ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РАСТЕНИЯ КУКУРУЗЫ DBN9501 И СПОСОБ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 C12Q1/6895 C12N15/82 A01H5/00 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии растений, в частности - к области скрещивания трансгенных культур в исследовании сельскохозяйственной биотехнологии. В частности, настоящее изобретение относится к трансгенному объекту - кукурузе DBN9501, устойчивому к насекомым и устойчивому к гербициду глюфосинат, и последовательностям нуклеиновой кислоты и способам выявления того, содержит ли биологический образец конкретный трансгенный объект - кукурузу DBN9501.

Предшествующий уровень техники

Кукуруза (Zea mays L.) представляет собой главную зерновую культуру во многих областях мира. Для улучшения агрономических признаков и ее качества к кукурузе применяют биотехнологию. Устойчивость к насекомым, особенно устойчивость к насекомым Lepidoptera, таким как Ostrinia nubilalis, Helicoverpa armigera Hubner и Agrotis ypsilon Rottemberg, является важным агрономическим признаком в производстве кукурузы. Устойчивость к Lepidoptera кукурузе может придавать экспрессия гена устойчивости к Lepidoptera в растениях кукурузы посредством способа трансгенеза. Еще одним важным агрономическим признаком является устойчивость к гербицидам. Например, существуют успешно трансформированные объекты кукурузы, такие как NK603 и GA21, которые в различных местах выращивались на больших площадях посева кукурузы, как например, в Америке. Стоит упомянуть, что гербицид глюфосинат оказывает действие, отличное от гербицида глифосат, поскольку гербицид глюфосинат представляет собой неселективный гербицид контактного типа и может использоваться как средство эффективной борьбы с сорняками, устойчивыми к глифосату. Устойчивость к гербициду глюфосинат кукурузе может придавать экспрессия гена устойчивости к гербициду глюфосинат (например, pat) в растениях кукурузы посредством способа трансгенеза.

Известно, что на экспрессию экзогенных генов в растениях влияет их положение в хромосоме, что, возможно, обусловлено структурой хроматина (например, гетерохроматина) или близостью элементов регуляции транскрипции (например, энхансера) к сайту интеграции. По этой причине, часто является необходимым осуществлять скрининг большого числа объектов для идентификации того, может ли быть данный объект выведен на рынок (а именно, объект, в котором оптимально экспрессируется введенный целевой ген). Например, в растениях и других организмах наблюдали, что может существовать большое различие среди объектов в отношении уровня экспрессии введенного гена; и также могут существовать различия в отношении пространственных и временных профилей экспрессии, например, различия в относительной экспрессии трансгена в разных тканях растений, которые отражаются в противоречии между фактическим профилем экспрессии и ожидаемым профилем экспрессии, в зависимости от элементов регуляции транскрипции в конструкции вводимого гена. По этой причине обычно нужно получать сотни-тысячи разных объектов и подвергать скринингу те объекты в отношении одного единственного объекта, который имеет желательный уровень и профили экспрессии трансгена в коммерческих целях. Объект, который имеет желательные уровни или профили экспрессии трансгена, является полезным для ввода трансгена в другой генетический фон посредством полового ауткроссинга с использованием общепринятых способов скрещивания. Потомство, воспроизводимое в результате такого скрещивания, сохраняет характеристики экспрессии трансгена исходного трансформанта. Данная стратегия используется для обеспечения надежной экспрессии гена в целом ряде сортов, которые хорошо приспособлены к местным условиям произрастания.

Было бы преимущественным иметь способность выявлять наличие конкретного объекта для определения того, содержит ли потомство полового скрещивания целевой ген. Кроме того, способ выявления конкретного объекта был бы полезным для соблюдения правил, таких как правила, требующие предпродажного одобрения и маркирующие продукты питания, происходящие из рекомбинантных сельскохозяйственных растений. Возможно выявлять наличие трансгена любыми хорошо известными способами выявления полинуклеотидов, такими как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или ДНК-гибридизация с использованием полинуклеотидных зондов. Данные способы выявления обычно сфокусированы на часто используемых генетических элементах, таких как промоторы, терминаторы, маркерные гены. В результате, такие способы могут не быть полезными для проведения различия между разными объектами, особенно объектами, полученными с использованием одной и той же ДНК-конструкции, если не известна последовательность хромосомной ДНК, прилегающая к вставленной трансгенной ДНК (фланкирующая ДНК). Таким образом, пара праймеров, которая охватывает соединение вставленного трансгена и фланкирующей ДНК, обычно используется для идентификации конкретного трансгенного объекта посредством ПЦР, в частности, первый праймер, содержащийся во вставленной последовательности, и второй праймер, содержащийся во вставленной последовательности.

Краткое изложение сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является предложение последовательностей нуклеиновой кислоты и способов выявления растения кукурузы DBN9501. Трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью к насекомым, а также хорошей устойчивостью к гербициду глюфосинат, в то время как способы выявления могут точно и быстро идентифицировать то, содержит ли биологический образец молекулу ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Для достижения указанной выше цели, согласно настоящему изобретению предложена последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере 11 последовательных нуклеотидов в положениях 1-384 SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности, и по меньшей мере 11 последовательных нуклеотидов в положениях 385-768 SEQ ID NO: 3, или ее комплементарной последовательности; и/или по меньшей мере 11 последовательных нуклеотидов в положениях 1-564 SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности, и по меньшей мере 11 последовательных нуклеотидов в положениях 565-1339 SEQ ID NO: 4, или ее комплементарной последовательности.

Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты содержит 22-25 последовательных нуклеотидов в положениях 1-384 SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности, и 22-25 последовательных нуклеотидов в положениях 385-768 SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности; и/или 22-25 последовательных нуклеотидов в положениях 1-564 SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности, и 22-25 последовательных нуклеотидов в положениях 565-1339 SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности.

Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, и/или SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность.

SEQ ID NO: 1 или ее комплементарная последовательность представляет собой последовательность из 22 нуклеотидов, которая расположена около соединения со вставкой на 5'-конце вставленной последовательности в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501. SEQ ID NO: 1 или ее комплементарная последовательность охватывает последовательность геномной ДНК, фланкирующую участок вставки кукурузы, и ДНК-последовательность на 5'-конце вставленной последовательности. Таким образом, включение SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности могло бы указывать на наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. SEQ ID NO: 2 или ее комплементарная последовательность представляет собой последовательность из 22 нуклеотидов, которая расположена около соединения со вставкой на 3'-конце вставленной последовательности в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501. SEQ ID NO: 2 или ее комплементарная последовательность охватывает ДНК-последовательность на 3'-конце вставленной последовательности и геномную ДНК-последовательность, фланкирующую участок вставки кукурузы. Таким образом, включение SEQ ID NO: 2 или ее комплементарной последовательности могло бы указывать на наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 3 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 4 или ее комплементарную последовательность.

Последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может представлять собой последовательность, которая содержит по меньшей мере 11 или более последовательных полинуклеотидов в любом участке вставляемой последовательности Т-ДНК в SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности (первая последовательность нуклеиновой кислоты) или по меньшей мере 11 или более последовательных полинуклеотидов в любом участке 5'-фланкирующей области геномной ДНК кукурузы в SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности (вторая последовательность нуклеиновой кислоты). Кроме того, последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой последовательность, гомологичную или комплементарную участку SEQ ID NO: 3, которая содержит всю SEQ ID NO: 1. При совместном использовании первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты может действовать в качестве пары ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК, при котором получается продукт амплификации. Если продукт амплификации, получаемый посредством использования указанной пары ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК, содержит SEQ ID NO: 1, может быть диагностировано наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 или его потомства. SEQ ID NO: 3 или ее комплементарная последовательность представляет собой последовательность из 768 нуклеотидов, которая расположена вокруг соединения со вставкой на 5'-конце вставляемой последовательности Т-ДНК в трансгенный объект кукурузы DBN9501. SEQ ID NO: 3 или ее комплементарная последовательность состоит из 384 нуклеотидов из геномной 5'-фланкирующей последовательности кукурузы (нуклеотиды 1-384 SEQ ID NO: 3), 168 нуклеотидов из ДНК-последовательности конструкции DBN10707 (нуклеотиды 385-552 SEQ ID NO: 3) и 216 нуклеотидов из ДНК-последовательности транскрипционного терминатора транскрипции tNos (нопалинсинтетаза) (нуклеотиды 553-768 SEQ ID NO: 3). Таким образом, включение SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности могло бы указывать на наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой последовательность, которая содержит по меньшей мере 11 или более последовательных полинуклеотидов в любом участке вставляемой последовательности Т-ДНК в SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности (третья последовательность нуклеиновой кислоты), или по меньшей мере 11 или более последовательных полинуклеотидов в любом участке 3'-фланкирующей области геномной ДНК кукурузы в SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности (четвертая последовательность нуклеиновой кислоты). Кроме того, последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой последовательность, гомологичную или комплементарную участку SEQ ID NO: 4, которая содержит всю SEQ ID NO: 2. При использовании совместно, третья последовательность нуклеиновой кислоты и четвертая последовательность нуклеиновой кислоты могут действовать в качестве пары ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК, посредством которого образуется продукт амплификации. Если продукт амплификации, образованный посредством использования указанной пары ДНК-праймеров в способе амплификации ДНК, содержит SEQ ID NO: 2, может быть диагностировано наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 или его потомства. SEQ ID NO: 4 или ее комплементарная последовательность представляет собой последовательность из 1339 нуклеотидов, которая расположена вокруг соединения со вставкой на 3'-конце вставляемой последовательности Т-ДНК в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501. SEQ ID NO: 4 или ее комплементарная последовательность состоит из 271 нуклеотида из последовательности инициации транскрипции pr35S (нуклеотиды 1-271 SEQ ID NO: 4), 293 нуклеотидов из ДНК-последовательности конструкции DBN10707 (нуклеотиды 272-564 SEQ ID NO: 4) и 775 нуклеотидов из геномной 3'-фланкирующей последовательности кукурузы (нуклеотиды 565-1339 SEQ ID NO: 4). Таким образом, включение SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности могло бы указывать на наличие трансгенного объекта кукурузы DBN9501.

Кроме того, последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 5 или ее комплементарную последовательность.

SEQ ID NO: 5 или ее комплементарная последовательность представляет собой последовательность из 8559 нуклеотидов, которая характеризует трансгенный объект - кукурузу DBN9501. Конкретные геномы и генетические элементы, содержащиеся в SEQ ID NO: 5, показаны в Таблице 1. Включение SEQ ID NO: 5 или ее комплементарной последовательности могло бы указывать на наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Как хорошо известно специалистам в данной области, первая, вторая, третья и четвертая последовательности нуклеиновых кислот могут состоять не только из ДНК, но также могут содержать РНК, смесь ДНК и РНК или комбинацию ДНК, РНК и других нуклеотидов или их аналогов, которые не работают в качестве матриц для одной или более полимераз. Кроме того, зонды или праймеры по настоящему изобретению должны иметь длину по меньшей мере примерно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 последовательных нуклеотидов и могут быть выбраны из нуклеотидов из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. При выборе из нуклеотидов из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, зонды и праймеры могут иметь длину по меньшей мере от примерно 21 до примерно 50 или более последовательных нуклеотидов.

Последовательности нуклеиновой кислоты или их комплементарные последовательности могут быть использованы в способах амплификации ДНК для получения ампликонов, которые используются для выявления наличия трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 или его потомства в биологическом образце. Последовательности нуклеиновых кислот или их комплементарные последовательности могут быть использованы в способах выявления нуклеотидов для выявления наличия трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 или его потомства в биологическом образце.

Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в образце, включающий:

- приведение образца, подлежащего выявлению, в контакт с по меньшей мере двумя праймерами для амплификации целевого продукта амплификации в реакции амплификации нуклеиновой кислоты;

- проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты; и

- выявление наличия целевого продукта амплификации;

где целевой продукт амплификации содержит последовательность нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно, целевой продукт амплификации содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарную последовательность.

В частности, праймеры включают первый праймер и второй праймер, где первый праймер выбран из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10; и второй праймер выбран из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11.

Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта-кукурузы DBN9501 в образце, включающий:

- приведение образца, подлежащего выявлению, в контакт с зондом, где зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты;

- гибридизацию образца, подлежащего выявлению, с зондом в жестких условиях гибридизации; и

- выявление гибридизации образца, подлежащего выявлению, с зондом.

Жесткие условия могут представлять собой гибридизацию при 65°С в растворе 6×SSC (цитрат натрия) и 0,5% SDS (от англ. sodium dodecyl sulfate - додецилсульфат натрия) с последующей промывкой на мембране в растворе 2×SSC и 0,1% SDS и растворе 1×SSC и 0,1% SDS (каждым по одному разу).

Предпочтительно, зонд содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарную последовательность.

Возможно, по меньшей мере один зонд мечен по меньшей мере одним флуорофором.

Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в образце, включающий:

- приведение образца, подлежащего выявлению, в контакт с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты, где маркерная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты;

- гибридизацию образца, подлежащего выявлению, с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях гибридизации;

- выявление гибридизации образца, подлежащего выявлению, с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты, и дополнительно проведение анализа скрещивания с помощью маркера для определения того, связана ли генетически устойчивость к насекомым и/или устойчивость к гербицидам с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно, маркерная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группу, состоящей из SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарной последовательности и/или SEQ ID NO: 6-11 или их комплементарных последовательностей.

Для достижения указанной выше цели, согласно настоящему изобретению также предложен набор для выявления ДНК, содержащий по меньшей мере одну молекулу ДНК, где молекула ДНК содержит последовательность нуклеиновой кислоты, и молекула ДНК может действовать в качестве ДНК-праймера или зонда, специфичного в отношении трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 или его потомства.

Предпочтительно, молекула ДНК содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарную последовательность.

Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению также предложена растительная клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок устойчивости к насекомым Vip3Aa, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок устойчивости к гербициду глюфосинат PAT, и последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области, где последовательность нуклеиновой кислоты данной специфичной области содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7.

Предпочтительно, растительная клетка содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок устойчивости к насекомым Vip3Aa, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок устойчивости к гербициду глюфосинат PAT, и последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области, где последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4.

Предпочтительно, растительная клетка содержит последовательно SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 или содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 5.

Для достижения упомянутой выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ защиты растения кукурузы от нашествия насекомых, включающий предоставление по меньшей мере одной трансгенной растительной клетки кукурузы в рацион целевого насекомого, где трансгенная растительная клетка кукурузы содержит в своем геноме последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 1, и/или SEQ ID NO: 2; и поглощение трансгенной растительной клетки кукурузы ингибирует дальнейшее питание целевого насекомого данным трансгенным растением - кукурузой.

Предпочтительно, трансгенная растительная клетка кукурузы сдержит в своем геноме последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4.

Предпочтительно, трансгенная растительная клетка кукурузы последовательно содержит в своем геноме SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 или содержит SEQ ID NO: 5.

Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ защиты растения кукурузы от повреждения, вызываемого гербицидом, или борьбы с сорняками в поле возделывания растения кукурузы, включающий внесение эффективного количества гербицида глюфосинат в поле возделывания по меньшей мере одного трансгенного растения кукурузы, где трансгенное растение кукурузы содержит в своем геноме последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2, и трансгенное растение кукурузы обладает устойчивостью к гербициду глюфосинат.

Предпочтительно, трансгенное растение кукурузы содержит в своем геноме последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4.

Предпочтительно, трансгенное растение кукурузы последовательно содержит в своем геноме SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2, или содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 5.

Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ скрещивания растения кукурузы, устойчивого к насекомым и/или устойчивого к гербициду глюфосинат, включающий:

- посадку по меньшей мере одного семени кукурузы, где данное семя кукурузы содержит в своем геноме последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок устойчивости к насекомым Vip3Aa, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок устойчивости к гербициду глюфосинат PAT, и последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области, или семя кукурузы содержит в своем геноме последовательность нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO: 5;

- выращивание семени кукурузы в растение кукурузы; и

- заражение растения кукурузы целевым насекомым и/или опрыскивание растения кукурузы эффективным количеством гербицида глюфосинат и затем сбор урожая растения со сниженным повреждением растения, по сравнению с другими растениями, которые не содержат последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области;

где последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области представляет собой последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2; предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области представляет собой последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4.

Для достижения упомянутой выше цели согласно настоящему изобретению также предложен способ получения растения кукурузы, устойчивого к насекомым и/или устойчивого к гербициду глюфосинат, включающий:

- введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок устойчивости к насекомым Vip3Aa, и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок устойчивости к гербициду глюфосинат PAT, и последовательности нуклеиновой кислоты специфичной области в геноме первого растения кукурузы или последовательности нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO: 5 в геноме первого растения кукурузы, во второе растение кукурузы, получая, таким образом, множества растений потомства; и

- отбор растений потомства, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области, которые также устойчивы к насекомым и/или устойчивы к гербициду глюфосинат;

где последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области представляет собой последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2; предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области представляет собой последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4.

Предпочтительно, способ включает:

- половое скрещивание трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 с растением кукурузы, которое не обладает признаком устойчивости к насекомым и/или устойчивости к гербициду глюфосинат, с получением, таким образом, множества растений потомства; и

- отбор растений потомства, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области;

где последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2; предпочтительно, последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 4.

Для достижения указанной выше цели, согласно настоящему изобретению также предложен сельскохозяйственный продукт или товар, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, где сельскохозяйственный продукт или товар представляет собой кукурузную крупу, кукурузную муку, кукурузное масло, кукурузные столбики с рыльцами, кукурузный крахмал, кукурузный глютен, кукурузную лепешку, косметическое средство или агент-наполнитель.

В последовательностях нуклеиновой кислоты и способах выявления растений кукурузы согласно настоящему изобретению предложены следующие определения и способы для лучшего определения настоящего изобретения и для руководства для специалистов в данной области в реализации настоящего изобретения. Если не указано иное, термины нужно понимать в соответствии с общепринятым применением специалистами в данной области.

Термин «кукуруза» относится к Zea mays и включает все сорта растения, которые могут быть состыкованы с кукурузой, включая дикорастущие виды кукурузы.

Термин «содержащий», «включают» или «содержат» означает «включающий, но не ограниченны».

Термин «растение» включает целое растение, растительные клетки, органы растений, протопласты растений, культуры тканей из растительных клеток, из которых растения могут быть регенерированы, растительные куллусы, скопления растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растения, где данные части растения могут представлять собой, например, зародыши, пыльцу, семязачатки, семена, листья, цветки, ветки, плоды, стебли, корни, корневые кончики или пыльники. Следует понимать, что в пределах объема настоящего изобретения, части трансгенных растений включают растительные клетки, протопласты, ткани, каллусы, зародыши, цветки, листья и корни, но не ограничиваются ими. Упомянутые выше части растений происходят из трансгенных растений или их потомства, которые предварительно трансформированы молекулой ДНК по настоящему изобретению, и, таким образом, по меньшей мере частично состоят из трансгенных клеток.

Термин «ген» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует конкретный белок, включающему регуляторные последовательности, предшествующие (5' некодирующие последовательности) и следующие за (3' некодирующие последовательности) кодирующей последовательностью. «Нативный ген» относится к гену, который обнаружен в природе со своими собственными регуляторными последовательностями. «Химерный ген» относится к любому гену, который не является нативным геном, содержащему регуляторные и кодирующие последовательности, которые не обнаружены в природе. «Эндогенный ген» относится к нативному гену в своем природном положении в геноме организма. «Экзогенный ген» представляет собой чужеродный ген, в настоящее время присутствующий в геноме организма, который не содержит его в природе, и также относится к гену, вводимому в рецепторную клетку способом трансгенеза. Экзогенные гены могут включать нативные гены или химерные гены, вставленные в организм, не являющийся нативным. «Трансген» представляет собой ген, который был введен в геном способом трансформации. «Участок вставки» или «целевой участок» относится к участку в растительном геноме, в который вставлена рекомбинантная ДНК.

«Фланкирующая ДНК» может содержать или геном, находящийся в природе в организме, таком как растение, или экзогенную (гетерологичную) ДНК, введенную способом трансформации, например, фрагмент, ассоциированный с объектом трансформации. Таким образом, фланкирующая ДНК может включать комбинацию нативной ДНК и экзогенной ДНК. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «фланкирующая ДНК», также называемая «фланкирующей областью», «фланкирующей последовательностью», «фланкирующей геномной последовательностью» или «фланкирующей геномной ДНК», относится к последовательности из по меньшей мере 3, 5, 10, 11, 15, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 или 5000 пар оснований или больше, которая расположена или непосредственно выше или ниже исходно вставленной экзогенной молекулы ДНК и прилегает к ней. Когда данная фланкирующая область расположена ниже, она может также называться «3' фланкирующей областью» или «фланкирующей областью правой границы» и тому подобное. Когда данная фланкирующая область расположена выше, она может также называться «5' фланкирующей областью» или «фланкирующей областью левой границы» и тому подобное.

Способы трансформации, приводящие к случайной интеграции экзогенной ДНК, будут приводить к получению трансформантов, содержащих разные фланкирующие области, которые характерны и уникальны для каждого трансформанта. Когда рекомбинантную ДНК вводят в растение посредством традиционного скрещивания, ее фланкирующие области обычно не будут изменены. Трансформанты также будут содержать уникальные соединения фрагментов вставки гетерологичной ДНК и геномной ДНК или двух фрагментов геномной ДНК или двух фрагментов гетерологичной ДНК. «Соединение» представляет собой точку, в которой связаны два конкретных фрагмента ДНК. Например, соединение существует в положении, в котором ДНК-вставка связана с фланкирующей ДНК. Точка соединения также существует в трансформированном организме, в котором два фрагмента ДНК связаны вместе до некоторой степени, которая модифицирована по сравнению со степенью, обнаруженной в нативном организме. «Область соединения» или «последовательность соединения» относится к ДНК, которая содержит точку соединения.

Согласно настоящему изобретению предложен трансгенный объект - кукуруза, называемый DBN9501, и его потомство. Трансгенный объект - кукурузу DBN9501 также называют растением кукурузы DBN9501, включая растения и семена трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 вместе с растительными клетками или их возобновляемыми частями растения, где данные части растения трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 включают клетки, пыльцу, семязачатки, цветки, почки, корни, стебли, кисти нитей рыльца, соцветие, початки, листья и продукты, происходящие из растения кукурузы DBN9501, такие как кукурузная крупа, кукурузная мука, кукурузное масло, кукурузная патока, кукурузные столбики с рыльцами, кукурузный крахмал, и биомассу, остающуюся на поле сельскохозяйственных культур кукурузы, но не ограничиваются ими.

Трансгенный объект - кукуруза DBN9501 по настоящему изобретению содержит ДНК-конструкцию, которая при экспрессии в растительных клетках придает трансгенному объекту - кукурузе DBN9501 устойчивость к насекомым и устойчивость к гербициду глюфосинат. ДНК-конструкция содержит две экспрессионные кассеты, расположенные последовательно. Первая экспрессионная кассета содержит подходящий промотор для экспрессии в растении и подходящую сигнальную последовательность полиаденилирования, где промотор функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты белка Vip3Aa19, которая главным образом устойчива к насекомым Lepidoptera. Вторая экспрессионная кассета содержит подходящий промотор для экспрессии в растении и подходящую сигнальную последовательность полиаденилирования, где промотор функционально связан с геном, кодирующим фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазу (PAT), и последовательность нуклеиновой кислоты белка PAT устойчива к гербициду глюфосинат.Кроме того, промотор может представлять собой подходящий промотор, выделенный из растений, включая конститутивный, индуцибельный и/или тканеспецифичный промоторы. Подходящий промотор включает, но не ограничивается промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV - от англ. Cauliflower mosaic virus), промотором 35S вируса мозаики норичника (FMV - от англ. figwort mosaic virus), промотором убиквитина, промотором актина, промотором нопалинсинтетазы Agrobacterium tumefaciens (NOS - от англ. nopaline synthetase), промотором октопинсинтетазы (OCS - от англ. octopine synthetase), промотором вируса желтой курчавости листьев Cestrum, промотором пататина, промотором рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO), промотором глутатион-S-трансферазы (GST - от англ. glutathione S-transferase), промотором Е9, промотором GOS, промотором alcA/alcR, промотором Agrobacterium rhizogenes RolD и промотором Arabidopsis thaiiana Suc2. Сигнальная последовательность полиаденилирования может представлять собой подходящую сигнальную последовательность полиаденилирования, которая выполняет функции у растений. Подходящая сигнальная последовательность полиаденилирования включает, но не ограничивается сигнальной последовательностью полиаденилирования, происходящей из гена нопалинсинтетазы (NOS) Agrobacterium tumefaciens, сигнальной последовательностью полиаденилирования, происходящей из терминатора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), сигнальной последовательностью полиаденилирования, происходящей из гена ингибитора протеазы II (PIN II), и сигнальной последовательностью полиаденилирования, происходящей из гена α-тубулина.

Кроме того, экспрессионная кассета может дополнительно содержать другие генетические элементы, включая, но, не ограничиваясь энхансером и сигнальным пептидом/транзитным пептидом. Энхансер, усиливающий уровень экспрессии гена, включает, но не ограничивается активатором трансляции вируса гравировки табака (TEV - от англ. Tobacco Etch Virus), энхансером CaMV35S и энхансером FMV35S. Сигнальный пептид/транзитный пептид могут направлять белок Vip3Aa19 и/или белок PAT для осуществления транспорта к внеклеточному пространству или в конкретную внутриклеточную органеллу или компартмент, например, нацеливаясь на хлоропласт с использованием последовательности, кодирующей транзитный пептид хлоропласта, или нацеливаясь на эндоплазматический ретикулум с использованием последовательности удерживания «KDEL».

Ген Vip3Aa19 может выть выделен из Bacillus thuringiensis (сокр. Bt), и нуклеотидную последовательность гена Vip3Aa19 можно менять посредством оптимизации кодонов или другими способами, таким образом, чтобы улучшать стабильность и доступность транскрипта в трансформированных клетках.

Термин «Lepidoptera», включающий как мотыльков, так и бабочек, представляет собой самый большой отряд насекомых-вредителей в сельском и лесном хозяйстве. Он включает, например, Agrotis ypsilon Rottemberg, Helicoverpa armigera Hubner, Prodenia litura, Athetis lepigone и Conogethes punctiferalis.

Ген фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы (PAT) может представлять собой фермент, выделенный из штамма Streptomyces viridochromogenes, который катализирует превращение L-фосфинотрицина в его неактивную форму посредством ацетилирования таким образом, что придает растению устойчивость к гербициду глюфосинат.Фосфинотрицин (РТС, 2-амино-4-метилфосфинил-масляная кислота) представляет собой ингибитор глутаминсинтетазы. РТС представляет собой структурную единицу антибиотика 2-амино-4-метилфосфинилаланилаланина. Данный трипептид (РТТ) является активным в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и гриба Botrytis cinerea. Ген фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы (PAT) может также служить селектируемым маркерным геном.

«Глюфосинат» (также известный как фосфинотрицин) относится к аммоний-2-амино-4-[гидрокси(метил)фосфинил]бутирату. Обработки «гербицидом глюфосинат» относятся к обработкам любой композицией гербицида, содержащей глюфосинат. Выбор норм внесения для композиции глюфосината находится в пределах компетентности обычного агротехника таким образом, чтобы реализовать биологически эффективное количество. Обработка поля, содержащего растительный материал от трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, любой композицией гербицида, содержащей глюфосинат, будет осуществлять борьбу с ростом сорняков в поле и не будет влиять на рост или урожай растительного материала, происходящего из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

ДНК-конструкцию вводят в растение способами трансформации, включая, но, не ограничиваясь трансформацией, опосредованной Agrobacterium, баллистической трансформацией и подходом к трансформации «путь пыльцевой трубки».

Трансформация, опосредованная агробактерией, является широко используемым способом трансформации растений. Экзогенную ДНК, подлежащую введению в растение, клонируют в вектор между консенсусными последовательностями левой и правой границ, а именно, область Т-ДНК. Вектором трансформируют клетки Agrobacterium, которые впоследствии используют для инфицирования растительной ткани. Область Т-ДНК в векторе, содержащую экзогенную ДНК, вставляют в растительный геном.

Баллистическая трансформация представляет собой бомбардировку растительных клеток вектором, содержащим экзогенную ДНК (биолистическая трансформация, опосредованная частицами).

Трансформация «путь пыльцевой трубки» представляет собой способ переноса экзогенной ДНК в зародышевый мешок путем, опосредованным нуцеллусом, с использованием природной пыльцевой трубки (также известен как передающая ткань пыльцевой трубки), образованной после опыления растений.

После трансформации необходимо регенерировать трансгенное растение из трансформированной растительной ткани и выбрать потомство с экзогенной ДНК, используя подходящий маркер.

ДНК-конструкция представляет собой сборку молекул ДНК, связанных вместе, которая обеспечивает одну или более экспрессионных кассет. ДНК-конструкция предпочтительно представляет собой плазмиду, которая может самореплицироваться в бактериальной клетке и содержит разные сайты распознавания ферментом - эндонуклеазой рестрикции, которые полезны для введения молекул ДНК, которые обеспечивают функциональные генетические элементы, а именно, промоторы, интроны, лидерные последовательности, кодирующие последовательности, 3'-области терминации и другие последовательности. Экспрессионные кассеты, содержащиеся в ДНК-конструкции, содержат необходимые генетические элементы для транскрипции матричной РНК и могут быть сконструированы для экспрессии в прокариотических клетках или эукариотических клетках. Более предпочтительно, экспрессионные кассеты по настоящему изобретению сконструированы для экспрессии в растительных клетках.

Трансгенный «объект» получают в результате трансформации растительных клеток гетерологичной ДНК-конструкцией, включая стадии осуществления вставки экспрессионной кассеты нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один целевой ген, в геном растения способом трансгенеза для создания популяции растений, регенерации данной популяции растений и отбора конкретного растения, имеющего характеристики вставки в конкретное положение генома. Термин «объект» относится к исходному трансформанту и его потомству, которые включают гетерологичную ДНК. Термин «объект» также относится к потомству, полученному в результате полового скрещивания исходного трансформанта и отдельно взятого объекта других сортов, которое включает гетерологичную ДНК. Даже после повторного обратного скрещивания с родителем при обратном скрещивании, вставленная ДНК и фланкирующая геномная ДНК из родителя исходного трансформанта все еще находится в том же положении на хромосоме в потомстве, полученном в результате скрещивания. Термин «объект» также относится к ДНК-последовательности из исходного трансформанта, содержащей вставленную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно прилегающую к вставленной ДНК, где последовательность ДНК, как будут ожидать, переносится в потомство, которое получает вставленную ДНК, включая целевой ген, и которую получают в результате полового скрещивания родительской линии, которая включает вставленную ДНК (например, исходный трансформант и его потомство, полученное в результате самоопыления), и родительской линии, которая не содержит вставленной ДНК.

Термин «рекомбинантный», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к форме ДНК и/или белка и/или организма, которая обычно не будет обнаружена в природе, и в таком качестве создается в результате вмешательства человека. Такое вмешательство человека может приводить к получению рекомбинантной молекулы ДНК и/или рекомбинантного растения. «Рекомбинантная молекула ДНК» создана посредством искусственной комбинации двух иначе разделенных сегментов последовательности, например, посредством химического синтеза или посредством манипулирования выделенными сегментами нуклеиновой кислоты посредством технологии генной инженерии. Технология работы с нуклеиновыми кислотами хорошо известна в данной области.

Термин «трансген» включает любую клетку, клеточную линию, каллус, ткань, часть растения или растение, генотип которого изменен вследствие наличия гетерологичной нуклеиновой кислоты. «Трансген» включает данные трансгенные организмы, исходно таким образом измененные, а также потомство, созданное из исходного трансгенного организма в результате полового скрещивания или бесполого размножения. Термин «трансген», в том виде, в котором он используется в данном документе, не охватывает изменения генома традиционными способами скрещивания растений или в результате встречающихся в природе событий (внутрихромосомные или внехромосомные), таких как случайное перекрестное опыление, нерекомбинантное вирусное инфицирование, нерекомбинантная бактериальная трансформация, нерекомбинантная транспозиция или спонтанная мутация.

Термин «гетерологичный», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к первой молекуле, которая в нормальных условиях не обнаруживается в сочетании со второй молекулой в природе. Например, молекула может происходить из первого вида и быть вставлена в геном второго вида. Молекула, таким образом, будет гетерологична в отношении хозяина и искусственно введена в геном клетки-хозяина.

Трансгенный объект - кукуруза DBN9501, обладающий устойчивостью к насекомому Lepidoptera, и устойчивостью к гербициду глюфосинат, можно скрещивать посредством следующих стадий: во-первых, половое скрещивание первого родительского растения кукурузы, состоящего из растения кукурузы, культивируемого из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 и его потомства, со вторым родительским растением кукурузы, у которого отсутствует устойчивость к насекомому Lepidoptera и устойчивость к гербициду глюфосинат, с получением, таким образом, множества растений первого поколения, где трансгенный объект-кукуруза DBN9501 и его потомство получены в результате трансформации с использованием экспрессионной кассеты по настоящему изобретению, которая несет устойчивость к насекомому Lepidoptera и устойчивость к гербициду глюфосинат; и затем отбор растения потомства, которое устойчиво к нашествию насекомого Lepidoptera и/или устойчиво к гербициду глюфосинат.Данные стадии могут дополнительно включать обратное скрещивание растения потомства, устойчивого к насекомому Lepidoptera и/или устойчивого к глюфосинату, со вторым родительским растением кукурузы или третьем родительским растением кукурузы, затем осуществление скрининга потомства посредством заражения насекомым Lepidoptera, применения гербицида глюфосинат или идентификации молекулярных маркеров (например, молекула ДНК, содержащая соединения, идентифицируемые от 5'- и 3'- концов вставляемой последовательности в трансгенном объекте кукурузы DBN9501), ассоциированных с признаком, с получением, таким образом, растения кукурузы, устойчивого к насекомому Lepidoptera и устойчивого гербициду глюфосинат.

Также следует понимать, что два разных трансгенных растения могут быть также скрещены с получением потомства, которое содержит два независимых и отдельно добавляемых экзогенных гена. Самоопыление соответствующего потомства может приводить к получению растений потомства, которые гомозиготны в отношении обоих добавляемых экзогенных генов. Обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, как описано ранее, также рассмотрены, как и вегетативное размножение.

Термин «зонд» означает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая присоединена к общепринятой выявляемой метке или репортерной молекуле, например, радиоактивному изотопу, лиганду, хемилюминесцентному агенту или ферменту. Такой зонд комплементарен цепи целевой нуклеиновой кислоты, в настоящем изобретении, ДНК-цепи из генома трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, независимо от того, происходит ли ДНК-геном из трансгенного объекта кукурузы DBN9501 или семени или из растения или семени или его экстракта, происходящего из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. Зонды по настоящему изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, а также полиамиды и другие вещества зонда, которые специфично связываются с целевой ДНК-последовательностью и могут быть использованы для выявления наличия той целевой ДНК-последовательности.

Термин «праймер» представляет собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая отжигается на комплементарной цепи целевой ДНК в результате гибридизации нуклеиновой кислоты с образованием гибрида между праймером и цепью целевой ДНК, затем удлиняется вдоль цепи целевой ДНК под действием полимеразы (например, ДНК-полимераза). Пары праймеров по настоящему изобретению относятся к их применению в амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других общепринятых способов амплификации нуклеиновой кислоты.

Зонды и праймеры обычно представляют собой 11 полинуклеотидов или более в длину, предпочтительно 18 полинуклеотидов или более, более предпочтительно 24 полинуклеотида или более, наиболее предпочтительно 30 полинуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры гибридизуются специфично с целевой последовательностью в условиях гибридизации высокой жесткости. Предпочтительно, зонды и праймеры по настоящему изобретению обладают полной идентичностью ДНК-последовательностей с последовательными нуклеиновыми кислотами в целевой последовательности, хотя зонд, который отличается от целевой последовательности ДНК и сохраняет способность к гибридизации с целевыми последовательностями в условиях высокой жесткости, может быть сконструирован традиционными способами.

Праймеры и зонды на основе фланкирующей геномной ДНК и вставленной последовательности по настоящему изобретению могут быть определены традиционными способами, например, посредством выделения соответствующей молекулы ДНК из растительного материала, происходящего из трансгенного объекта кукурузы DBN9501, и определения последовательности нуклеиновой кислоты молекулы ДНК. Молекула ДНК содержит трансгенную вставленную последовательность и геномную фланкирующую последовательность кукурузы, и фрагмент молекулы ДНК может быть использован в качестве праймера или зонда.

Зонд и праймер на основе нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению гибридизуются с целевой последовательностью ДНК в жестких условиях. Любой общепринятый способ гибридизации или амплификации нуклеиновой кислоты может быть использован для идентификации наличия ДНК из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в образце. Молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты могут специфично гибридизоваться с другими молекулами нуклеиновых кислот в определенных обстоятельствах. В том виде, в котором они используются в данном документе, две молекулы нуклеиновой кислоты могут специфично гибридизоваться друг с другом, если данные две молекулы могут образовывать структуру антипараллельной, двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Говорят, что молекула нуклеиновой кислоты представляет собой «комплементарную последовательность» другой молекулы нуклеиновой кислоты, если они демонстрируют полную комплементарность. В контексте данного документа, говорят, что две молекулы нуклеиновых кислот демонстрируют «полную комплементарность», если каждый нуклеотид молекулы нуклеиновой кислоты комплементарен соответствующему нуклеотиду другой молекулы нуклеиновой кислоты. Говорят, что две молекулы нуклеиновой кислоты являются «минимально комплементарными», если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, таким образом, что они могут отжигаться и связываться друг с другом в по меньшей мере традиционных условиях «низкой жесткости». Аналогично, говорят, что две молекулы нуклеиновой кислоты обладают «комплементарностью», если они могут гибридизоваться одна с другой с достаточной стабильностью, таким образом, что они могут отжигаться и связываться друг с другом в общепринятых условиях «высокой жесткости». Отступления от полной комплементарности позволительны, при условии, что такие отступления не полностью предотвращают образование двумя молекулами двухцепочечной структуры. Для того, чтобы служить праймером или зондом, молекула нуклеиновой кислоты только должна обладать достаточной комплементарностью в последовательности, таким образом, что она может образовывать стабильную двухцепочечную структуру при конкретных используемых концентрациях растворителя и соли.

В контексте данного документа по существу гомологичная последовательность представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая будет специфично гибридизоваться с комплементарной цепью другой равноценной молекулой нуклеиновой кислоты в условиях высокой жесткости. Соответствующие жесткие условия, которые стимулируют гибридизацию ДНК, известны специалистам в данной области, например, обработка 6,0 × хлоридом натрия/цитратом натрия (SSC) при примерно 45°С с последующей промывкой 2,0×SSC при 50°С. Например, концентрация солей на стадии промывки может составлять собой от примерно 2,0×SSC при 50°С при низкой жесткости до примерно 0,2×SSC при 50°С при высокой жесткости. Кроме того, температуру на стадии промывки можно повышать с комнатной температуры (примерно 22°С) в условиях низкой жесткости до примерно 65°С в условиях высокой жесткости. Как температуру, так и концентрацию солей можно менять, или одну из них можно поддерживать постоянной, в то время как другая переменная меняется. Предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению будет специфично гибридизоваться с одной или более молекулами нуклеиновых кислот SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, или с их комплементарными последовательностями или любым фрагментом указанных выше последовательностей в условиях умеренной жесткости, например, при примерно 2,0×SSC и примерно 65°С. Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению будет специфично гибридизоваться с одной или более молекулами нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 или их комплементарными последовательностями или любым фрагментом указанных выше последовательностей в условиях высокой жесткости. Предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 или их комплементарные последовательности или любой фрагмент указанных выше последовательностей. Еще одна предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению разделяет 80% - 100% или 90% - 100% идентичность последовательностей с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 или их комплементарными последовательностями или любым фрагментом указанных выше последовательностей. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 могут быть использованы в качестве маркеров в способах скрещивания растений для идентификации потомства генетического скрещивания. Гибридизацию зонда с целевой молекулой ДНК можно выявлять любым способом, хорошо известным специалистам в данной области, включая флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки на основе антител и хемилюминесцентные метки, но, не ограничиваясь ими.

Рассматривая амплификацию целевой последовательности нуклеиновой кислоты с использованием конкретной пары праймеров для амплификации (например, ПЦР), «жесткие условия» представляют собой условия, которые позволяют паре праймеров гибридизоваться только с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты в тепловой реакции амплификации ДНК, где праймер имеет последовательность дикого типа, соответствующую целевой последовательности нуклеиновой кислоты (или ее комплементарной последовательности), и таким образом мог бы связываться с ней, предпочтительно, с получением уникального продукта амплификации, а именно, ампликона.

Термин «специфично связывающийся с (целевой последовательностью)» указывает на то, что в жестких условиях гибридизации зонд или праймер гибридизуется только с целевой последовательностью в образце, содержащем целевую последовательность.

В контексте данного документа термин «ампликон» относится к продукту амплификации нуклеиновой кислоты целевой последовательности нуклеиновой кислоты, используемой в качестве матрицы нуклеиновой кислоты. Например, для определения того, получено ли растение кукурузы в результате полового скрещивания трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, или содержит ли образец кукурузы, собранный с поля, трансгенный объект - кукурузу DBN9501, или содержит ли экстракт кукурузы (такой как крупа, мука или масло) трансгенный объект - кукурузу DBN9501, ДНК, экстрагируемую из образца растительной такни кукурузы, или экстракт можно подвергать способу амплификации нуклеиновой кислоты с использованием пары праймеров с получением ампликона, который позволяет диагностировать наличие ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. Пара праймеров включает первый праймер, происходящий из фланкирующей последовательности в растительном геноме, прилегающей к участку вставки вставленной экзогенной ДНК, и второй праймер, происходящий из вставленной экзогенной ДНК. Ампликон имеет длину и последовательность, которая также позволяет диагностировать трансгенный объект - кукурузу DBN9501. Ампликон может иметь длину, равную сумме объединенной длины пары праймров плюс одной пары нуклеотидных оснований или предпочтительно плюс примерно 50 пар нуклеотидных оснований или более предпочтительно плюс примерно 250 пар нуклеотидных оснований или наиболее предпочтительно плюс примерно 450 пар нуклеотидных оснований или больше.

В качестве альтернативы, пара праймеров может происходить из фланкирующей геномной последовательности на обеих сторонах вставленной ДНК, таким образом, чтобы получать ампликон, который включает полную вставленную нуклеотидную последовательность. Одна из пар праймеров, происходящая из последовательности растительного генома, может быть расположена на расстоянии от вставленной ДНК-последовательности, и данное расстояние может заключаться в пределах от одной пары нуклеотидных оснований до примерно двадцати тысяч пар нуклеотидных оснований. В контексте данного документе, термин «ампликон» конкретно исключает димеры прймеров, образованные в тепловой реакции амплификации ДНК.

Реакция амплификации нуклеиновой кислоты может быть выполнена любым из разных способов амплификации нуклеиновой кислоты, известных в данной области, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Множество способов амплификации известно специалистам в данной области. Способы ПЦР-амплификации разработаны для амплификации вплоть до 22 т.п.н. геномной ДНК и вплоть до 42 т.п.н. ДНК бактериофага. Данные способы, а также другие способы амплификации ДНК, известные в данной области, могут быть использованы в настоящем изобретении. Вставленная экзогенная последовательность ДНК и фланкирующая последовательность ДНК из трансгенного объекта-кукурузы DBN9501 может быть получена посредством амплификации генома трансгенного объекта- кукурузы DBN9501 с использованием предложенных последовательностей праймеров с последующим осуществлением стандартных способов секвенирования ДНК на ПЦР-ампликоне или клонированной ДНК.

Наборы для выявления ДНК, которые основаны на способах амплификации ДНК, содержат молекулы ДНК, используемые в качестве праймеров, которые гибридизуются специфично с целевой ДНК и амплифицируют диагностический ампликон в соответствующих условиях реакции. Набор может обеспечивать способ выявления на основе агарозного геля или много известных способов в данной области для выявления диагностического ампликона. Согласно настоящему изобретению предложен набор, который содержит ДНК-праймеры, которые гомологичны или комплементарны любой части области генома кукурузы в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, и любой части трансгенной вставленной области в SEQ ID NO: 5. Пара праймеров, которую конкретно идентифицируют как полезную в способе амплификации ДНК, содержит SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, которые амплифицируют диагностический ампликон, гомологичный участку 5'-области трансгена/генома трансгенного объекта кукурузы DBN9501, где ампликон содержит SEQ ID NO: 1. Другие молекулы ДНК, полезные в качестве ДНК-праймеров, могут происходить из SEQ ID NO: 5.

Ампликон, полученный данными способами, можно выявлять посредством множества методик. Один из таких способов представляет собой генетический анализ Bit, в котором конструируют олигонуклеотидную цепь ДНК, которая охватывает вставленную последовательность ДНК и соседнюю фланкирующую последовательность геномной ДНК. Олигонуклеотидная цепь иммобилизована в лунках микролуночного планшета. После ПЦР-амплификации целевой области, (используя два праймера соответственно для вставленной последовательности и соседней фланкирующей геномной последовательности), одноцепочечный ПЦР-продукт можно гибридизовать с иммобилизованным олигонуклеотидом, и он может служить в качестве матрицы для реакции достройки по одному основанию с использованием ДНК-полимеразы и специфично меченых ddNTP (англ. Dideoxynucleotide triphosphate - дидезоксинуклеотид трифосфат) для ожидаемого следующего основания. Результат может быть получен флуоресцентным способом или способом на основе ELISA. Сигнал указывает на наличие вставленной/фланкирующей геномной последовательности, которая демонстрирует, что амплификация, гибридизация и достройка по одному основанию являются успешными.

Еще одним способом является методика пиросеквенирования. В данном способе конструируют олигонуклеотидную цепь, которая охватывает участок соединения вставленной последовательности ДНК и прилегающей геномной ДНК. Олигонуклеотидная цепь гибридизуется с одноцепочечным ПЦР-продуктом из целевой области (с использованием двух праймеров, соответственно, для вставленной последовательности и прилегающей фланкирующей геномной последовательности) и инкубировали вместе с ДНК-полимеразой, АТФ, сульфурилазой, люциферазой, апиразой, адинозин-5'-фосфосульфатом и люциферином. dNTP (от англ. deoxynucleoside triphosphate -дезоксинуклеозидтрифосфат) добавляют отдельно и измеряют полученный световой сигнал. Световой сигнал указывает на наличие вставленной/фланкирующей последовательности, что демонстрирует то, что амплификация, гибридизация и достройка по одному или многим основаниям являются успешными.

Явление поляризации флуоресценции, как описано Chen et al. (Genome Res., 1999, 9: 492-498), также является способом, который может быть использован для выявления ампликона по настоящему изобретению. Для использования данного способа должна быть сконструирована олигонуклеотидная цепь, которая охватывает участок соединения вставленной последовательности ДНК и прилегающей геномной ДНК. Олигонуклеотидную цепь гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом из целевой области (используя два праймера соответственно для вставленной последовательности и прилегающей фланкирующей геномной последовательности) и инкубируют вместе с ДНК-полимеразой и флуоресцентно меченым ddNTP. Достройка по одному основанию приводит к включению ddNTP. Такое включение может быть измерено как изменение в поляризации с использованием флуориметра. Изменение в поляризации указывает на наличие вставленной/фланкирующей последовательности, которое демонстрирует, что амплификация, гибридизация и достройка по одному основанию являются успешными.

Taqman описан, как способ выявления и количественного анализа наличия ДНК-последовательности и полностью описан в инструкциях, предоставленных изготовителем. В настоящее время он кратко проиллюстрирован, как изложено ниже. Сконструирован олигонуклеотидный зонд на основе FRET (от англ. fluorescence resonance energy transfer - резонансный перенос энергии флуоресценции), который охватывает участок соединения вставленной последовательности ДНК и прилегающей фланкирующей геномной последовательности. FRET-зонд и ПЦР-праймеры (с использованием двух праймеров соответственно для вставленной последовательности и прилегающей фланкирующей геномной последовательности) подвергают циклам реакции в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. Гибридизация FRET-зонда приводит к расщеплению между флуоресцентной группировкой и группировкой гашения на FRET-зонде и высвобождению флуоресцентной группировки. Образование флуоресцентного сигнала указывает на наличие вставленной/фланкирующей последовательности, которое демонстрирует, что амплификация и гибридизация являются успешными.

Основываясь на принципе гибридизации, подходящие методики выявления растительных материалов из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 также включают саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг и гибридизацию in situ. В частности, подходящие технологии включают инкубирование зонда с образцом, их промывку для удаления несвязанного зонда и выявление того, гибридизован ли зонд. Способ выявления зависит от типа маркера, присоединенного к зонду, например, радиоактивно меченый зонд может быть выявлен посредством экспонирования и проявления рентгеновской пленки, или ферментативно меченый зонд может быть выявлен в результате превращения субстрата с эффектом изменения окраски.

Применение молекулярных маркеров в выявлении последовательностей описано Tyangi et al. (Nature. Biotech., 1996, 14: 303-308), которое кратко описано следующим образом. Конструируют FRET-олигонуклеотидный зонд, который охватывает участок соединения вставленной ДНК-последовательности и прилегающей геномной фланкирующей последовательности. Из-за уникальной структуры FRET-зонда он содержит вторичную структуру, которая сохраняет флуоресцентную группировку и группировку гашения в непосредственной близости. FRET-зонд и ПЦР-праймеры (с использованием двух праймеров соответственно для вставленной последовательности и фланкирующей геномной последовательности) подвергают прохождению циклов реакции в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. После успешной ПЦР-амплификации, гибридизация FRET-зонда с целевой последовательностью приводит к потере вторичной структуры зонда, таким образом, что флуоресцентная группировка и группировка гашения пространственно разделяются, и генерируется сигнал флуоресценции. Генерирование сигнала флуоресценции указывает на наличие вставленной/фланкирующей последовательности, которое демонстрирует, что амплификация и гибридизация являются успешными.

Согласно другим описанным способам, таким как микрогидродинамика, предложены способы и устройства для разделения и амплификации ДНК-образцов. Оптические красители используют для выявления и определения специфичных молекул ДНК. Устройства на основе нанотрубки, которые содержат электронный сенсор для выявления молекул ДНК или наногранулу для связывания конкретных молекул ДНК, которые, таким образом, могут быть выявлены, полезны для выявления молекул ДНК по настоящему изобретению.

Наборы для выявления ДНК могут быть разработаны с использованием композиций, описанных в данном документе, и данные способы, описанные или известные в области выявления ДНК. Наборы полезны для идентификации того, содержит ли образец ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, и могут применяться для скрещивания растений кукурузы, содержащих ДНК трансгенного объекта кукурузы DBN9501. Наборы могут содержать ДНК праймеры или зонды, которые гомологичны или комплементарны по меньшей мере участку SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 или 5, или содержат другие ДНК праймеры или зонды, гомологичные или комплементарные ДНК, содержащейся в трансгенных генетических элементах ДНК, и данные ДНК-последовательности могут быть использованы в реакциях амплификации ДНК или в качестве зондов в способах гибридизации ДНК. Участок соединения ДНК-структуры трансгенной вставленной последовательности и геномной последовательности кукурузы, содержащийся в геноме кукурузы и проиллюстрированный на Фиг. 1 и в Таблице 1, содержит следующее: фланкирующая геномная область кукурузы DBN9501, прилегающая к 5'-концу трансгенной вставленной последовательности; участок вставленной последовательности от области левой границы (LB) Agrobacterium; первая экспрессионная кассета, состоящая из промотора убиквитина кукурузы 1 (prZmUbi1), функционально связанного с фосфинотрицин-^ацетилтрансферазой, устойчивой к глюфосинату (сРАТ) Streptomyces viridochromogenes, и функционально связанного с терминатором нопалинсинтетазы (tNos); вторая экспрессионная кассета, состоящая из промотора вируса мозаики цветной капусты (pr35S), содержащего тандемный повтор энхансерной области, функционально связанного с интроном белка теплового шока Zea mays 70 кДа (iZmHSP70), функционально связанного с белком устойчивости к насекомым Vip3Aa19 (cVip3Aa19) Bacillus thuringiensis, и функционально связанного с терминатором нопалинсинтетазы (tNos); фрагмент вставленной последовательности с области правой границы (RB) Agrobacterium; и фланкирующая геномная область растения кукурузы DBN9501 на 3'-конце трансгенной вставленной последовательности (SEQ ID NO: 5). В способах амплификации ДНК молекулы ДНК, полезные в качестве праймеров, могут представлять собой любой фрагмент трансгенной вставленной последовательности, происходящей из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, или любой фрагмент фланкирующей последовательности геномной ДНК кукурузы, происходящей из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Трансгенный объект - кукуруза DBN9501 может быть использован в сочетании с другими трансгенными сортами кукурузы, например, трансгенными сортами кукурузы, устойчивыми к гербициду (такому как глифосат и дикамба), или трансгенными сортами кукурузы, несущими другие гены устойчивости к насекомым. Разные сочетания этих разных трансгенных объектов, при использовании для скрещивания с трансгенным объектом - кукурузой DBN9501 по настоящему изобретению, могут обеспечивать улучшенные гибридные трансгенные сорта кукурузы, устойчивые к разным насекомым и устойчивые к разным гербицидам. Данные сорта демонстрируют лучшие показатели, такие как повышенная продуктивность, по сравнению с нетрансгенными сортами и сортами, трансгенными по одному признаку.

Трансгенный объект - кукуруза DBN9501 по настоящему изобретению устойчив к повреждению в результате питания насекомых-вредителей Lepidoptera и устойчив к фитотоксичности сельскохозяйственных гербицидов, содержащих глюфосинат.Растение кукурузы, трансгенное по двум признакам, экспрессирует белок Vip3Aa19 Bacillus thuringiensis, обеспечивающий устойчивость к повреждению в результате питания насекомых-вредителей Lepidoptera (таких как Agrotis ypsilon Rottemberg), и экспрессирует белок - глюфосинат-устойчивую фосфинотрицин-N-ацетил-трансферазу (PAT) Streptomyces viridochromogenes, придающий растению устойчивость к глюфосинату. Кукуруза, трансгенная по двум признакам, имеет следующие преимущества: 1) избегают экономических потерь, обусловленных насекомыми-вредителями Lepidoptera (такими как Agrotis ypsilon Rottemberg и Helicoverpa armigera Hubner), где Agrotis ypsilon Rottemberg и Helicoverpa armigera Hubner являются основными насекомыми-вредителями в областях посадки кукурузы; 2) внесение сельскохозяйственных гербицидов, содержащих глюфосинат, придает кукурузе способность к борьбе с сорняками широкого спектра; и 3) продуктивность кукурузы не снижается. Кроме того, трансгены, кодирующие признаки устойчивости к насекомым и устойчивости к глюфосинату, связаны с одним и тем же сегментом ДНК, и существуют в одном локусе генома трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, которые обеспечивают усиленную эффективность скрещивания и позволяют отследить трансгенные вставленные фрагменты в служащей для размножения популяции и ее потомстве посредством использования молекулярных маркеров. Между тем, в способах выявления по настоящему изобретению SEQ ID NO: 1 или ее комплементарная последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарная последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарная последовательность или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарная последовательность могут быть использованы в качестве ДНК-праймеров или зондов для получения продуктов амплификации, позволяющих диагностировать трансгенный объект-кукурузу DBN9501 или его потомство, и могут быстро, точно и стабильно идентифицировать наличие растительных материалов из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO: 1 последовательность длиной 22 нуклеотида, которая расположена рядом с соединением со вставкой на 5'-конце вставленной последовательности в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501, где нуклеотиды 1-11 и нуклеотиды 12-22 расположены, соответственно, по обе стороны от участка вставки генома кукурузы;

SEQ ID NO: 2 последовательность длиной 22 нуклеотида, которая расположена рядом с соединением со вставкой на 3'-конце вставленной последовательности в трансгенном объекте-кукурузе DBN9501, где нуклеотиды 1-11 и нуклеотиды 12-22 расположены, соответственно, по обе стороны от участка вставки генома кукурузы;

SEQ ID NO: 3 последовательность из 768 нуклеотидов, которая расположена рядом с соединением со вставкой на 5'-конце вставленной последовательности в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501;

SEQ ID NO: 4 последовательность из 1339 нуклеотидов, которая расположена рядом с соединением со вставкой на 3'-конце вставленной последовательности в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501;

SEQ ID NO: 5 полная последовательность Т-ДНК, 5' и 3'-концевые геномные фланкирующие последовательности кукурузы;

SEQ ID NO: 6 последовательность, расположенная в SEQ ID NO: 3, охватывающая область левой границы (LB) и последовательность терминации транскрипции tNos;

SEQ ID NO: 7 последовательность, расположенная в SEQ ID NO: 4, охватывающая последовательность инициации транскрипции pr35S и область правой границы (RB);

SEQ ID NO: 8 первый праймер для амплификации SEQ ID NO: 3;

SEQ ID NO: 9 второй праймер для амплификации SEQ ID NO: 3;

SEQ ID NO: 10 первый праймер для амплификации SEQ ID NO: 4;

SEQ ID NO: 11 второй праймер для амплификации SEQ ID NO: 4;

SEQ ID NO: 12 праймер с 5'-фланкирующей геномной последовательности;

SEQ ID NO: 13 праймер с Т-ДНК, который соединяется с SEQ ID NO: 12;

SEQ ID NO: 14 праймер с 3'-фланкирующей геномной последовательности, который может быть использован в паре с SEQ ID NO: 12, для выявления того, является ли трансген гомозиготным или гетерозиготным;

SEQ ID NO: 15 праймер с Т-ДНК, который соединяется с SEQ ID NO: 14;

SEQ ID NO: 16 первый праймер для выявления гена Vip3Aa19 в Taqman;

SEQ ID NO: 17 второй праймер для выявления гена Vip3Aa19 в Taqman;

SEQ ID NO: 18 зонд для выявления гена Vip3Aa19 в Taqman;

SEQ ID NO: 19 первый праймер для выявления гена par в Taqman;

SEQ ID NO: 20 второй праймер для выявления pat в Taqman;

SEQ ID NO: 21 зонд для выявления гена в Taqman;

SEQ ID NO: 22 первый праймер для эндогенного гена кукурузы SSIIb;

SEQ ID NO: 23 второй праймер для эндогенного гена кукурузы SSIIb;

SEQ ID NO: 24 зонд для гена Vip3Aa19 в анализе на основе саузерн-блоттинга;

SEQ ID NO: 25 зонд для гена pat в анализе на основе саузерн-блоттинга; SEQ ID NO: 26 праймер с Т-ДНК, который имеет такое же направление, как SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 27 праймер с Т-ДНК, который имеет направление, противоположное SEQ ID NO: 13, и используется для получения фланкирующей последовательности;

SEQ ID NO: 28 праймер с Т-ДНК, которые имеет направление, противоположное SEQ ID NO: 13, и используется для получения фланкирующей последовательности;

SEQ ID NO: 29 праймер с Т-ДНК, который имеет такое же направление, как SEQ ID NO: 15;

SEQ ID NO: 30 праймер с Т-ДНК, который имеет направление, противоположное SEQ ID NO: 15, и используется для получения фланкирующей последовательности;

SEQ ID NO: 31 праймер с Т-ДНК, который имеет направление, противоположное SEQ ID NO: 15, и используется для получения фланкирующей последовательности.

Технические решения по настоящему изобретению будут дополнительно подробно описаны ниже со ссылкой на графические материалы и примеры.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой структурную схему участков соединения трансгенных вставленных последовательностей и геномов кукурузы в последовательностях нуклеиновой кислоты для выявления растений кукурузы и способов их выявления по настоящему изобретению, и схема относительных положений последовательностей нуклеиновых кислот для выявления растения кукурузы DBN9501 (в отношении схемы относительных положений, пожалуйста, см. В73 RefGen v3);

Фиг. 2 структурная схема рекомбинантного экспрессионного вектора DBN10707 в последовательностях нуклеиновой кислоты для выявления растения кукурузы DBN9501 и способов его выявления согласно настоящему изобретению;

На Фиг. 3 показан эффект на месте использования трансгенного объекта -кукурузы DBN9501 в последовательностях нуклеиновой кислоты для выявления растения кукурузы и способов его выявления согласно настоящему изобретению в условиях встречающихся в природе Agrotis ypsilon Rottemberg;

На Фиг. 4 показан эффект на месте использования трансгенного объекта -кукурузы DBN9501, инокулированного Helicoverpa armigera Hubner, в последовательностях нуклеиновой кислоты для выявления растения кукурузы DBN9501 и способов его выявления согласно настоящему изобретению;

На Фиг. 5 показан эффект на месте использования трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в последовательностях нуклеиновой кислоты для выявления растения кукурузы DBN9501 и способов его выявления согласно настоящему изобретению в условиях встречающихся в природе Spodoptera litura;

На Фиг. 6 показан эффект на месте использования трансгенного объекта -кукурузы DBN9501 в последовательностях нуклеиновой кислоты для выявления растения кукурузы DBN9501 и способов его выявления согласно настоящему изобретению в условиях встречающихся в природе Spodoptera exigua.

Подробное описание изобретения

Технические решения последовательностей нуклеиновой кислоты для выявления растения кукурузы DBN9501 и способы его выявления согласно настоящему изобретению будут дополнительно проиллюстрированы ниже со ссылкой на конкретные примеры.

Пример 1: Клонирование и трансформация

1.1 Клонирование вектора

Рекомбинантный экспрессионный вектор DBN10707 (как показано на Фиг. 2) конструируют посредством использования стандартных методик клонирования генов. Вектор DBN10707 содержит две трансгенные экспрессионные кассеты, расположенные последовательно: первая экспрессионная кассета состоит из промотора вируса мозаики цветной капусты (pr35S), содержащего тандемный повтор энхансерной области, функционально связанного с интроном белка теплового шока 70 кДа Zea mays (iZmHSP70), функционально связанного с белком устойчивости к насекомым Vip3Aa19 (cVip3Aa19) Bacillus thuringiensis, и функционально связанного с терминатором нопалинсинтетазы (tNos); вторая экспрессионная кассета состоит из промотора убиквитина 1 кукурузы (prZmUbi1), функционально связанного с устойчивой к глюфосинату фосфинотрицин-N-ацетил-трансферазой (сРАТ) Streptomyces viridochromogenes и функционально связанного с терминатором нопалинсинтетазы (tNos).

Вектором DBN10707 трансформируют Agrobacterium LBA4404 (Invitrogen, Chicago, США; кат. №: 18313-015) с использованием способа на основе жидкого азота, и 4-(гидрокси(метил)фосфинилфосфиноил)-DL-гомоаланин используют в качестве селектируемого маркера для осуществления скрининга трансформированных клеток.

1.2 Трансформация растений

Трансформацию проводят традиционным способом трансформации, опосредованным Agrobacterium, включающим: совместную культивацию незрелых зародышей кукурузы, культивируемых в стерильных условиях, с Agrobacterium, как описано в Примере 1.1, для трансформации Т-ДНК в рекомбинантном экспрессионном векторе DBN10707 в геном кукурузы, таким образом, чтобы получить трансгенный объект - кукурузу DBN9501.

Кратко, трансформация кукурузы, опосредованная Agrobacterium, включает: приведение незрелых зародышей, выделенных из кукурузы, в контакт с суспензией Agrobacterium, где Agrobacterium может переносить нуклеотидные последовательности генов Vip3Aa19 и pat в по меньшей мере одну клетку в одном из незрелых эмбрионов (стадия 1: стадия инфицирования), и на данной стадии незрелые эмбрионы предпочтительно погружали в суспензию Agrobacterium (OD₆₆₀ (от англ. optical density - оптическая плотность) равна 0,4-0,6, среда для инфицирования (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 68,5 г/л сахарозы, 36 г/л глюкозы, 40 мг/л ацетосирингона (AS), 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D); рН 5,3)) для начала инокуляции. Незрелые эмбрионы культивировали совместно с Agrobacterium на протяжении периода времени (3 суток) (стадия 2: стадия совместного культивирования). Предпочтительно, незрелые эмбрионы культивировали в твердой среде (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 20 г/л сахарозы, 10 г/л глюкозы, 100 мг/л ацетосирингона (AS), 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), 8 г/л агара; рН 5,8) после стадии инфицирования. После стадии совместного культивирования может иметь место возможная стадия «выделения». На стадии «выделения» среда для выделения (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), 250 мг/л цефамицина, 3 г/л растительного геля; рН 5,8) содержит по меньшей мере один антибиотик (150-250 мг/л цефамицина), который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium, одновременно не содержит никакого селективного агента для трансформантов растений (стадия 3: стадия восстановления). Предпочтительно, незрелые эмбрионы культивировали в твердой среде, содержащей антибиотик, но не селективный агент для устранения Agrobacterium и обеспечения периода выделения для инфицированных клеток. Затем, инокулированные незрелые зародыши культивировали на среде, содержащей селективный агент 4-(гидрокси(метил)фосфинил)-DL-гомоаланин, и отбирали растущие трансформированные каллусы (стадия 4: стадия селекции). Предпочтительно, незрелые зародыши культивировали в твердой селективной среде (4,3 г/г солей MS, витаминов MS, 300 мг/ л казеина, 30 г/л сахарозы, 250 мг/л цефамицина, 10 мг/л 4-(гидрокси(метил)фосфинил)-DL-гомоаланина, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), 3 г/л растительного геля; рН 5,8), содержащей селективный агент, который приводит к селективному росту трансформированных клеток. Затем, каллусы регенерировали в растения (стадия 5: стадия регенерации). Предпочтительно, каллусы, растущие на среде, содержащей селективный агент, культивировали в твердой среде (дифференциальная среда MS и среда для укоренения MS) для регенерации растений.

Устойчивые каллусы, полученные в результате скрининга, переносили на дифференциальную среду MS (4,3 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 2 мг/л 6-бензиладенина, 250 мг/л цефамицина, 5 мг/л 4-(гидрокси(метил)фосфинил)-DL-гомоаланина, 3 г/л растительного геля; рН 5,8) и культивировали для дифференцировки при 25°С. Дифференцированные проростки переносили на среду для укоренения MS (2,15 г/л солей MS, витаминов MS, 300 мг/л казеина, 30 г/л сахарозы, 250 мг/л цефамицина, 1 мг/л индол-3-уксусной кислоты, 3 г/л растительного геля; рН 5,8), и культивировали при 25°С.Когда проростки достигали примерно 10 см в высоту, их перемещали в теплицу и культивировали до плодоношения. В теплице их культивировали при 28°С в течение 16 часов и затем при 20°С в течение 8 часов/сутки.

1.3 Идентификация и осуществление скрининга трансгенных объектов

В общей сложности получали 200 независимых трансгенных Т₀ одиночных растений.

Поскольку генетическая трансформация и вставка гена могут влиять на агрономические признаки растений кукурузы (такие как карликовый и толстый стебель, лист, растущий в виде пучка, мозаика листьев, супротивный лист, патология в выметывании пестичных столбиков или стадии сбрасывания пыльцы или плохое плодоношение), более 200 независимых трансгенных Т₀ одиночных растений перемещали в теплицу для трансплантации и культивации для идентификации эффективности агрономического признака трансгенных Т₀ одиночных растений на разных стадиях (от фазы прорастания до фазы стеблевания, от фазы стеблевания до фазы сбрасывания пыльцы и от фазы налива зерна до фазы спелости), и получали в общей сложности 136 трансгенных Т₀ одиночных растений с нормальными агрономическими признаками.

Посредством анализа TaqMan™ у 136 указанных выше трансгенных растений кукурузы выявляли наличие однокопийных генов Vip3Aa19 и pat и отсутствие каркасных последовательностей вектора; и получали в общей сложности 83 трансгенных Т₀ одиночных растения. Посредством анализа участков трангенных вставок всего 28 трансгенных Т₀ одиночных растений подвергали скринингу, в которых данные последовательности с обеих сторон Т-ДНК были интактными, Т-ДНК не была вставлена в важные гены генома кукурузы, и вставка гена не приводила к какой-либо новой открытой рамке считывания (ORF - от англ. open reading frame). Посредством оценки и сравнения устойчивости в отношении основных целевых насекомых (таких как Agrotis ypsilon Rottemberg, Prodenia Iitura, Prodenia iitura и Spodoptera exigua), подвергали скринингу в общей сложности 13 трансгенных Т₀ одиночных растений с хорошей устойчивостью к насекомым. Посредством оценки и сравнения устойчивости к гербициду глюфосинат, в общей сложности 12 трансгенных Т₀ одиночных растений с хорошей устойчивостью к гербициду глюфосинат подвергали скринингу. В условиях разных поколений, разных географических сред и/или разного исходного материала посредством осуществления скрининга того, могут ли агрономические характеристики, молекулярная биология, устойчивость к исследуемым насекомым и устойчивость к гербициду глюфосинат трансгенного растения кукурузы стабильно наследоваться, трансгенный объект - кукурузу DBN9501 отбирали в качестве прекрасного объекта, который имеет одну копию трансгена (см. Пример 2), обладает хорошей устойчивостью к насекомым, устойчивостью к гербициду глюфосинат и эффективностью агрономического признака (см. Примеры 5 и 6).

Пример 2: Выявление трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 посредством TaqMan

Используя набор для выделения растительной ДНК (DNeasy Plant Maxi Kit, Qiagen), геномную ДНК выделяли из листа (примерно 100 мг) трагсгенного объекта -кукурузы DBN9501 в качестве образца, и число копий генов Vip3Aa19 и pat выявляли методом флуоресцентной количественной ПЦР с использованием зонда Taqman. Между тем, растение кукурузы дикого типа в качестве контроля подвергали выявлению и анализу в соответствии с указанными выше способами. Эксперименты проводили в трехкратной повторности, и рассчитывали среднее значение.

Конкретный способ выглядит следующим образом:

Стадия 1: 100 мг листа (после опыления) трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 растирали до гомогената в ступке с жидким азотом, и каждый образец приготовляли в трехкратной повторности;

Стадия 2: геномные ДНК указанных выше образцов выделяли с использованием набора DNeasy Plant Maxi из Qiagen (за подробными способами, пожалуйста, см. инструкции по применению продукта);

Стадия 3: концентрации геномных ДНК указанных выше образцов измеряли, используя ультрамикроспектрофотометр (NanoDrop 2000, Thermo Scientific);

Стадия 4: концентрации геномных ДНК указанных выше образцов доводили до одного и того же значения концентрации, находящегося в интервале от 80 до 100 нг/мкл;

Стадия 5: число копий образцов идентифицировали способом флуоресцентной количественной ПЦР с использованием зонда Taqman, где идентифицированный образец с известным числом копий использовали в качестве стандарта, и растение кукурузы дикого типа использовали в качестве контрольного образца. Каждый образец тестировали в трехкратной повторности, и рассчитывали и брали среднее значение. Последовательности праймеров и зондов для флуоресцентной количественной ПЦР выглядят следующим образом:

Следующие праймеры и зонд используют для выявления последовательности гена Vip3Aa19:

Праймер 1: cgaatacagaaccctgtcggc, как изложено в SEQ ID NO: 16 в перечне последовательностей;

Праймер 2: cgtgaggaaggtctcagaaatgac, как изложено в SEQ ID NO: 17 в перечне последовательностей;

Зонд 1: cgacgatggcgtgtatatgcctcttgg, как изложено в SEQ ID NO: 18 в перечне последовательностей;

Следующие праймеры и зонд используют для выявления последовательности гена pat

Праймер 3: gagggtgttgtggctggtattg, как изложено в SEQ ID NO: 19 в перечне последовательностей;

Праймер 4: tctcaactgtccaatcgtaagcg, как изложено в SEQ ID NO: 20 в перечне последовательностей;

Зонд 2: cttacgctgggccctggaaggctag, как изложено в SEQ ID NO: 21 в перечне последовательностей.

Система ПЦР-реакции содержит:

Где 50 × смесь праймеров/зонда содержит 45 мкл каждого праймера в концентрации 1 мМ, 50 мкл зонда в концентрации 100 мкМ и 860 мкл 1×ТЕ буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота); рН 8,0), и хранится в янтарной пробирке при 4°С.

Условия ПЦР-реакции включают следующее:

Данные анализировали, используя программное обеспечение быстрой системы флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems 7900НТ Fast Real-Time PCR System SDS v2.3, Applied Biosystems), которые демонстрировали, что полученный трансгенный объект - кукуруза DBN9501 является однокопийным.

Пример 3: Анализ участков вставки трансгенного объекта - кукурузы DBN9501

3.1 Выделение геномной ДНК

ДНК выделяли общепринятым способом на основе СТАВ (от англ. cetyl trimethyl ammonium bromide - цетилтриметиламмония бромид): после того, как 2 г молодого листа трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 растирали до порошка в жидком азоте, добавляли 0,5 мл СТАВ буфера для выделения ДНК (20 г/л СТАВ, 1,4 М NaCl, 100 мМ Tris-HCl и 20 мМ ЭДТА (эдетовая кислота) с подведением рН до 8,0 с помощью NaOH), предварительно нагретого при 65°С, затем их тщательно смешивали и проводили выделение при 65°С в течение 90 мин; 0,5 объема фенола и 0,5 объема хлороформа добавляли и смешивали посредством переворачивания; смесь центрифугировали при 12000 об./мин. (оборот/минута) в течение 10 мин; супернатант отсасывали, и добавляли 2 объема абсолютного этанола; центрифужную пробирку мягко встряхивали и затем оставляли стоять при 4°С в течение 30 мин; центрифужную пробирку снова центрифугировали при 12000 об./мин в течение 10 мин таким образом, что ДНК была собрана на дне пробирки; супернатант удаляли, и осадок промывали 1 мл 70%-ого этанола (массовая концентрация); смесь центрифугировали при 12000 об./мин. в течение 5 мин; осадок сушили в вакууме или просушивали в сверхчистом боксе; и полученный осадок ДНК растворяли в соответствующем количестве буфера ТЕ и хранили при -20°С.

3.2 Анализ фланкирующей последовательности ДНК

Измеряли концентрацию указанного выше образца выделенной ДНК и доводили до 80-100 нг/мкл. Геномную ДНК расщепляли, используя рестриктазы Крп I (анализ 5'-конца) и Spe I (анализ 3'-конца), соответственно. В каждую систему ферментативного расщепления добавляли 26,5 мкл геномной ДНК, 0,5 мкл указанных выше рестриктаз и 3 мкл буфера для ферментативного расщепления (все используемые рестриктазы представляют собой ферменты и их буферы, которые прилагаются в комплекте, или стандартные буферы из компании NEB (в настоящее время известные как NEBCutSmart), и подвергали расщеплению в течение 1 часа. После расщепления к системе ферментативного расщепления добавляли 70 мкл безводного этанола, хранили на ледяной бане в течение 30 мин и центрифугировали при 12000 об./мин. в течение 7 мин. После отбрасывания супернатанта осадок просушивали, затем к нему добавляли 8,5 мкл дважды дистиллированной воды, 1 мкл 10 × буфера для Т4 ДНК лигазы (NEB Т4 DNA Ligase Reaction Buffer; для того, чтобы узнать его конкретный состав, пожалуйста, зайдите на веб-сайты NEB или см. https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases или https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer) и 0,5 мкл Т4-ДНК лигазы и затем лигировали в течение ночи при 4°С. 5' и 3'-концевые геномные ДНК выделяли посредством ПЦР-амплификации, используя целый ряд вложенных праймеров. Конкретно, комбинация праймеров для выделения 5'-концевой геномной ДНК включает SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 26 в качестве первых праймеров, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 в качестве вторых праймеров и SEQ ID NO: 13 в качестве праймера для секвенирования. Комбинация праймеров для выделения 3'-концевой геномной ДНК включает SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 29 в качестве первых праймеров, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31 в качестве вторых праймеров и SEQ ID NO: 15 в качестве праймера для секвенирования. Условия ПЦР-реакции показаны в Таблице 3.

Продукт ПЦР амплификации выделяли посредством электрофореза продукта амплификации, полученного в результате указанной выше ПЦР-амплификации в агарозном геле с массовой долей 2,0% и выделения целевого фрагмента из агарозного матрикса с использованием набора для выделения из геля (Набор для выделения из геля QIAquick, кат. №_28704, Qiagen Inc., Valencia, СА). Затем, очищенный ПЦР-продукт амплификации секвенировали (например, с использованием ABI PrismTM 377, РЕ Biosystems, Foster City, СА) и анализировали (например, используя программное обеспечение для анализа последовательностей DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, WI).

5'- и 3'-фланкирующие последовательности и последовательности соединения подтверждали, используя стандартные способы на основе ПЦР. 5'-фланкирующие последовательности и последовательности соединения подтверждали, используя SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 12 в комбинации с SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 26. 3'-фланкирующие последовательности и последовательности соединения подтверждали, используя SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 14 в комбинации с SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 29. Системы ПЦР-реакции и условия амплификации показаны в Таблицах 2 и 3. Специалистам в данной области будет понятно, что другие последовательности праймеров могли бы быть также использованы для подтверждения фланкирующих последовательностей и последовательностей соединения.

ДНК-секвенирование ПЦР-продуктов амплификации предоставило ДНК, которую можно было бы использовать для конструирования других молекул ДНК, которые можно было бы использовать в качестве праймеров и зондов для идентификации растений или семян кукурузы, происходящих из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Обнаружили, что вставленная последовательность трансгенного объекта-кукурузы DBN9501 фланкирована с левой границы (5'-фланкирующая последовательность) геномной последовательностью кукурузы, показанной в нуклеотидах 1-384 SEQ ID NO: 5, и фланкирована с правой границы (3'-фланкирующая последовательность) геномной последовательностью кукурузы, показанной в нуклеотидах 7785-8559 SEQ ID NO: 5. 5'-последовательность соединения изложена в SEQ ID NO: 1 и 3'-последовательность соединения изложена в SEQ ID NO: 2.

3.3. ПЦР-анализ зиготности

Последовательность соединения представляет собой молекулу относительно короткого полинуклеотида, которая представляет собой новую ДНК-последовательность и позволяет диагностировать ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 при выявлении в выявлении и анализе полинуклеотидов. Последовательности соединения в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно, представляют собой полинуклеотиды из 11 нуклеотидов с обеих сторон участка вставки трансгенного фрагмента и геномной ДНК кукурузы в трансгенном объекте -кукурузе DBN9501. Более длинные или более короткие полинуклеотидные последовательности соединения могут быть выбраны из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Последовательности соединения (SEQ ID NO: 1, используемая как 5'-область соединения, и SEQ ID NO: 2, используемая как 3'-область соединения) полезны в способе выявления ДНК в качестве молекул ДНК-зондов или ДНК-праймеров. Последовательности соединения SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 также являются новыми последовательностями ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, и могли бы также использоваться для выявления наличия трансгенного объекта -кукурузы DBN9501 в качестве молекул ДНК-зондов или ДНК-праймеров. SEQ ID NO: 6 (нуклеотиды 385-574 SEQ ID NO: 3) охватывает ДНК-последовательность и последовательность терминации транскрипции tNos в конструкции DBN10707, и SEQ ID NO: 7 (нуклеотиды 252-451 SEQ ID NO: 4) охватывает последовательность инициации транскрипции pr35S и ДНК-последовательность в конструкции DBN10707.

Кроме того, ампликон получали посредством использования по меньшей мере одного праймера, происходящего из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, и с помощью указанного праймера, при использовании в способе на основе ПЦР, образовывался ампликон, позволяющий диагностировать трансгенный объект -кукурузу DBN9501.

Конкретно, продукт ПЦР-амплификации образовывался с 5'-конца трансгенной вставленной последовательности, содержащей участок геномной ДНК, фланкирующей 5'-конец вставленной последовательности Т-ДНК в геном растительного материала, происходящего из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. ПЦР-продукт амплификации содержал SEQ ID NO: 3. Для ПЦР-амплификации конструировали праймер 5 (SEQ ID NO: 8), который может гибридизоваться с последовательностью геномной ДНК, фланкирующей 5'-конец трансгенной вставленной последовательности, и праймер 6 (SEQ ID NO: 9), который использовался в паре с праймером 5 и был расположен в последовательности терминации транскрипции tNos вставленной последовательности Т-ДНК.

Продукт ПЦР-амплификации образовывался с 3'-конца трансгенной вставленной последовательности, содержащей участок геномной ДНК, фланкирующей 3'-конец вставленной последовательности Т-ДНК в геноме растительного материала, происходящего из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. ПЦР-продукт содержал SEQ ID NO: 4. Для ПЦР-амплификации конструировали праймер 7 (SEQ ID NO: 10), который был расположен в последовательности инициации транскрипции pr35S вставленной последовательности Т-ДНК, и праймер 8 (SEQ ID NO: 11), который использовался в паре с праймером 7 и может гибридизоваться с последовательностью геномной ДНК, фланкирующей 3'-конец трансгенной вставленной последовательности.

Условия амплификации ДНК, описанные в Таблице 2 и Таблице 3, могли быть использованы в упомянутых выше ПЦР-анализах зиготности для получения ампликона, позволяющего диагностировать трансгенный объект - кукурузу DBN9501. Выявление ампликонов могло быть проведено посредством использования термоциклера Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 или Eppendorf Mastercycler Gradien и тому подобное, или с помощью способов и приборов, известных специалистам в данной области.

Реакционные растворы аккуратно смешивали, и при отсутствии «горячей крышки» в термоциклере, сверху добавляли 1-2 капли минерального масла. Реакцию ПЦР проводили в термоциклере Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, СА), MJ Engine (MJ R-Biorad, Hercules, CA), Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Бостон, MA) или Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Гамбург, Германия) с использованием параметров циклов, показанных в Таблице 3. Термоциклер MJ Engine или Eppendorf Mastercycler Gradient следует запускать в расчетном режиме. Скорость изменения температуры термоциклера Perkin-Elmer 9700 должна быть установлена на максимальном значении при запуске.

Результаты показывают, что: при использовании в ПЦР-реакции геномной ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, праймеры 5 и 6 (SEQ ID NO: 8 и 9) приводят к получению продукта амплификации в виде фрагмента, размером 768 п.н., но когда данные праймеры использовали в ПЦР-реакциях с геномной ДНК нетрансформированной кукурузы и геномной ДНК кукурузы, не являющейся DBN9501, фрагмент не амплифицировался; при использовании в ПЦР-реакции геномной ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, праймеры 7 и 8 (SEQ ID NO: 10 и 11) приводят к получению продукта амплификации в виде фрагмента из 1339 п.н., но когда данные праймеры использовали в ПЦР-реакциях с геномной ДНК нетрансформированной кукурузы и геномной ДНК кукурузы, не являющейся DBN9501, фрагмент не был амплифицирован.

ПЦР-анализы в отношении зиготности также можно было использовать для идентификации того, является ли материал, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, гомозиготным или гетерозиготным. Праймер 9 (SEQ ID NO: 12), праймер 10 (SEQ ID NO: 13) и праймер 11 (SEQ ID NO: 14) использовали в реакции амплификации для получения ампликона, позволяющего диагностировать трансгенный объект - кукурузу DBN9501. Условия амплификации ДНК, описанные в Таблицах 4 и 5, могли быть использованы в указанных выше анализах зиготности с получением ампликона, позволяющего диагностировать трансгенный объект -кукурузу DBN9501.

ПЦР-реакцию проводили в термоциклере Stratagene Robocycler (Stratagene, La Jolla, СА), MJ Engine (MJ R-Biorad, Hercules, CA), Perkin-Elmer 9700 (Perkin Elmer, Boston, MA) или Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, Гамбург, Германия) с использованием параметров циклов, показанных в Таблице 5. Термоциклер MJ Engine или Eppendorf Mastercycler Gradient следует запускать в расчетном режиме. Скорость изменения температуры термоциклера Perkin-Elmer 9700 следует установить на уровне максимального значения при запуске.

В реакции амплификации биологический образец, содержащий ДНК-матрицу, содержит ДНК, позволяющую диагностировать наличие трансгенного объекта -кукурузы DBN9501. Или реакция амплификации будет приводить к получению двух разных ДНК-ампликонов, образованных из биологического образца, содержащего ДНК, происходящую из генома кукурузы, и ДНК, происходящая из генома кукурузы, является гетерозиготной в отношении соответствующей аллели вставленной ДНК в трансгенном объекте - кукурузе DBN9501. Данные два разных ампликона будут соответствовать первому ампликону (SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 14), происходящему из локуса генома кукурузы дикого типа, и второй ампликон (SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13), позволяющий диагностировать наличие ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. Результат, заключающийся в том, что образец ДНК кукурузы образует только один единственный ампликон, соответствующий второму ампликону, как описано в отношении гетерозиготного генома, мог бы свидетельствовать о наличии трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в данном образце, и данный образец получали из семян кукурузы, гомозиготных в отношении соответствующей аллели ДНК-вставки в трансгенном растении - кукурузе DBN9501.

Следует отметить, что пары праймеров трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 используют для получения ампликона, позволяющего диагностировать геномную ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. Данные пары праймеров включают, но не ограничиваются праймерами 5 и 6 (SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9), и праймерами 7 и 8 (SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11), и их используют в способе амплификации ДНК. Кроме того, праймеры контроля 12 и 13 (SEQ ID NO: 22 и 23) для амплификации эндогенного гена кукурузы включают в качестве внутреннего стандарта для условий реакции. Анализ образца для выделения ДНК трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 должен включать в качестве положительного контроля ДНК, выделенную из ткани из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, в качестве отрицательного контроля ДНК, выделенную из растения кукурузы, которое не является трансгенным объектом - кукурузой DBN9501, и отрицательный контроль, который не содержит ДНК, выделенной из кукурузы, в качестве матрицы. Помимо данных пар праймеров можно использовать любую пару праймеров из SEQ ID NO: 3 или ее комплементарной последовательности или SEQ ID NO: 4 или ее комплементарной последовательности. Когда данные праймеры используют для реакции амплификации ДНК они, соответственно, образуют ампликоны, которые содержат SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и позволяют диагностировать растительную ткань трансгенной кукурузы, происходящую из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. Условия амплификации ДНК, как описано в Таблицах 2-5, могут быть использованы в получении ампликона, позволяющего диагностировать трансгенный объект - кукурузы DBN9501, посредством использования подходящих пар прайеров. Экстракт ДНК растения или семени кукурузы, который приводит к образованию ампликона, позволяющего диагностировать трансгенный объект -кукурузу DBN9501 в способе амплификации ДНК, экстракт ДНК растения или семени кукурузы, который, как предполагают, содержит трансгенный объект - кукурузу DBN9501, или продукт, происходящий из трансгенного объекта-кукурузы DBN9501, можно использовать в качестве матрицы для амплификации для определения наличия трансгенного объекта - кукурузы DBN9501.

Пример 4: Выявление трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 посредством саузерн-блоттинга

4.1 Выделение ДНК для применения в саузерн-блоттинге Приблизительно от 5 до 10 г ткани листа растирали в жидком азоте с

использованием ступки и пестика. От 4 до 5 г растертой ткани листа ресуспендировали в 20 мл лизирующего СТАВ-буфера (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 20 мМ ЭДТА рН 8,0, 1,4 М NaCl, 0,2% (об./об.) β-меркаптоэтанола, 2% (масс/об.) СТАВ), и инкубировали при температуре 65°С в течение 60 минут.Во время инкубации образец однородно перемешивали посредством переворачивания один раз каждые 10 минут.После инкубации добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и аккуратно перемешивали посредством переворачивания для экстракции, и затем центрифугировали при скорости вращения 4000 об./мин. в течение 20 минут.Водную фазу собирали и повторно экстрагировали один раз равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). Водную фазу повторно собирали и добавляли с равным объемом изопропанола. Смесь перемешивали однородно, оставляли стоять при температуре -20°С в течение 1 часа для осаждения ДНК и затем центрифугировали при скорости вращения 4000 об./мин. в течение 5 минут с получением осадка ДНК, который впоследствии ресуспендировали в 1 мл ТЕ буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Для деградации какой-либо возможной РНК, ДНК инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут с 40 мкл 10 мг/мл РНКазы А, центрифугировали при скорости вращения 4000 об./мин. в течение 5 минут и затем центрифугировали при скорости вращения 12000 об./мин. в течение 10 минут для осаждения ДНК в присутствии 0,1 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 2 объемов безводного этанола. После отбрасывания супернатанта осадок промывали 1 мл 70% (об./об.) этанола и сушили при комнатной температуре и за тем ДНК повторно растворяли в 1 мл ТЕ буфера.

4.2 Расщепление рестриктазами

Концентрацию геномной ДНК упомянутого выше образца измеряли посредством использования спектрофотометра в сверхмикрообъемах (NanoDrop 2000, Thermo Scientific).

В реакционной системе 100 мкл для расщепления использовали 5 мкг ДНК. Геномную ДНК расщепляли соответственно рестриктазами Nco I и Nde I, используя фрагмент последовательностей генов Vip3Aa19 и pat в Т-ДНК в качестве зондов. Для каждого фермента продукты расщепления инкубировали в течение ночи при соответствующей температуре. Образец крутили на центрифужном вакуумном концентраторе (speed Vacuum, Thermo Scientific) для уменьшения объема до 20 мкл.

4.3 Электрофорез в геле

Загрузочный буфер бромфенолового синего добавляли к каждому образцу из Примера 4.2, и каждый образец загружали на 0,7% ТАЕ агарозный гель, содержащий этидия бромид. Смесь разделяли посредством электрофореза, используя ТАЕ электрофорезный буфер (40 мМ Tris-уксусная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 8,5), и электрофорез в геле запускали в течение ночи при напряжении 20 В.

После электрофореза гель обрабатывали 0,25 М HCl в течение 10 минут для осуществления депуринизации ДНК и затем обрабатывали денатурирующим раствором (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH) и нейтрализующим раствором (1,5 М NaCl, 0,5 М Tris-HCl, рН 7,2) в течение 30 минут, соответственно. 5×SSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0) наливали в фарфоровую чашку, накрывали куском стекла и затем последовательно помещали мостик из смоченной фильтровальной бумаги, гель, положительно заряженную нейлоновую мембрану (Roche, кат. №11417240001), три кусочка фильтровальной бумаги, бумажную башню и тяжелый объект.После мембранного переноса при комнатной температуре в течение ночи нейлоновую мембрану дважды промывали деионизированной водой, и ДНК иммобилизировали на мембране посредством ультрафиолетового сшивающего средства (UVP, UV Crosslinker CL-1000).

4.4 Гибридизация

Подходящую ДНК-последовательность амплифицировали посредством ПЦР для получения зонда. ДНК-зонды представляли собой SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25, или последовательности, частично гомологичные или комплементарные указанным выше последовательностям. DIG-мечение зондов, саузерн-блоттинг, промывку мембраны и другие операции проводили посредством использования стартового набора для мечения и выявления ДНК II (Roche, кат. №11585614910). В отнгшении конкретных способов, пожалуйста, см. их инструкции по применению продукта. Наконец, рентгеновскую пленку (Roche, кат №11666916001) использовали для выявления положения, в котором связан зонд.

Каждый саузерн-блоттинг включал два контрольных образца: (1) ДНК из негативного (нетрансформированного) сегреганта, который использовали для идентификации любых эндогенных последовательностей кукурузы, которые могли гибридизоваться с элемент-специфичным зондом; и (2) ДНК из негативного сегреганта, в который была введена Nco I-расщепленная плазмида DBN10707, в количестве, эквивалентном одиночному числу копий в зависимости от длины зонда, который использовали в качестве положительного контроля для гибридизации и для того, чтобы продемонстрировать чувствительность эксперимента.

Данные по гибридизации предоставили подтверждающее доказательство для поддержки ПЦР-анализа TaqMan™, а именно, растение кукурузы DBN9501 содержало гены Vip3Aa19 и pat в одной копии. Посредством использования зонда для гена Vip3Aa19, ферментативное расщепление Nco I и Ned I, соответственно, приводило к образованию одиночных полос, размером примерно 11 т.п.н. и 9 т.п.н.; и посредством использования зонда для гена pat, ферментативное расщепление Nco I и Ned I, соответственно, приводило к образованию одиночных полос, размером примерно 8,5 т.п.н. и 1,3 т.п.н. Это указывает на то, что гены Vip3Aa19 и pat были соответственно представлены в растении кукурузы DBN9501 в одной копии. Кроме того, полоса гибридизации не была получена с использованием зонда для каркаса. Это указывало на то, что каркасная последовательность вектора DBN10707 не была введена в геном растения кукурузы DBN9501 во время трансформации.

Пример 5: Выявление устойчивости объекта к насекомым

5.1 Биологический анализ растения кукурузы DBN9501

Два вида растений, трансгенный объект - кукурузу DBN9501 и растение кукурузы дикого типа (нетрансгенное, NGM), анализировали, используя Agrotis ypsilon Rottemberg (BCW), Spodoptera Iitura (TCW), Spodoptera exigua (BAW), Sesamia inferens (PSB), Chilo sacchariphagus (SGB) и Chilo infuscateiius (MSB) посредством следующих биологических анализов:

Получали свежие листья (период V3-V4) из двух типов растений, трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 и растения кукурузы дикого типа (нетрансгенного, NGM), соответственно, промывали стерильной водой и отсасывали воду с помощью марли. Затем, с удалением жилок, листья кукурузы нарезали на длинные полосы, размером примерно 1 см × 3 см. 1-3 кусочка длинной полосы листа (число листьев определили в зависимости от потребления пищи насекомым) помещали на фильтровальную бумагу, увлажненную дистиллированной водой, на дно круглых пластмассовых чашек Петри. 5-10 только что выведенных личинок посредством искусственного кормления помещали в каждую чашку. Затем, чашку Петри накрывали крышками и хранили в течение 3 суток в условиях, включающих температуру 26-28°С, относительную влажность 70%-80% и фотопериод (свет/темнота) 16:8, до получения статистического результата. Три индикатора, скорость развития личинки, смертность и долю повреждения листа, статистически анализировали с получением суммарного балла признака устойчивости (общий показатель: 300 баллов). Суммарный балл признака устойчивости = 100 × смертность + [100 × смертность+90 × (число только что выведенных насекомых/плотность личинок) + 60 × (число только что выведенных насекомых - число насекомых отрицательного контроля/плотности личинок) + 10 × (число насекомых отрицательного контроля/плотность личинок)] + 100 × (1 - доля повреждения листа), где плотность личинок относится к числу инокулированных личинок, а именно, 5 или 10 личинок (в зависимости от поглощения пищи насекомым) в каждой чашке; скорость развития личинки отражена в формуле суммарного балла признака устойчивости; и доля повреждения листа относится к доле площади питания насекомого в общей площади листа. Как в отношении трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, так и в отношении растения кукурузы дикого типа (нетрансгенного, NGM), анализировали пять растений, и каждый образец повторяли шесть раз. Результаты показаны в Таблицах 6 и 7.

Результаты показывают, что трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью в отношении Agrotis ypsilon Rottemberg, Spodoptera Iitura, Spodoptera exigua, Sesamia inferens, Chilo sacchariphagus и Chilo infuscatellus, и трансгенный объект - кукуруза DBN9501 демонстрирует значительно более высокую смертность анализируемых насекомых и суммарный балл признака устойчивости, чем NGM.

5.2 Эффект трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 на месте использования

Семена двух типов растений, трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 и растения кукурузы дикого типа (нетрансгенного, NGM), конструировали в качестве двух обработок. Каждая обработка сопровождала рандомизированную схему блоков с тремя повторностями. Площадь участка составляла 30 м² (5 м × 6 м), с расстоянием между рядами 60 см и расстоянием между растениями 25 см. Растения традиционно культивировали и регулировали, избегая распыления инсектицидов во время всего периода роста. Двухметровый интервал устанавливали среди экспериментальных участков для разных инокуляций насекомых для того, чтобы избежать распространения насекомых в разных участках.

(1) Agrotis ypsilon Rottemberg

Растения кукурузы подвергали только природному заражению на площади с серьезной распространенностью в природе Agrotis ypsilon Rottemberg (условия для возникновения повреждения насекомыми в природе: личинки Agrotis ypsilon Rottemberg, которые вызывали повреждение, представляют собой личинки первого поколения Agrotis ypsilon Rottemberg, которые легко развиваются в подходящих условиях окружающей среды, например, при температуре 16-26°С, относительной влажности 80-90% и влагосодержании почвы 15-20% или когда взрослые особи первого поколения, полученные посредством ловушек, достигают определенного количества, например, 20 или более). На стадии проростков кукурузы, когда материал проходил период примерно V2-V3, и растения кукурузы вырастали до фазы развертывания 2-3 листа, их отслеживали в отношении исследования того, встречалось ли увядание растений в NGM. Когда большинство из увядающих растений в NGM повреждались рядом с ризосферой старыми личинками на возрастной стадии 4-6-го возраста, степень повреждения (степень повреждения = число растений кукурузы, питающихся насекомыми/общее число растений × 100%) Agrotis ypsilon Rottemberg на растениях кукурузы исследовали поочередно. Результат по устойчивости трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 к Agrotis ypsilon Rottemberg показан в Таблице 8.

Результаты показывают, что в условиях распространенности в природе Agrotis ypsilon Rottemberg, по сравнению с NGM, трансгенный объект - кукуруза DBN9501 имеет значимо сниженную степень повреждения Agrotis ypsilon Rottemberg, что указывает на то, что трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью к Agrotis ypsilon Rottemberg. Эффект на месте использования трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в условиях распространенности в природе Agrotis ypsilon Rottemberg показан на Фиг. 3.

(2) Helicoverpa armigera Hubner (CBW)

Искусственную инокуляцию два раза проводили на стадии выметывания пестичных столбиков кукурузы. Не менее 40 растений в каждом участке подвергали искусственной инокуляции. Нити каждого растения кукурузы подвергали инокуляции примерно 20 только что вылупившимися личинками посредством искусственного кормления. Спустя 3 суток после инокуляции, вторую инокуляцию проводили такой же плотностью личинок, как и в первую инокуляцию. Спустя 14-21 суток после инокуляции степень повреждения женских початков, число выживших личинок на каждом женском початке и длину поврежденных женских початков исследовали поочередно. Исследование обычно проводили через 14 суток после инокуляции. Если уровень повреждения материала отрицательного контроля (NGM) достигал чувствительности или высокой чувствительности, он считался пригодным. Если уровень повреждения не достигал чувствительности или высокой чувствительности, исследование могло быть, соответственно, отсрочено; однако, если он все еще не достигал соответствующего уровня после 21 суток, данная инокуляция считалась непригодной. В соответствии со скоростью повреждения женских початков, рассчитывают число выживших личинок и длину повреждения (см) женских початков, среднее уровня повреждения женских початков кукурузы Helicoverpa armigera Hubner во время фазы колошения на каждом участке, и стандарт показан в Таблице 9. Уровень устойчивости кукурузы в фазу колошения к Helicoverpa armigera Hubner определяют в соответствии с критерием в Таблице 10. Результат по устойчивости трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 к Helicoverpa armigera Hubner в фазу выметывания пестичных столбиков показан в Таблице 11.

Результаты показывают, что в условиях искусственной инокуляции трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает значимо меньшей степенью повреждения, числом выживших личинок, длиной повреждения женских початков и уровнем повреждения женских початков, чем NGM, что, таким образом, указывает на то, что уровень устойчивости трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 к Helicoverpa armigera Hubner представляет собой (R). Эффект на месте использования трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, инокулированного Helicoverpa armigera Hubner, показан на Фиг. 4.

(3) Spodoptera litura (TCW)

Растения кукурузы подвергали лишь природному заражению на площади с серьезной распространенностью в природе Spodoptera Iitura (условия для возникновения повреждения насекомыми в природе: наиболее серьезное повреждение происходит с июля по сентябрь и при оптимальной температуре для роста насекомого-вредителя от 28 до 30°С). Через 10-15 суток после первого повреждения насекомыми и большая часть NGM были повреждены старыми личинками на возрастной стадии 4-6-го возраста, степень повреждения Spodoptera Iitura на растениях кукурузы исследовали поочередно (степень повреждения = число растений кукурузы, которыми питались насекомые/общее число растений × 100%). Результат по устойчивости трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 к Spodoptera Iitura показан в Таблице 12.

Результаты показывают, что в условиях природного заражения Spodoptera Iitura, по сравнению с NGM, трансгенный объект - кукуруза DBN9501 имеет значимо уменьшенную степень повреждения Spodoptera Iitura, что, таким образом, указывает на то, что трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью к Spodoptera Iitura. Эффект на месте использования трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в условиях природной распространенностью Spodoptera Iitura показан на Фиг. 5.

(4) Spodoptera exigua (BAW)

Эксперимент проводили, используя по существу такую же схему и способ, как схема и способ, описанные выше, для осуществления оценки устойчивости к Spodoptera Iitura, за исключением того, что через 10-15 суток после первого повреждений насекомыми и большинство NGM повреждались старыми личинками на возрастной стадии 4 - 5-го возраста, степень повреждения Spodoptera exigua на растениях кукурузы исследовали поочередности (степень повреждения = число растений кукурузы, которыми кормятся насекомые/общее число растений × 100%). Результат по устойчивости трансгенного объекта-кукурузы DBN9501 к Spodoptera exigua показан в Таблице 13.

Результаты показывают, что в условиях природного заражения Spodoptera exigua, по сравнению с NGM, трансгенный объект - кукуруза DBN9501 имеет значимо уменьшенную степень повреждения Spodoptera exigua, что указывает на то, что трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью к Spodoptera exigua. Эффект на месте использования трансгенного объекта -кукурузы DBN9501 в условиях природной распространенности Spodoptera exigua показан на Фиг. 6.

Следует особо отметить, что согласно раскрытиям, как описано в китайской патентной заявке №№201310289848.6, 201310573441.6, 201410806573.3, 201510259396.6 и 201610006375.8, и результатам по эффектам на месте использования трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 по настоящей заявке в отношении насекомых и их биологического анализа, трансгенный объект - кукуруза DBN9501 по настоящей заявке делает возможным способ и/или применение в осуществлении борьбы с насекомыми-вредителями, в частности, Sesamia inferens, Spodoptera litura, Chilo infuscatellus, Chilo sacchariphagus и Conogethes punctiferalis; иными словами, любое трансгенное растение кукурузы, экспрессирующее белок Vip3Aa19, может обеспечивать способ и/или применение для осуществления борьбы с Sesamia inferens, Spodoptera Iitura, Chilo infuscatellus, Chilo sacchariphagus и/или Conogethes punctiferalis.

Пример 6: Выявление устойчивости объекта к гербициду

Гербицид Basta (в котором активным ингредиентом является 18%-ный водный раствор глюфосината аммония) выбирали для нанесения распылением в эксперименте. Использовали рандомизированную схему блоков с тремя повторностями. Площадь участка составляла 15 м² (5 м × 3 м), расстояние между рядами - 60 см и расстояние между растениями - 25 см. Растения традиционно культивировали и регулировали, и среди данных участков устанавливали интервал в один метр. Трансгенный объект - кукурузу DBN9501 подвергали следующим двум обработкам: (1) отсутствие нанесения распылением, а распыление равного объема чистой воды при распылении гербицида во время обработки (2); и (2) нанесение распылением гербицида Basta в фазу V2-V3 листа в дозе 800 г а.и./га (а.и./га означает активный ингредиент на гектар»). Следует отметить, что гербицид глюфосинат (такой как Basta) представляет собой гербицид контактного типа; если с гербицидом обращаются несоответствующим образом в поле, например, локальная аккумуляция слишком большого количества раствора гербицида, может встречаться симптом фитотоксичности; это не означает, что с устойчивостью трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 имеются проблемы; и гербициды глюфосинат в разных концентрациях и композициях также применимы к следующему заключению, если они превращаются в указанное выше эквивалентное количество активного ингредиента глюфосината.

Исследование симптома фитотоксичности соответственно проводили через 1 неделю и 2 недели после применения, и урожайность участков определяли в момент сбора урожая. Градация симптомов фитотоксичности показана в Таблице 14. Устойчивость объекта трансформации к гербициду оценивали посредством использования степени повреждения от гербицида ав качестве индикатора. В частности, степень повреждения от гербицида (%) = Σ (число растений одного и того же уровня повреждения × номер уровня) / (общее число растений × самый высокий уровень), где степень повреждения от гербицида относилась к степени повреждения от глюфосината, которую определяли в соответствии с результатом исследования фитотоксичности через две недели после обработки глюфосинатом; и уровень устойчивости кукурузы к гербициду оценивали на основе степени повреждения от гербицида (глюфосината). Урожайность кукурузы каждого участка получали посредством взвешивания общего урожая (по массе) зерен кукурузы 3 рядов в середине каждого участка. Разницу в урожае у разных обработок оценивали как процент урожайности. Процент урожайности (%)=урожайность с нанесением распылением/урожайность без нанесения распылением. Результаты по устойчивости к гербициду трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 и урожайность кукурузы показаны в Таблице 15.

Результаты показывают, что, в отношении степени повреждения гербицидом глюфосинат: степень повреждения трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, которого обрабатывали гербицидом глюфосинат (800 г а.и./га), равнялась 0. Таким образом, трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью к гербициду глюфосинат.

В отношении урожайности, отсутствует значимое различие в урожайности трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 между обработкой без нанесения распылением и обработкой с нанесением распылением 800 г а.и./га глюфосината. После распыления гербицида глюфосинат трансгенный объект - кукуруза DBN9501 имеет урожайность с легким увеличением. Таким образом, это дополнительно показывает, что трансгенный объект - кукуруза DBN9501 обладает хорошей устойчивостью к гербициду глюфосинат.

Пример 7

Сельскохозяйственные продукты или товары могут быть получены из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501. Если в сельскохозяйственных продуктах или товарах выявляется достаточная экспрессия, ожидают, что они содержат нуклеотидные последовательности, которые могут позволить диагностировать наличие материала из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в сельскохозяйственных продуктах или товарах. Сельскохозяйственные продукты или товары включают, но не ограничиваются кукурузным маслом, кукурузной крупой, кукурузной мукой, кукурузным глютеном, кукурузными лепешками, кукурузным крахмалом и любыми другими пищевыми продуктами, предназначенными для потребления в качестве источника пищи животным, или иным образом любыми другим материалом, предназначенным в качестве наполнителя или в качестве компонента в косметической композиции для применения в косметологии и т.д. Способы выявления нуклеиновой кислоты на основе зондов или пар праймеров и/или наборы могут быть разработаны для выявления нуклеотидных последовательностей из трансгенного объекта - кукурузы DBN9501 в биологическом образце, таких как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, таким образом, чтобы диагностировать наличие трансгенного объекта - кукурузы DBN9501, где последовательность зонда или последовательность праймера выбрана из последовательностей, как показано в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 или их фрагментах.

В заключение, трансгенный объект - кукуруза DBN9501 по настоящему изобретению обладает хорошей устойчивостью к насекомым Lepidoptera и высокой устойчивостью к гербициду глюфосинат без снижения урожайности, и способы выявления по настоящему изобретению могут точно и быстро идентифицировать то, содержит ли биологический образец молекулу ДНК трансгенного объекта -кукурузы DBN9501.

Семена, соответствующие трансгенному объекту - кукурузе DBN9501, депонировали в соответствии с Будапештским договором в центре общей микробиологии китайского комитета по управлению коллекциями культур микроорганизмов (сокращенно CGMCC, адрес: No. 3, No.1 Precinct, Beichen West Road, Chaoyang District. Beijing, Institute of Microbiology, Academy of Sciences of China, zip code 100101) 23 января 2019 года, классификация и номенклатура которых представляют собой кукурузу (Zea mays), и номер доступа представляет собой CGMCC №17099. Депозит буде депонирован в депозитарии на протяжении 30 лет.

Наконец, следует отметить, что приведенные выше Примеры используют только лишь для иллюстрации технических решений настоящего изобретения, а не ограничения настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение описано подробно со ссылкой на предпочтительные Примеры, специалисты в данной области должны понимать, что технические решения настоящего изобретения могли бы быть модифицированы или заменены эквивалентно без отступления от сущности и объема технических решений настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BEIJING DABEINONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

<120> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РАСТЕНИЯ

КУКУРУЗЫ DBN9501 И СПОСОБ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ

<130> FP1200078P/CB

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> ДНК

<213> последовательность из 22 нуклеотидов, которая расположена

около соединения со вставкой

на 5’-конце вставленной последовательности в DBN9501 (искусственная

последовательность)

<400> 1

ggggaaaagt taataacaca tt

22

<210> 2

<211> 22

<212> ДНК

<213> последовательность из 22 нуклеотидов, которая расположена

около соединения со вставкой

на 3’-конце вставленной последовательности в DBN9501 (искусственная

последовательность)

<400> 2

gtttaaacta tcagtgtaac ta

22

<210> 3

<211> 768

<212> ДНК

<213> последовательность из 768 нуклеотидов, которая расположена

около соединения со вставкой

на 5’-конце вставленной последовательности в DBN9501 (искусственная

последовательность)

<400> 3

tgtccggcat acctgttcat catttaaata atctaacacg gagtgtcctt tcttgagtga

60

cgcgccaaac ggtgtacttc tgttgtttct tgagtgacat aaaatggtgt acttctatta

120

cctaaggcat aattctaatt tataaagaga aggtaataca gccacaaatt agtaacatct

180

aagcaaatac agcactgctt ctggaaattt tatcatctat attcagtaag ctaaacccag

240

ccactattaa gtttcatgat tttatcatat gaaaaaaaaa tccaaagaaa ccatacggtt

300

atcaaaaact tagaaaaaca ggatgccttt ttgccaaagg gatttgatag acctttattt

360

ttcaggaaaa acaggggaaa agttaataac acattgcgga tacggccagg cgcgtccctg

420

ttaacgtcct aactagctaa actaggtaca gattgcgagg ctcacgaggc gatcctggcc

480

gcgtgacagt cgcgtgcgag gctcttgact aagtaggcgg ccgcgtgcac ttaattaaga

540

attccctgca gggatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg

600

cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa

660

aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat

720

tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattca

768

<210> 4

<211> 1339

<212> ДНК

<213> последовательность из 1339 нуклеотидов, которая расположена

около соединения со вставкой

на 3’-конце вставленной последовательности в DBN9501 (искусственная

последовательность)

<400> 4

caatcggacc atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt

60

ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt

120

caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca

180

ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata

240

ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatcggac caagcttatt taaatggtac cttaattaag

300

tgcacgttta aactacctag tcagtgccgt tgagagcgta gctgcgactt agcggcctcg

360

tctgcgaagt cggtgaggct agtgccacta attagtcatt agtttaatac aaatccacct

420

gcggccaatt cctgcagcgt tgcggttctg tcagttccaa acgtaaaacg gcttgtcccg

480

cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc cgctcatgat cagattgtcg

540

tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt aactataaat ggtatagtag tccggatttt

600

gtttccgaat aaagaaatgt tcaatgtatt tgaaatgatc aatagatact caaattatat

660

gattagcaag cttaaataga gttttttttt caggtccatt tcttttcctt agattacaga

720

agcaccataa cacattccaa aagtaattgc atgcacccaa gaatctgcta atgttccaag

780

tgttgaaaac aaccaaaact gtacttatca cttaatgaaa tacatggcac aaacaaaaaa

840

aaaaactgaa tatgcctgcg aacatagcag aagtggttgt catgtactag aaacattatt

900

gtgtcttcga acaagctgct catataatgg aagatggttc tttgcaacaa aaaccctgaa

960

cctgtaaagc aaatgagaag gacaattaag cataaataaa ggtgcaataa cacaagggaa

1020

caaaccacta aaccaatgtt ttaaagttgc ccgactaatc gtgattactc aaccttattg

1080

cagcacgatt aggattaggc tgtacgacac gactagggtg attagaactc ggatcgtctg

1140

actaatcatg attaaacggt gattagtcat cggactagga gttcaaccca ctaacctgag

1200

ccgcctgact ttttttttgg gccggaccac agtgggtaag gtttttttat tttctcttga

1260

caaaaccctg tctgccctag gatacgaacg tatcatgtac ctacagccga cggctccagt

1320

tcgcggcttt cctcctatc

1339

<210> 5

<211> 8559

<212> ДНК

<213> полная последовательность Т-ДНК, 5’ и 3’-концевые геномные

фланкирующие последовательности кукурузы (искусственная

последовательность)

<400> 5

tgtccggcat acctgttcat catttaaata atctaacacg gagtgtcctt tcttgagtga

60

cgcgccaaac ggtgtacttc tgttgtttct tgagtgacat aaaatggtgt acttctatta

120

cctaaggcat aattctaatt tataaagaga aggtaataca gccacaaatt agtaacatct

180

aagcaaatac agcactgctt ctggaaattt tatcatctat attcagtaag ctaaacccag

240

ccactattaa gtttcatgat tttatcatat gaaaaaaaaa tccaaagaaa ccatacggtt

300

atcaaaaact tagaaaaaca ggatgccttt ttgccaaagg gatttgatag acctttattt

360

ttcaggaaaa acaggggaaa agttaataac acattgcgga tacggccagg cgcgtccctg

420

ttaacgtcct aactagctaa actaggtaca gattgcgagg ctcacgaggc gatcctggcc

480

gcgtgacagt cgcgtgcgag gctcttgact aagtaggcgg ccgcgtgcac ttaattaaga

540

attccctgca gggatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg

600

cgcgctatat tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa

660

aaacccatct cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat

720

tcaacagaaa ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac

780

tttattgcca aatgtttgaa cgatcactag ttcagatctg ggtaactggc ctaactggcc

840

ttggaggagc tggcaactca aaatcccttt gccaaaaacc aacatcatgc catccaccat

900

gcttgtatcc agctgcgcgc aatgtacccc gggctgtgta tcccaaagcc tcatgcaacc

960

taacagatgg atcgtttgga aggcctataa cagcaaccac agacttaaaa ccttgcgcct

1020

ccatagactt aagcaaatgt gtgtacaatg tggatcctag gcccaacctt tgatgcctat

1080

gtgacacgta aacagtactc tcaactgtcc aatcgtaagc gttcctagcc ttccagggcc

1140

cagcgtaagc aataccagcc acaacaccct caacctcagc aaccaaccaa gggtatctat

1200

cttgcaacct ctctagatca tcaatccact cttgtggtgt ttgtggctct gtcctaaagt

1260

tcactgtaga cgtctcaatg taatggttaa cgatatcaca aaccgcggcc atatcagctg

1320

ctgtagctgg cctaatctca actggtctcc tctccggaga catggtaccc tgcagaagta

1380

acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa agaaacagta ccaagcaaat aaatagcgta

1440

tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat atgccatcat ccaagtatat

1500

caagatcaaa ataattataa aacatacttg tttattataa tagataggta ctcaaggtta

1560

gagcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa acccacatca

1620

acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa ctatgaagat

1680

gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta ataaatacac caggtagttt gaaacagtat

1740

tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat cacaaccaag

1800

cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg tatacctatc

1860

ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt atggcacaca

1920

catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattc tactccgatc

1980

tagaacgacc gcccaaccag accacatcat cacaaccaag acaaaaaaaa gcatgaaaag

2040

atgacccgac aaacaagtgc acggcatata ttgaaataaa ggaaaagggc aaaccaaacc

2100

ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa tcgatcccgt ctgcggaacg gctagagcca

2160

tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc aagttagcaa tcagaacgtg tctgacgtac

2220

aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg gatctaacac

2280

aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc ctaaccatgg accggaacgc cgatctagag

2340

aaggtagaga gggggggggg gggaggacga gcggcgtacc ttgaagcgga ggtgccgacg

2400

ggtggatttg ggggagatct ggttgtgtgt gtgtgcgctc cgaacaacac gaggttgggg

2460

aaagagggtg tggagggggt gtctatttat tacggcgggc gaggaaggga aagcgaagga

2520

gcggtgggaa aggaatcccc cgtagctgcc ggtgccgtga gaggaggagg aggccgcctg

2580

ccgtgccggc tcacgtctgc cgctccgcca cgcaatttct ggatgccgac agcggagcaa

2640

gtccaacggt ggagcggaac tctcgagagg ggtccagagg cagcgacaga gatgccgtgc

2700

cgtctgcttc gcttggcccg acgcgacgct gctggttcgc tggttggtgt ccgttagact

2760

cgtcgacggc gtttaacagg ctggcattat ctactcgaaa caagaaaaat gtttccttag

2820

tttttttaat ttcttaaagg gtatttgttt aatttttagt cactttattt tattctattt

2880

tatatctaaa ttattaaata aaaaaactaa aatagagttt tagttttctt aatttagagg

2940

ctaaaataga ataaaataga tgtactaaaa aaattagtct ataaaaacca ttaaccctaa

3000

accctaaatg gatgtactaa taaaatggat gaagtattat ataggtgaag ctatttgcaa

3060

aaaaaaagga gaacacatgc acactaaaaa gataaaactg tagagtcctg ttgtcaaaat

3120

actcaattgt cctttagacc atgtctaact gttcatttat atgattctct aaaacactga

3180

tattattgta gtactataga ttatattatt cgtagagtaa agtttaaata tatgtataaa

3240

gatagataaa ctgcacttca aacaagtgtg acaaaaaaaa tatgtggtaa ttttttataa

3300

cttagacatg caatgctcat tatctctaga gaggggcacg accgggtcac gctgcactgc

3360

aggccctagg atttaagtga ctagggtcac gtgactctag tcacttactg gcgcgccgat

3420

ctagtaacat agatgacacc gcgcgcgata atttatccta gtttgcgcgc tatattttgt

3480

tttctatcgc gtattaaatg tataattgcg ggactctaat cataaaaacc catctcataa

3540

ataacgtcat gcattacatg ttaattatta catgcttaac gtaattcaac agaaattata

3600

tgataatcat cgcaagaccg gcaacaggat tcaatcttaa gaaactttat tgccaaatgt

3660

ttgaacgatc tcacttgatg ctcacgtcgt aaaaatgaac aatggggccg ccgtagaggt

3720

tattcccttg ggacagttcg atataaaagt tgtccttctc aaacttcgtg gtgaacattt

3780

ctgacacatc cttagcgcca gacatgtatc tcttctcgaa gaggacttcc cgcgagttcc

3840

tgatgcgcac attcgcgtcg ccggaaactg aaaaatagac tctgtaggta gagaacgaat

3900

ccagttggag gttctgcttc agaatgcctc tcccgccctg gtaaagcgtc agggtgttcc

3960

ccgagatatt cgtgctgcca gtggatgtcc agttattggt gttaatcagc tcggggctca

4020

ggagcttctc gctaggggag atttcgagaa tgatgaagtt gtcgccccag gcctcatcgc

4080

cattctggga cttgagaata agatagaccc ccttcaggtc agtgccagtt gtgaacctct

4140

tattgattgt ctggtagtcc tccaggttgt tgttagtatc ttcgtaatgg atgtaccctg

4200

tgttctcatc cttgaggtgg atgcttggct tgcccttcac agtatattga atcacgtatt

4260

ctgtcttcgg cttcagcttg tcgccaatga actgggagat gccaccatcc ttatgcacat

4320

agagcgcctt agtgccattc accccgcctg tgtggtcaac gtatgcgttc ttattgttag

4380

ccttccacgg ttccagatta tcttcctcaa ttgacccgtt ctccacaata ttggagatga

4440

agcctgatgg cggaacgatc agcttcgttt ccttgttaga gaggtcggtg gcaagcagca

4500

gctccctgag gtagctcttg cacgtaaggg tgatcaggcg ggagttctca tctgcctgga

4560

gcccaaagcc attgatgggc gtgaggaagg tctcagaaat gaccccaaga ggcatataca

4620

cgccatcgtc gttcgccgac agggttctgt attcggcctc ggatgattcg accttcttct

4680

tgttgaggtc gatctcgccc gtagacgaat catagaagtt agccgtcacc tcgtaccgga

4740

gtgtcttcat cttcttcgta aagtcaatct tggtgatcac gtattcgttg gggaagacaa

4800

tattgttcgt atagtagatt tgctcggact gatcagggca aagcagctta tccatgtcgc

4860

cgtagataac ctctgacaga gaatccttgt ccacttgata attctgcttg agcttcgcct

4920

cgtagacctt cagcacggta attgagtcgt tagaaatctc gaacccgatg agcgcatggc

4980

caggcttggc ctcaacgatc atctttgcat cttcgtcgga gcccttgacc ttagcgtagt

5040

ttggattaga aaaagtgttc gagagtgtcg gaaggatatt cacgcggaac tcctccttct

5100

ccttgttcag gtgctcgttc atgatggagg tgtaatcgat gtctgcgagg ccgaggagct

5160

tgcggcaggt ggtcagcgtg agaaacgctt gggcctggag tgcggtgagg acgataagga

5220

agttgtaaac attcccgacc tccgagccgc tcgtcttaac gttctccttg gtgatcagtt

5280

ccgatgcagt cttgagagcg ctccgcccaa aaagattgtt gcccaccata acgtcgtgga

5340

acgtgttcag gtaaaactcg aagccatcga cgtcattctt ggtcacggac ttcgccagct

5400

cagtgagttc tgtaagctca tccaggatgt cggctggtga gccatccttc ttgaccttgc

5460

tggaagtttc tgtagcaaaa gtgagttcct cgaacttctc attcacatac ttgatcctct

5520

ggtacgccgg tgtaatctcc gtcagggtgc tgttgatgag gacgttcaca ttaatgatat

5580

ccagcttgtc cgagatttct tgaagctgct tgctcagata ctcaatttga agggacagcg

5640

cgtagttctg cttcatgacg tccgagagca tgctagtaat ctttgggagg tacacgcgaa

5700

gcattgtgtt gatggcgtcg agcttattgt tcacatcatt aagaacttgg ttctgctcat

5760

ttgcaatctt gaggatctcc ttagacagtt ctgtgttgag attcccctga gcgatgaggt

5820

cgttaagtga cccattcacg ccgtccagct tgccagagat atcgttcagg agttgctgat

5880

tcttaagaat ctcgtcgagc gtaagatccc cgccagtgtc tgtcttgaag atcatgttca

5940

taatgtcctt gatccccgta gcaaacccat agatgccatt aaagtagtca ataaaggagg

6000

gaagtgcccg tgtggagagc ttggtgttgt tcttgttcat actagtggcc gcttggtatc

6060

tgcattacaa tgaaatgagc aaagactatg tgagtaacac tggtcaacac tagggagaag

6120

gcatcgagca agatacgtat gtaaagagaa gcaatatagt gtcagttggt agatactaga

6180

taccatcagg aggtaaggag agcaacaaaa aggaaactct ttatttttaa attttgttac

6240

aacaaacaag cagatcaatg catcaaaata ctgtcagtac ttatttcttc agacaacaat

6300

atttaaaaca agtgcatctg atcttgactt atggtcacaa taaaggagca gagataaaca

6360

tcaaaatttc gtcatttata tttattcctt caggcgttaa caatttaaca gcacacaaac

6420

aaaaacagaa taggaatatc taattttggc aaataataag ctctgcagac gaacaaatta

6480

ttatagtatc gcctataata tgaatcccta tactattgac ccatgtagta tgaagcctgt

6540

gcctaaatta acagcaaact tctgaatcca agtgccctat aacaccaaca tgtgcttaaa

6600

taaataccgc taagcaccaa attacacatt tctcgtattg ctgtgtaggt tctatcttcg

6660

tttcgtacta ccatgtccct atattttgct gctacaaagg acggcaagta atcagcacag

6720

gcagaacacg atttcagagt gtaattctag atccagctaa accactctca gcaatcacca

6780

cacaagagag cattcagaga aacgtggcag taacaaaggc agagggcgga gtgagcgcgt

6840

accgaagacg gttctgctag agtcagcttg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact

6900

tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc

6960

agtggagata tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc

7020

cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc

7080

aacgatggcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac

7140

tatcttcaca ataaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat

7200

taccctttgt tgaaaagtct caatcggacc atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt

7260

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc

7320

actgtcggca gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta

7380

ggagccacct tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa

7440

tccgaggagg tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatcggac caagcttatt

7500

taaatggtac cttaattaag tgcacgttta aactacctag tcagtgccgt tgagagcgta

7560

gctgcgactt agcggcctcg tctgcgaagt cggtgaggct agtgccacta attagtcatt

7620

agtttaatac aaatccacct gcggccaatt cctgcagcgt tgcggttctg tcagttccaa

7680

acgtaaaacg gcttgtcccg cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc

7740

cgctcatgat cagattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt aactataaat

7800

ggtatagtag tccggatttt gtttccgaat aaagaaatgt tcaatgtatt tgaaatgatc

7860

aatagatact caaattatat gattagcaag cttaaataga gttttttttt caggtccatt

7920

tcttttcctt agattacaga agcaccataa cacattccaa aagtaattgc atgcacccaa

7980

gaatctgcta atgttccaag tgttgaaaac aaccaaaact gtacttatca cttaatgaaa

8040

tacatggcac aaacaaaaaa aaaaactgaa tatgcctgcg aacatagcag aagtggttgt

8100

catgtactag aaacattatt gtgtcttcga acaagctgct catataatgg aagatggttc

8160

tttgcaacaa aaaccctgaa cctgtaaagc aaatgagaag gacaattaag cataaataaa

8220

ggtgcaataa cacaagggaa caaaccacta aaccaatgtt ttaaagttgc ccgactaatc

8280

gtgattactc aaccttattg cagcacgatt aggattaggc tgtacgacac gactagggtg

8340

attagaactc ggatcgtctg actaatcatg attaaacggt gattagtcat cggactagga

8400

gttcaaccca ctaacctgag ccgcctgact ttttttttgg gccggaccac agtgggtaag

8460

gtttttttat tttctcttga caaaaccctg tctgccctag gatacgaacg tatcatgtac

8520

ctacagccga cggctccagt tcgcggcttt cctcctatc

8559

<210> 6

<211> 190

<212> ДНК

<213> последовательность, расположенная в SEQ ID NO:3, охватывающая

область левой границы (LB)

и последовательность терминации транскрипции tNos (искусственная

последовательность)

<400> 6

aataacacat tgcggatacg gccaggcgcg tccctgttaa cgtcctaact agctaaacta

60

ggtacagatt gcgaggctca cgaggcgatc ctggccgcgt gacagtcgcg tgcgaggctc

120

ttgactaagt aggcggccgc gtgcacttaa ttaagaattc cctgcaggga tctagtaaca

180

tagatgacac

190

<210> 7

<211> 200

<212> ДНК

<213> последовательность, расположенная в SEQ ID NO: 4, охватывающая

последовательность инициации транскрипции pr35S

и область правой границы (RB) (искусственная последовательность

<400> 7

tgaaaagtct caatcggacc aagcttattt aaatggtacc ttaattaagt gcacgtttaa

60

actacctagt cagtgccgtt gagagcgtag ctgcgactta gcggcctcgt ctgcgaagtc

120

ggtgaggcta gtgccactaa ttagtcatta gtttaataca aatccacctg cggccaattc

180

ctgcagcgtt gcggttctgt

200

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> первый праймер для амплификации SEQ ID NO: 3 (Искусственная

последовательность)

<400> 8

tgtccggcat acctgttcat c

21

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> второй праймер для амплификации SEQ ID NO: 3 (Искусственная

последовательность)

<400> 9

tgaatcctgt tgccggtctt

20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> первый праймер для амплификации SEQ ID NO: 4 (Искусственная

последовательность)

<400> 10

gataggagga aagccgcgaa

20

<210> 11

<211> 21

<212> ДНК

<213> второй праймер для амплификации SEQ ID NO: 4 (Искусственная

последовательность)

<400> 11

caatcggacc atcacatcaa t

21

<210> 12

<211> 22

<212> ДНК

<213> праймер из 5' фланкирующей геномной последовательности

(Искусственная последовательность)

<400> 12

tgccaaaggg atttgataga cc

22

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> прамер из T-ДНК, который спарен с SEQ ID NO: 12 (Искусственная

последовательность)

<400> 13

gccgtatccg caatgtgtta

20

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК

<213> праймер с 3’-фланкирующей геномной последовательности, который

может быть использован в паре с SEQ ID NO: 12, для выявления того,

является ли трансген гомозиготным или гетерозиготным (Искусственная

последовательность)

<400> 14

ttttggaatg tgttatggtg c

21

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> прамер из T-ДНК, который спарен с SEQ ID NO: 14 (Искусственная

последовательность)

<400> 15

cgttgagagc gtagctgcga

20

<210> 16

<211> 21

<212> ДНК

<213> первый праймер для выявления гена Vip3Aa19 в Taqman

(Искусственная последовательность)

<400> 16

cgaatacaga accctgtcgg c

21

<210> 17

<211> 24

<212> ДНК

<213> второй праймер для выявления гена Vip3Aa19 в Taqman

(Искусственная последовательность)

<400> 17

cgtgaggaag gtctcagaaa tgac

24

<210> 18

<211> 27

<212> ДНК

<213> зонд для выявления гена Vip3Aa19 в Taqman (Искусственная

последовательность)

<400> 18

cgacgatggc gtgtatatgc ctcttgg

27

<210> 19

<211> 22

<212> ДНК

<213> первый праймер для выявления гена pat в Taqman (Искусственная

последовательность)

<400> 19

gagggtgttg tggctggtat tg

22

<210> 20

<211> 23

<212> ДНК

<213> второй праймер для выявления pat в Taqman

(Искусственная последовательность)

<400> 20

tctcaactgt ccaatcgtaa gcg

23

<210> 21

<211> 25

<212> ДНК

<213> зонд для выявления гена pat в Taqman (Искусственная

последовательность)

<400> 21

cttacgctgg gccctggaag gctag

25

<210> 22

<211> 21

<212> ДНК

<213> первый праймер для эндогенного гена кукурузы SSIIb

(Искусственная последовательность)

<400> 22

cggtggatgc taaggctgat g

21

<210> 23

<211> 23

<212> ДНК

<213> второй праймер для эндогенного гена кукурузы SSIIb

(Искусственная последовательность)

<400> 23

aaagggccag gttcattatc ctc

23

<210> 24

<211> 348

<212> ДНК

<213> зонд для гена Vip3Aa19 в анализе на основе саузерн-блоттинга

(Искусственная последовательность)

<400> 24

tctcaagtcc cagaatggcg atgaggcctg gggcgacaac ttcatcattc tcgaaatctc

60

ccctagcgag aagctcctga gccccgagct gattaacacc aataactgga catccactgg

120

cagcacgaat atctcgggga acaccctgac gctttaccag ggcgggagag gcattctgaa

180

gcagaacctc caactggatt cgttctctac ctacagagtc tatttttcag tttccggcga

240

cgcgaatgtg cgcatcagga actcgcggga agtcctcttc gagaagagat acatgtctgg

300

cgctaaggat gtgtcagaaa tgttcaccac gaagtttgag aaggacaa

348

<210> 25

<211> 310

<212> ДНК

<213> зонд для гена pat в анализе на основе саузерн-блоттинга

(Искусственная последовательность)

<400> 25

cagacttaaa accttgcgcc tccatagact taagcaaatg tgtgtacaat gtggatccta

60

ggcccaacct ttgatgccta tgtgacacgt aaacagtact ctcaactgtc caatcgtaag

120

cgttcctagc cttccagggc ccagcgtaag caataccagc cacaacaccc tcaacctcag

180

caaccaacca agggtatcta tcttgcaacc tctctagatc atcaatccac tcttgtggtg

240

tttgtggctc tgtcctaaag ttcactgtag acgtctcaat gtaatggtta acgatatcac

300

aaaccgcggc

310

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> праймер с T-ДНК, который имеет такое же направление, как SEQ

ID NO: 13 (Искусственная Последовательность)

<400> 26

gcgcgcaaac taggataaat

20

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> праймер c T-ДНК, который имеет направление, противоположное

SEQ ID NO: 13

и используется для получения фланкирующей последовательности

(Искусственная Последовательность)

<400> 27

ccagccacaa caccctcaac

20

<210> 28

<211> 22

<212> ДНК

<213> праймер c T-ДНК, который имеет направление, противоположное

SEQ ID NO: 13

и используется для получения фланкирующей последовательности

(Искусственная Последовательность)

<400> 28

gtggtgtttg tggctctgtc ct

22

<210> 29

<211> 22

<212> ДНК

<213> праймер с T-ДНК, который имеет такое же направление, как SEQ

ID NO: 15 (Искусственная Последовательность)

<400> 29

tgctttgaag acgtggttgg aa

22

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> праймер c T-ДНК, который имеет направление, противоположное

SEQ ID NO: 15

и используется для получения фланкирующей последовательности

(Искусственная Последовательность)

<400> 30

ctgctccttt attgtgacca

20

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> праймер c T-ДНК, который имеет направление, противоположное

SEQ ID NO: 15

и используется для получения фланкирующей последовательности

(Искусственная Последовательность)

<400> 31

tatcttgctc gatgccttct

20

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты для выявления наличия ДНК. Также раскрыты сельскохозяйственный продукты, содержащие указанную молекулу ДНК, набор для выявления ДНК. Раскрыты способ выявления наличия ДНК; способ защиты растения кукурузы от нашествия насекомых и от повреждения, вызываемого гербицидом; способ получения растения кукурузы. Изобретение позволяет эффективно получать растение, устойчивое к насекомым-вредителям и устойчивое к гербициду глюфосинат. 14 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 15 табл., 7 пр.

1. Молекула нуклеиновой кислоты для выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы в образце, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 3 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 4 или ее комплементарную последовательность.

3. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит SEQ ID NO: 5 или ее комплементарную последовательность.

4. Способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы в образце, где способ включает:

- приведение образца, подлежащего выявлению, в контакт с по меньшей мере двумя праймерами для амплификации целевого продукта амплификации в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, где праймеры включают первый праймер и второй праймер, где первый праймер выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10, и второй праймер выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 11;

- проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты; и

- выявление наличия целевого продукта амплификации;

где указанный целевой продукт амплификации содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарную последовательность;

и где трансгенный объект – кукуруза – содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

5. Способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы в образце, где способ включает:

- приведение образца, подлежащего выявлению, в контакт с зондом, где зонд содержит SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарную последовательность;

- гибридизацию образца, подлежащего выявлению, с зондом в жестких условиях гибридизации; и

- выявление гибридизации образца, подлежащего выявлению, с зондом,

и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

6. Способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы в образце - по п. 5, где по меньшей мере один зонд мечен по меньшей мере одним флуорофором.

7. Способ выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы в образце, где способ включает:

- приведение образца, подлежащего выявлению, в контакт с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты, где указанная маркерная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 или ее комплементарной последовательности, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарной последовательности и/или SEQ ID NO: 6-11 или их комплементарных последовательностей;

- гибридизацию образца, подлежащего выявлению, с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях гибридизации;

- выявление гибридизации образца, подлежащего выявлению, с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты и дополнительно проведение анализа скрещивания с помощью маркера для определения того, связана ли генетически устойчивость к насекомым и/или устойчивость к гербициду с маркерной молекулой нуклеиновой кислоты;

и где трансгенный объект – кукуруза – содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5»

8. Набор для выявления ДНК для выявления наличия ДНК трансгенного объекта - кукурузы в образце, где указанный набор содержит пару ДНК праймеров, специфичных в отношении трансгенного объекта - кукурузы - или его потомства, где указанные ДНК праймеры содержат SEQ ID NO: 1 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 2 или ее комплементарную последовательность, SEQ ID NO: 6 или ее комплементарную последовательность и/или SEQ ID NO: 7 или ее комплементарную последовательность и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

9. Способ защиты растения кукурузы от нашествия насекомых, где способ включает предоставление по меньшей мере одной трансгенной растительной клетки кукурузы в рацион целевого насекомого, где указанная трансгенная растительная клетка кукурузы последовательно содержит в своем геноме SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 или содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 5; причем поглощение указанной трансгенной растительной клетки кукурузы ингибирует дальнейшее питание целевого насекомого указанным трансгенным растением кукурузы.

10. Способ защиты растения кукурузы от повреждения, вызываемого гербицидом, или борьбы с сорняками в поле возделывания растения кукурузы, где способ включает внесение эффективного количества гербицида глюфосинат в поле возделывания по меньшей мере одного трансгенного растения кукурузы, где указанное трансгенное растение кукурузы последовательно содержит в своем геноме SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 или содержит последовательность, как изложено в SEQ ID NO: 5.

11. Способ получения растения кукурузы, устойчивого к насекомым и устойчивого к гербициду глюфосинат, где способ включает:

- введение SEQ ID NO: 1, последовательности нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 в геноме первого растения кукурузы или последовательности нуклеиновой кислоты, как изложено в SEQ ID NO: 5, в геноме первого растения кукурузы во второе растение кукурузы, получая, таким образом, множество растений потомства; и

- отбор растений потомства, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области, которые также устойчивы к насекомым и устойчивы к гербициду глюфосинат.

12. Способ получения растения кукурузы, устойчивого к насекомым и устойчивого к гербициду глюфосинат по п. 11, где указанный способ включает:

- половое скрещивание трансгенного объекта - кукурузы - с растением кукурузы, которое не обладает признаком устойчивости к насекомым и устойчивости к гербициду глюфосинат, с получением, таким образом, множества растений потомства; и отбор растений потомства, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты специфичной области;

- поражение растений потомства целевым насекомым и/или обработку растений потомства гербицидом глюфосинат; и

- отбор растений потомства, которые обладают устойчивостью к насекомым и устойчивостью к гербициду глюфосинат;

и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

13. Сельскохозяйственный пищевой продукт для животного, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы, где сельскохозяйственный продукт содержит ДНК трансгенного объекта - кукурузы и представляет собой кукурузную крупу, кукурузную муку, кукурузное масло, кукурузные столбики с рыльцами, кукурузный крахмал, кукурузный глютен или кукурузную лепешку и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

14. Сельскохозяйственный продукт, представляющий собой косметическое средство, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы, где сельскохозяйственный продукт содержит ДНК трансгенного объекта - кукурузы и где трансгенный объект – кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

15. Сельскохозяйственный продукт, представляющий собой агент-наполнитель, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы, где сельскохозяйственный продукт содержит ДНК трансгенного объекта - кукурузы и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

16. Сельскохозяйственный пищевой товар для животного, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы, где сельскохозяйственный товар содержит ДНК трансгенного объекта - кукурузы и представляет собой кукурузную крупу, кукурузную муку, кукурузное масло, кукурузные столбики с рыльцами, кукурузный крахмал, кукурузный глютен или кукурузную лепешку и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

17. Сельскохозяйственный товар, представляющий собой косметическое средство, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы, где сельскохозяйственный товар содержит ДНК трансгенного объекта - кукурузы и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.

18. Сельскохозяйственный товар, представляющий собой агент-наполнитель, происходящий из трансгенного объекта - кукурузы, где сельскохозяйственный товар содержит ДНК трансгенного объекта - кукурузы и где трансгенный объект - кукуруза - содержит SEQ ID NO: 1, последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 553-7491 SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 2 последовательно; или SEQ ID NO: 5.