctttga 15300

aatctcaatg gtaaaacatc aacccgtcag gtagcatggt tctttttatt cctttcaaaa 15360

agagttaatt acaaacagaa tcaaaactaa cagttaggcc caaggcccat ccgagcaaac 15420

aatagatcat gggccaggcc tgccaccacc ctccccctcc tggctcccgc tcttgaattt 15480

caaaatccaa aaatatcggc acgactggcc gccgacggag cgggcggaaa atgacggaac 15540

aacccctcga attctacccc aactacgccc accaacccac acgccactga caatccggtc 15600

ccacccttgt gggcccacct acaagcgaga cgtcagtcgc tcgcagcaac cagtgggccc 15660

acctcccagt gagcggcggg tagatctgga ctcttaccca cccacactaa acaaaacggc 15720

atgaatattt tgcactaaaa ccctcagaaa aattccgata ttccaaacca gtacagttcc 15780

tgaccgttgg aggagccaaa gtggagcgga gtgtaaaatt gggaaactta atcgaggggg 15840

ttaaacgcaa aaacgccgag gcgcctcccg ctctatagaa aggggaggag tgggaggtgg 15900

aaaccctacc acaccgcaga gaaaggcgtc ttcgtactcg cctctctccg cgccctcctc 15960

cgccgccgct cgccgccgtt cgtctccgcc gccaccggct agccatccag gtaaaacaaa 16020

caaaaacgga tctgatgctt ccattcctcc gtttctcgta gtagcgcgct tcgatctgtg 16080

ggtggatctg ggtgatcctg gggtgtggtt cgttctgttt gatagatctg tcggtggatc 16140

tggccttctg tggttgtcga tgtccggatc tgcgttttga tcagtggtag ttcgtggatc 16200

tggcgaaatg ttttggatct ggcagtgaga cgctaagaat cgggaaatga tgcaatatta 16260

ggggggtttc ggatggggat ccactgaatt agtctgtctc cctgctgata atctgttcct 16320

ttttggtaga tctggttagt gtatgtttgt ttcggataga tctgatcaat gcttgtttgt 16380

tttttcaaat tttctaccta ggttgtatag gaatggcatg cggatctggt tggattgcca 16440

tgatccgtgc tgaaatgccc ctttggttga tggatcttga tattttactg ctgttcacct 16500

agatttgtac tcccgtttat acttaatttg ttgcttatta tgaatagatc tgtaacttag 16560

gcacatgtat ggacggagta tgtggatctg tagtatgtac attgctgcga gctaagaact 16620

atttcagagc aagcacagaa aaaaatattt agacagattg ggcaactatt tgatggtctt 16680

tggtatcatg ctttgtagtg ctcgtttctg cgtagtaatc ttttgatctg atctgaagat 16740

aggtgctatt atattcttaa aggtcattag aacgctatct gaaaggctgt attatgtgga 16800

ttggttcacc tgtgactccc tgttcgtctt gtcttgataa atcctgtgat aaaaaaaatt 16860

cttaaggcgt aatttgttga aatcttgttt tgtcctatgc agcctgatcc atggcgcaag 16920

ttagcagaat ctgcaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc tcgaaatcca 16980

gtcaacgcaa atctccctta tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca cgagcttatc 17040

cgatttcgtc gtcgtgggga ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc tctgagcttc 17100

gtcctcttaa ggtcatgtct tctgtttcca cggcgtgcat gcttcacggt gcaagcagcc 17160

ggcccgcaac cgcccgcaaa tcctctggcc tttccggaac cgtccgcatt cccggcgaca 17220

agtcgatctc ccaccggtcc ttcatgttcg gcggtctcgc gagcggtgaa acgcgcatca 17280

ccggccttct ggaaggcgag gacgtcatca atacgggcaa ggccatgcag gcgatgggcg 17340

cccgcatccg taaggaaggc gacacctgga tcatcgatgg cgtcggcaat ggcggcctcc 17400

tggcgcctga ggcgccgctc gatttcggca atgccgccac gggctgccgc ctgacgatgg 17460

gcctcgtcgg ggtctacgat ttcgacagca ccttcatcgg cgacgcctcg ctcacaaagc 17520

gcccgatggg ccgcgtgttg aacccgctgc gcgaaatggg cgtgcaggtg aaatcggaag 17580

acggtgaccg tcttcccgtt accttgcgcg ggccgaagac gccgacgccg atcacctacc 17640

gcgtgccgat ggcctccgca caggtgaagt ccgccgtgct gctcgccggc ctcaacacgc 17700

ccggcatcac gacggtcatc gagccgatca tgacgcgcga tcatacggaa aagatgctgc 17760

agggctttgg cgccaacctt accgtcgaga cggatgcgga cggcgtgcgc accatccgcc 17820

tggaaggccg cggcaagctc accggccaag tcatcgacgt gccgggcgac ccgtcctcga 17880

cggccttccc gctggttgcg gccctgcttg ttccgggctc cgacgtcacc atcctcaacg 17940

tgctgatgaa ccccacccgc accggcctca tcctgacgct gcaggaaatg ggcgccgaca 18000

tcgaagtcat caacccgcgc cttgccggcg gcgaagacgt ggcggacctg cgcgttcgct 18060

cctccacgct gaagggcgtc acggtgccgg aagaccgcgc gccttcgatg atcgacgaat 18120

atccgattct cgctgtcgcc gccgccttcg cggaaggggc gaccgtgatg aacggtctgg 18180

aagaactccg cgtcaaggaa agcgaccgcc tctcggccgt cgccaatggc ctcaagctca 18240

atggcgtgga ttgcgatgag ggcgagacgt cgctcgtcgt gcgtggccgc cctgacggca 18300

aggggctcgg caacgcctcg ggcgccgccg tcgccaccca tctcgatcac cgcatcgcca 18360

tgagcttcct cgtcatgggc ctcgtgtcgg aaaaccctgt cacggtggac gatgccacga 18420

tgatcgccac gagcttcccg gagttcatgg acctgatggc cgggctgggc gcgaagatcg 18480

aactctccga tacgaaggct gcctgatgag ctccagggtt cttgcctggt gccttggcaa 18540

tgcttgatta ctgctgctat cctatgatct gtccgtgtgg gcttctatct atcagtttgt 18600

gtgtctggtt ttgaaaaaca tttgcttttc gattatgtag ggtttgcttg tagctttcgc 18660

tgctgtgacc tgtgttgttt atgtgaacct tctttgtggc atctttaata tccaagttcg 18720

tggtttgtcg taaaacgaag cctctacttc gtaaagttgt gtctatagca ttgaaatcgt 18780

ttttttgctc gagaataatt gtgaccttta gttggcgtga aactagtttt ggatatctga 18840

ttctctggtt cgcaatcttg agatcgtcgc tgcttaggtg agctaagtga tgttcctaag 18900

taaatgctcc tcaccagaat acgtagctgt gtgaaaagag aacgcgtgaa tacgtagctg 18960

tgtaaagatt gtgtcccaag taaacctcag tgatttttgt ttggattttt aatttagaaa 19020

cattcgactg ggagcggcta gagccacacc caagttccta actatgataa agttgctctg 19080

taacagaaaa caccaactag tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgtcga 19140

ctcgtggtgg ccgcatcgat cgtgaagttt ctcatctaag cccccatttg gacgtgaatg 19200

tagacacgtc gaaataaaga tttccgaatt agaataattt gtttattgct ttcgcctata 19260

aatacgacgg atcgtaattt gtcgttttat caaaatgtac tttcatttta taataacgct 19320

gcggacatct acatttttga attgaaaaaa aattggtaat tactctttct ttttctccat 19380

attgaccatc atactcattg ctgatccatg tagatttccc ggacatgaag ccatttacaa 19440

ttgaatatat cctgccgccg ctgccgcttt gcacccggtg gagcttgcat gttggtttct 19500

acgcagaact gagccggtta ggcagataat ttccattgag aactgagcca tgtgcacctt 19560

ccccccaaca cggtgagcga cggggcaacg gagtgatcca catgggactt tt 19612

<210> 14

<211> 35

<212> ДНК

<213> фаг Enterobacteria P1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223> Нуклеотидная последовательность из 35 нуклеотидов, представляющая сайты

LoxP, применяемую для

Cre-опосредованного вырезания и рекомбинации.

<400> 14

tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttat 35

<210> 15

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 27 нуклеотидов, соответствующая праймеру

для термической амплификации,

обозначенному как SQ20267, применяемому для идентификации ДНК объекта

кукурузы MON95275 в образце.

<400> 15

ctctttcttt ttctccatat tgaccat 27

<210> 16

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 24 нуклеотидов, соответствующая праймеру

для термической амплификации,

обозначенному как SQ51355, применяемому для идентификации ДНК

объекта кукурузы MON95275 в образце.

<400> 16

gttggccagc ctctgtgtta tagt 24

<210> 17

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 19 нуклеотидов, соответствующая зонду,

обозначенному как

PB10263, применяемому для идентификации ДНК объекта кукурузы MON95275 в

образце.

<400> 17

atactcattg ctgatccat 19

<210> 18

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 24 нуклеотидов, соответствующая праймеру

для термической амплификации,

обозначенному как SQ20222, применяемому в качестве внутреннего контроля для

анализа

объекта и зиготности для объекта кукурузы MON95275.

<400> 18

gccctatgac ttaccgagag ttca 24

<210> 19

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 28 нуклеотидов, соответствующая праймеру

для термической амплификации,

обозначенному как SQ20221, применяемому в качестве внутреннего контроля для

анализа

объекта и зиготности для объекта кукурузы MON95275.

<400> 19

gttgctatgt actaacagaa ctgcatgt 28

<210> 20

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 17 нуклеотидов, соответствующая зонду,

обозначенному как

PB50298, применяемому в качестве внутреннего контроля для анализа объекта и

зиготности

для объекта кукурузы MON95275.

<400> 20

ttgttgtgtg gctccat 17

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 20 нуклеотидов, соответствующая праймеру

для термической амплификации,

обозначенному как PNEG95275_F, применяемому для анализа зиготности для

объекта кукурузы MON95275.

<400> 21

tctctttctt ccacctcacg 20

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 20 нуклеотидов, соответствующая праймеру

для термической амплификации,

обозначенному как PNEG95275_R, применяемому для анализа зиготности для

объекта кукурузы MON95275.

<400> 22

cgaatgcctc tgataccaat 20

<210> 23

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность из 17 нуклеотидов, соответствующая зонду,

обозначенному как

PRBNEG95275, применяемого для анализа зиготности объекта кукурузы MON95275.

<400> 23

gtaccgcaac gctaaca 17

<210> 24

<211> 496

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Энхансер, представляющий собой перегруппировку фрагментов, полученных из

вируса мозаичности булгура, с измененными нуклеотидами.

<400> 24

atcgacggga agacaaaaat caagatcaat tacgcacaga aaaaggtatt gatcatgagt 60

cactacggag caccaatctc cagacaagat gttgacatct tatcttcctt tgaagaaagc 120

attgcacatg ccaaagttga tgtagggaca tctacaaaat tattgctttg caaacagctg 180

aagaaattat tggccgacaa ccataaatgc tcagcatgtg aaggtggggc ctccaccagc 240

aataatacaa gctttacagc ttgcagtgac tcatcctcca ataatgagga aaaagacgtc 300

agcagtgacg aacaagggcc tgccagattg ggaagaagga aacagctacc aggcatatca 360

cctgatagag ataggtctct ccggcaagag ggattttaac ccatcacaag aaatggtgga 420

cagtaaggat cttttactcc agttatctca agttagggta aatggtttca tcagaatcct 480

ccaaaaatcc cagtta 496

<210> 25

<211> 576

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Промотор, функционально связанный с лидером, полученным из изолята вируса

мозаичности цветной капусты

NY8153, причем нуклеотид в положении 2 был изменен

для замены потенциального инициирующего кодона.

<400> 25

aaggagtcaa aaattcagat cgaggatcta acagaactcg ccgtgaagac tggcggacag 60

ttcatacaga gtcttttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag 120

cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct 180

attgagactt ttcaacaaag ggtaatatca ggaaacctcc tcggattcca ttgcccatct 240

atctgtcact tcatggaaag gacagtagaa aaggaaggtg gctcctacaa agtccatcat 300

tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga 360

cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa 420

gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg 480

caagactctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggacacg ctgaaatcac 540

cagtctctct ctacaaatct atctctctct attttc 576

<210> 26

<211> 322

<212> ДНК

<213> вирус Dahlia mosaic

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(322)

<223> Энхансер, полученный из вируса мозаичности булгура.

<400> 26

atcaacggag aaacaaagat aaaaatcaat tactcacatg aaagagtatt gatcacgagt 60

cactatggag cgacaatctc cagacaggat gtcagcatct tatcttcctt tgaagaaagc 120

atcatcaata acgatgtaat ggtggggaca tccactaagt tattgctctg caaacagctc 180

aaaaagctac tggccgacaa tcataattgc tcggcatgtg caggtggggc ctccactagc 240

aataatacaa gctttacagc ttgcagtgac tcatcctcca ataatggaga aaaagacgtc 300

agcagtgacg aacaagggtc ga 322

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: молекула рекомбинантной ДНК, придающая устойчивость к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы и способы её обнаружения, ДНК-зонд для обнаружения наличия молекулы ДНК, пара ДНК праймеров для получения ампликона, позволяющего диагностировать наличие молекулы ДНК и способы определения зиготности растения кукурузы или семени кукурузы, содержащих молекулу ДНК. Также раскрыты: растение кукурузы, обладающее устойчивостью к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы, и способ его получения, растение-потомок кукурузы для размножения растения кукурузы, клетка и семя кукурузы, способ защиты растений кукурузы от заражения насекомыми, где указанный способ включает введение в рацион жесткокрылых насекомых-вредителей инсектицидно эффективного количества клеток или тканей растений кукурузы и неживой растительный материал кукурузы. Изобретение применяется для защиты растений кукурузы от заражения насекомыми. 14 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 22 табл., 9 пр.

1. Молекула рекомбинантной ДНК, придающая устойчивость к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 и полного комплемента любой из вышеперечисленных последовательностей.

2. ДНК-зонд для обнаружения наличия молекулы, ДНК по п. 1 в образце с использованием реакции гибридизации, где указанный ДНК-зонд включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

3. ДНК-зонд по п. 2, где указанный образец содержит растение кукурузы, клетку растения кукурузы, семя кукурузы, часть растения кукурузы, потомство растения кукурузы, обработанное семя кукурузы, корм для животных, содержащий кукурузу, кукурузное масло, кукурузную муку, кукурузную крупу, кукурузные хлопья, кукурузные отруби, макаронные изделия из кукурузы, кукурузную биомассу и топливный продукт, произведенный с использованием кукурузы или частей кукурузы.

4. Пара ДНК праймеров для получения ампликона, позволяющего диагностировать наличие молекулы ДНК по п. 1 в образце, где первый ДНК праймер содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:15 и второй ДНК праймер содержит нуклеотидную последовательность, SEQ ID NO:16.

5. Способ обнаружения наличия ДНК молекулы по п. 1 в образце, включающий

a) приведение указанного образца в контакт с ДНК-зондом по п. 2;

b) помещение указанного образца и указанного ДНК-зонда в строгие условия гибридизации; и

c) обнаружение гибридизации указанного ДНК-зонда с указанной ДНК в указанном образце, при этом указанное обнаружение позволяет диагностировать наличие присутствия молекулы ДНК по п. 1.

6. Способ обнаружения наличия ДНК молекулы по п. 1 в образце, включающий

a) приведение указанного образца в контакт с ДНК праймеров по п. 4;

b) осуществление реакции амплификации, достаточной для получения ампликона ДНК; и

c) обнаружение присутствия указанного ампликона ДНК в указанной реакции, причем указанный ампликон ДНК позволяет диагностировать наличие молекулы ДНК по п. 1.

7. Растение кукурузы, обладающее устойчивостью к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы, содержащие молекулу ДНК по п. 1.

8. Растение кукурузы по п. 7, отличающееся тем, что растение кукурузы обладает инсектицидным действием при введении в рацион жесткокрылого насекомого-вредителя.

9. Растение кукурузы по п. 8, отличающееся тем, что жесткокрылое насекомое-вредитель выбрано из группы, состоящей из западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera) и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi).

10. Растение-потомок кукурузы для размножения растения кукурузы по п. 7, где указанное растение-потомок кукурузы содержит молекулу ДНК по п. 1.

11. Клетка кукурузы, обладающая устойчивостью к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы и содержащая молекулу ДНК по п. 1.

12. Способ защиты растений кукурузы от заражения насекомыми, где указанный способ включает введение в рацион жесткокрылых насекомых-вредителей инсектицидно эффективного количества клеток или тканей растений кукурузы по п. 7.

13. Способ по п. 12, в котором указанное жесткокрылое насекомое-вредитель выбрано из группы, состоящей из западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera virgifera) и северного кукурузного жука (Diabrotica barberi).

14. Способ получения растения кукурузы, устойчивого к кукурузному жуку, включающий

а) скрещивание двух разных растений кукурузы, где по меньшей мере одно

из двух разных растений кукурузы содержат ДНК молекулу по п. 1;

b) подтверждение в указанном потомстве наличия указанной молекулы ДНК; и

c) отбор указанного потомства, содержащего указанную молекулу, при этом указанное потомство устойчиво к кукурузному жуку.

15. Семя кукурузы, обладающее устойчивостью к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы и содержащее молекулу ДНК по п. 1.

16. Неживой растительный материал кукурузы, обладающий устойчивостью к жесткокрылым насекомым вредителям кукурузы, содержащий молекулу ДНК по п. 1.

17. Способ определения зиготности растения кукурузы или семени кукурузы, содержащих молекулу ДНК по п. 1, включающий

a) приведение в контакт образца, содержащего ДНК кукурузы, с первой парой праймеров, способной продуцировать ампликон, позволяющий диагностировать наличие молекулы ДНК по п.1;

b) приведение указанного образца в контакт со второй парой праймеров, которая способна продуцировать с использованием реакции термической амплификации ампликона внутреннего стандарта геномной ДНК кукурузы, который, как известно, является однокопийным и гомозиготным в растении кукурузы;

c) приведение указанного образца в контакт с набором зондов, который содержит по меньшей мере первый зонд, который специфически гибридизуется с молекулой ДНК по п. 1, и второй зонд, который специфически гибридизуется с внутренним стандартом геномной ДНК кукурузы, который, как известно, является однокопийным и гомозиготным в растении кукурузы;

d) проведение реакции амплификации ДНК посредством ПЦР в реальном времени и определение порогов цикла - значения Ct ампликона, соответствующего молекуле ДНК по п. 1 и однокопийного, гомозиготного внутреннего стандарта;

е) расчет разницы - ΔCt между значением Ct однокопийного гомозиготного ампликона внутреннего стандарта и значением Ct ампликона, соответствующего молекуле ДНК по п. 1; и

определение зиготности, причем ΔCt около нуля указывает на гомозиготность вставленной Т-ДНК молекулы ДНК по п. 1, а ΔCt около единицы указывает на гетерозиготность вставленной Т-ДНК указанной молекулы ДНК, в котором пары праймеров выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 в сочетании с SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:18 в сочетании с SEQ ID NO:19; и при этом зонды представляют собой SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:20.

18. Способ по п. 17, в котором значение ΔCt около одного (1), указывающее на гетерозиготность встроенной Т-ДНК молекулы ДНК по п. 1 находится в диапазоне от 0,75 до 1,25.

19. Способ определения зиготности растения кукурузы или семени кукурузы, содержащих молекулу ДНК по п. 1, включающий

a) приведение образца, содержащего ДНК кукурузы, в контакт с набором пар праймеров, включающим по меньшей мере две разные пары праймеров, способных продуцировать первый ампликон, позволяющий диагностировать наличие молекулы ДНК по п. 1, и второй ампликон,

позволяющий диагностировать наличие нативной геномной ДНК кукурузы, лишенной указанной молекулы ДНК;

b) осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с образцом и набором пар праймеров; и

c) выявление в реакции амплификации нуклеиновых кислот первого ампликона, позволяющего диагностировать наличие молекулы ДНК по п. 1, или второго ампликона, позволяющего диагностировать наличие нативной геномной ДНК кукурузы, не содержащей указанной молекулы ДНК, при этом наличие только первого ампликона является диагностическим признаком растения кукурузы или семян кукурузы, гомозиготных по молекуле ДНК по п. 1, а присутствие как первого ампликона, так и второго ампликона является диагностическим признаком растения кукурузы или семян кукурузы, гетерозиготных по указанной молекуле ДНК; или

d) приведение образца, содержащего ДНК кукурузы, в контакт с набором зондов, который содержит по меньшей мере первый зонд, который специфически гибридизуется с молекулой ДНК по п. 1, и по меньшей мере второй зонд, который специфически гибридизуется с геномной ДНК кукурузы, которая была нарушена вставкой гетерологичной молекулой ДНК по п. 1 и не гибридизуется с указанной молекулой ДНК; и

e) гибридизация набора зондов с образцом в строгих условиях гибридизации, при этом обнаружение гибридизации только первого зонда в условиях гибридизации является диагностическим для гомозиготного аллеля молекулы ДНК по п. 1, и при этом обнаружение гибридизации, как первого зонда, так и второго зонда в условиях гибридизации является диагностическим для растения или семени кукурузы, гетерозиготного по указанной молекуле ДНК, в котором набор пар праймеров содержит SEQ ID NO:15 в сочетании с SEQ ID NO:16 и SEQ ID NO:21 в сочетании с SEQ ID NO:22, а набор зондов включает SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:23.