ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ КАЗЕИНКИНАЗЫ 1 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2025 года по МПК A61K31/506 A61K31/519 A61P9/10 A61P9/12 

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов казеинкиназы 1 для лечения сосудистых заболеваний, предпочтительно заболеваний периферических кровеносных сосудов и сердечно-сосудистых заболеваний. Настоящее изобретение также относится к соответствующим способам лечения.

Несмотря на значительные вложения средств в фундаментальные и клинические исследования сердечно-сосудистой системы, сердечно-сосудистые заболевания остаются самой тяжелой и сложной проблемой здравоохранения во всем мире: ежегодно от них умирает более 17500000 человек (что составляет 47 % всех случаев смерти, вызванных неинфекционными заболеваниями). К 2030 году глобальные затраты на лечение сердечно-сосудистых заболеваний вырастут до 1,04 триллиона долларов, тем самым превратив данное нарушение здоровья в серьезную угрозу для мировой экономики.

Гипертензия представляет собой фактор риска номер один для всех сердечно-сосудистых заболеваний: она увеличивает риск сердечного приступа, сердечной недостаточности (СН), инсульта и почечной недостаточности. Каждый третий человек страдает повышенным артериальным давлением. Однако, поскольку у гипертензии мало признаков или симптомов, большинство случаев остается не выявленным. Остается неясной причина развития гипертензии у людей, можно объяснить только 10 % случаев гипертензии. Понимание гипертензии является ключом к предотвращению и лечению сердечно-сосудистых заболеваний.

Микрососудистые исследования изучают структуру и функцию мельчайших кровеносных сосудов (прекапиллярных артериол и посткапиллярных венул) в здоровом состоянии и при заболеваниях. Резистивные артерии представляют собой "горячие точки" в сердечно-сосудистой системе, которые регулируют как среднее артериальное давление (САД), так и перфузию тканей, и отвечают за создание наибольшей части общего периферического сопротивления сосудов (TPR). Следовательно, изменения их структуры и функций (например, из-за болезней или старения) немедленно влияют на перфузию тканей и САД. Резистивные артерии представляют собой неиспользуемую возможность улучшить здоровье сердечно-сосудистой системы. Понимание структурных и молекулярных основ функции микрососудов в здоровом состоянии и при заболеваниях откроет ряд новых терапевтических стратегий.

Современные способы лечения, нацеленные на микрососуды, не соответствуют стандартам, поскольку они не улучшают функцию органов и с их помощью трудно подбирать эффективные дозы без значительных побочных эффектов. Например, повышенный миогенный тонус при СН повышает TPR и вызывает "дисбаланс постнагрузки", который приводит к пагубным долгосрочным воздействиям на топографию желудочков и сердечную функцию. Фактически, даже кратковременное увеличение постнагрузки вызывает значительное распространение инфаркта, поэтому оценивали несколько стратегий, снижающих постнагрузку сердца при СН, однако, с ограниченным успехом. Хотя снижение постнагрузки на сердце может принести пользу для сердца, сосудорасширяющие средства (например, оксид азота) несут риск устранения миогенной реактивности и опасного снижения TPR и артериального давления.

Миогенная реактивность и влияние на системную гемодинамику: в 1902 году сэр Уильям Бейлисс (William Bayliss) обнаружил, что повышение трансмурального давления заставляет резистивные артерии "искорёживаться, подобно червю" (т.е. сужаться)¹. Это наблюдение, позднее названное миогенным ответом^2-5, описывает такое динамическое регулирование диаметра кровеносных сосудов к изменению перфузионного давления. Как следует из этимологии его названия (мио = мышца, генный = образуемый), миогенный ответ создается слоем гладких мышц сосудистой стенки^6-8; анатомически миогенный ответ является свойством прекапиллярных мелких артерий и артериол (т.е. "резистивные артерии" малого диаметра функционально отличаются от проводящих артерий большого диаметра).

На системном уровне закон Ома указывает, что миогенная реактивность резистивных артерий будет иметь значительное влияние на TPR и САД^9,10. Это позиционирует резистивные артерии как "функциональные горячие точки" в нескольких патологических процессах, характеризующихся изменениями перфузии тканей и/или системной гемодинамики, включая кардиомиопатию¹¹, СН^12,13, диабет^14,15 и гипертензию¹⁶. In vivo, резистивные артерии скелетных мышц заметно модулируют TPR, поскольку данное сосудистое русло формирует самую большую сеть кровообращения в организме¹⁷.

Обратная сигнализация TNF как регулятор миогенной реактивности: ранее, в исследовании, посвященном изучению резистивных артерий скелетных мышц¹⁸, авторами изобретения было продемонстрировано, что фактор некроза опухоли (TNF), а точнее его мембраносвязанная версия (mTNF), является конститутивным механосенсором, управляющим миогенными реакциями в резистивных артериях скелетных мышц при непатологических условиях. Соответственно, полная делеция гена TNF в гладкомышечных клетках или блокирование TNF с помощью этанерцепта ослабляет миогенную реактивность резистивных артерий скелетных мышц и, следовательно, снижает системное кровяное давление. Примечательно, что ингибирующее действие этанерцепта на миогенную реактивность артерий скелетных мышц сохраняется у пяти различных видов, включая человека. Механистически, mTNF преобразует механическую нагрузку, налагаемую на сосудистые гладкомышечные клетки, в сигнал снаружи-внутрь (т.е. "обратный сигнал" через TNF), который соединяется с установленными внутриклеточными миогенными сигнальными элементами (например, ERK 1/2 и сфингозинкиназа 1). Такой неканонический механизм обратной сигнализации mTNF, по-видимому, уникален для резистивных артерий скелетных мышц¹⁸.

Казеинкиназа 1 представляет собой модулятор обратной сигнализации TNF: цитоплазматический домен TNF не обладает заметной ферментативной функцией и, следовательно, передает сигналы через связанные белки, включая казеинкиназу 1 (CK1). Примечательно, что эволюционное давление сохранило сайт фосфорилирования CK1 TNF у нескольких видов, предполагая, что он выполняет ключевую функцию¹⁹. В этом отношении фосфорилирование TNF действует как "переключатель активности" и обеспечивает гибкий механизм модуляции функций обратной сигнализации TNF.

CK1 представляет собой семейство из 7 универсально экспрессируемых мономерных серин/треониновых протеинкиназ²⁰.

Хотя все изоформы CK1 обладают высококонсервативным доменом киназы, они значительно различаются по своим некаталитическим N- и C-концевым доменам^21,22: эти домены играют решающую роль в регуляции активности киназы, локализации киназы и субстратной специфичности in vivo^21-23. Поскольку изоформы семейства CK1 проявляют сходную субстратную специфичность in vitro²⁴, их различные биологические функции in vivo (например, сегрегация хромосом, формирование веретена, циркадные ритмы, ядерный импорт, сигнализация Wnt пути и выживание/апоптоз клеток) почти полностью возникают из-за различий в локализации, стыковочных последовательностях и партнерах по взаимодействию²².

Все изоформы CK1 являются конститутивно активными и поэтому классифицируются как "киназы, не зависящие от вторичного мессенджера". Установлено, что CK1 фосфорилирует "примированную" (предварительно фосфорилированную) консенсусную последовательность S(P)-X-X-S, где "S(P)" представляет собой "примированный" фосфосерин, "X" представляет собой любую аминокислоту, и "S" представляет собой целевой серин, который фосфорилирует CK1²⁰. Поскольку эффективное распознавание субстрата требует фосфорилированного серинового остатка, CK1 часто фосфорилирует субстраты вместе с другими киназами²⁰, что согласуется с механизмом иерархического фосфорилирования²⁵.

Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в обеспечении нового режима для улучшения миогенной реактивности в периферической системе кровеносных сосудов.

Согласно настоящему изобретению термин "улучшение миогенной реактивности в периферической системе кровеносных сосудов", означает улучшение миогенной реактивности, особенно при заболевании или состоянии соответственно, при котором миогенная реактивность нарушена, в частности в контексте специфического заболевания и состояния соответственно, как более подробно описано ниже. У здорового субъекта, по сравнению с миогенной реактивностью в периферической системе кровеносных сосудов субъектов, демонстрирующих нарушенную миогенную реактивность в периферической системе кровеносных сосудов, указанная миогенная реактивность нормализуется или, по меньшей мере, изменяется в направлении нормализованного значения.

Решение указанной выше технической проблемы обеспечено вариантами осуществления настоящего изобретения, раскрытыми в формуле изобретения, настоящем описании и сопроводительных графических материалах.

Авторами изобретения обнаружены превосходные средства для снижения TPR путем избирательного воздействия на механизмы, которые модулируют отдельные части миогенной реактивности. Специфическая модуляция сосудистого русла миогенной реакции улучшает кровоток и функцию органов при полном сохранении нормальных физиологических регуляторных механизмов.

Согласно настоящему изобретению соединения, которые изменяют активность экспрессии СK1 гладкомышечных сосудов, влияют на обратную сигнализацию mTNF и миогенную реактивность и, как следствие, на общее периферическое сопротивление сосудов, кровоток в тканях и системное кровяное давление. Поскольку измененная миогенная реактивность является признаком многих заболеваний (например, сердечной недостаточности, субарахноидального кровоизлияния, диабета, инсульта, сепсиса), нацеливание на активность/экспрессию микрососудистого СK1 может улучшить микрососудистую миогенную реактивность и системную гемодинамику при различных заболеваниях.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению ингибиторов казеинкиназы 1 (СK1), то есть один или более ингибиторов СK1 можно применять для предотвращения и/или лечения сосудистых и/или сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), таких как ишемическая болезнь сердца (ИБС) (стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушения сердечного ритма, врожденный порок сердца, пороки клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровоизлияние и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровотечение и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению ингибитор CK1 представляет собой соединение, которое снижает экспрессию и/или активность CK1.

Предпочтительные ингибиторы CK1 для применения в настоящем изобретении представляют собой ингибиторы, селективные в отношении изоформ δCK1 (CK1δ, в других случаях также упоминаемые как "CK1D") и/или ε (CK1ε, в других случаях также упоминаемые как "CK1E"). В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, когда ингибитор CK1 оказывает более сильное ингибирующее действие на CK1δ, чем на CK1ε. Особенно подходящие ингибиторы CK1 для применения в настоящем изобретении представляют собой ингибиторы CK1, описанные в WO 2014/023271, более предпочтительно ингибиторы CK1 D4476, PF670462, IC261 и PF4800567. Наиболее предпочтительные ингибиторы CK1 для применения в настоящем изобретении представляют собой PF-670462 и PF-4800567, которые также можно применять в комбинации. Другими полезными ингибиторами CK1 в контексте настоящего изобретения являются селективные ингибиторы CK1δ, описанные в публикации Salado et al. (2014 J. Med. Chem. 2014, 57, 2755-2772, особенно те, которые представлены на фиг. 1, таблице 1 и фиг. 2, причем соединение M3-15 является наиболее предпочтительным. Следует понимать, что настоящее изобретение также относится к применению фармацевтически приемлемых солей, сольватов, сложных эфиров, солей таких сложных эфиров, а также любого другого аддукта или производного, которые при введении пациенту, нуждающемуся в этом, способны прямо или косвенно обеспечивать ингибитор Ck1 для применения по настоящему изобретению или его метаболит или остаток.

Согласно настоящему изобретению ингибиторы CK1 подавляют экспрессию/активность CK1 и снижают обратную сигнализацию mTNF в сосудистых гладкомышечных клетках периферических резистивных артерий, в частности у пациентов, страдающих такими заболеваниями, как сосудистые и ССЗ, такие как ИБС (стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушение сердечного ритма, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровотечение и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровотечение и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению ингибиторы CK1 снижают фосфорилирование Erk1/2 гладких мышц и сигнализацию сфингозин-1-фосфата при таких заболеваниях, как сердечная недостаточность, в частности, у пациентов, страдающих такими заболеваниями, как сосудистые и ССЗ, такие как ИБС (стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушение сердечного ритма, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровотечение и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровотечение и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению ингибиторы CK1 подавляют экспрессию/активность CK1 и снижают периферическую миогенную реактивность, в частности, у пациентов, страдающих такими заболеваниями, как сосудистые и ССЗ, такими как ИБС (стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушение сердечного ритма, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровотечение и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровоизлияние и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению ингибиторы CK1 снижают общее периферическое сопротивление сосудов, в частности, у пациентов, страдающих такими заболеваниями, как сосудистые и ССЗ, такие как ИБС (стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушения сердечного ритма, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровотечение и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровотечение и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению ингибиторы CK1 снижают системное артериальное давление, в частности, у пациентов, страдающих такими заболеваниями, как сосудистые и ССЗ, такие как ИБС (стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушения сердечного ритма, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровотечение и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровотечение и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению ингибиторы CK1 увеличивают кровоток в скелетных мышцах, брыжеечных, почечных и коронарных сосудах, в частности у пациентов, страдающих такими заболеваниями, как сосудистые и ССЗ, такие как ИБС)(стенокардия и инфаркт миокарда, общеизвестные как сердечный приступ), инсульт, сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь сердца, ревматическая болезнь сердца, кардиомиопатия, нарушения сердечного ритма, врожденный порок сердца, порок клапана сердца, кардит, аневризмы аорты, заболевание периферических артерий, тромбоэмболическое заболевание, венозный тромбоз, субарахноидальное кровоизлияние и гипертензия, при этом особенно предпочтительны сердечная недостаточность, субарахноидальное кровотечение и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению действие ингибиторов CK1 ограничено миогенным тонусом; сужение сосудов, вызванное катехоламинами, не влияет на такие заболевания, как сердечная недостаточность, субарахноидальное кровоизлияние и гипертензия.

Согласно настоящему изобретению действие ингибиторов CK1 ограничено периферическим и коронарным кровообращением; цереброваскулярная гемодинамика не нарушается при таких заболеваниях, как описанные выше, в частности при сердечной недостаточности, субарахноидальном кровоизлиянии и гипертензии.

Настоящее изобретение также относится к ингибитору CK1, предпочтительно ингибитору CK1, выбранному из тех, которые более подробно описаны выше, для применения для предотвращения и/или лечения сосудистых и/или сердечно-сосудистых заболеваний, как описано выше.

Настоящее изобретение, также относится к способу предотвращения и/или лечения сосудистого заболевания и/или сердечно-сосудистого заболевания, как описано выше, включающему введение эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора CK1, предпочтительно по меньшей мере одного ингибитора CK1, выбранного из тех, что указаны более подробно выше, пациенту, предпочтительно представляющему собой млекопитающее, в частности человеку, нуждающемуся в этом.

В настоящем изобретении показано, что действие селективного ингибирования CK1δ/ε стабилизируется, и, таким образом, сделан вывод о том, что максимальное ингибирование CK1 способно только частично уменьшать миогенное сужение сосудов. В ответ на этот вывод, авторами изобретения был проведен дополнительный эксперимент для подтверждения эффективности ингибирования CK1 при сердечной недостаточности (СН) в качестве примера состояния, поддающегося лечению согласно настоящему изобретению с применением ингибиторов CK1.

Согласно настоящему изобретению можно применять один или более ингибитор(ов) CK1 в его/их свободной форме. В других вариантах осуществления ингибитор(ы) CK1 (т.е. по меньшей мере один ингибитор CK1), применяемый в настоящем изобретении, присутствует в фармацевтической композиции, содержащей указанный по меньшей мере один ингибитор CK1, как правило, в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем, наполнителем и/или носителем.

Эффективное количество ингибитора СК1, необходимое для применения в способе и применениях по настоящему изобретению, т.е. конкретный уровень эффективной дозы для любого конкретного пациента или организма, будет зависеть от множества факторов, включая заболевание, подлежащее лечению, и тяжесть заболевания; активность конкретного применяемого соединения; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; время введения, способ введения и скорость выведения конкретного применяемого соединения; продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретным применяемым соединением, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Предпочтительные дозы в контексте настоящего изобретения, в частности предпочтительных соединений, упомянутых в данном документе, более конкретно PF-4800567 и PF-670462, составляют от приблизительно 1 до приблизительно 300 мг на кг массы тела (далее обозначение "мг/кг"), предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 100 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 70 мг/кг, особенно предпочтительно от приблизительно 25 до приблизительно 45 мг/кг, например 30 мг/кг. Дозу можно вводить один или более раз, например, два или три раза в день. Предпочтительно дозы вводят один или два раза в день. Предпочтительное введение одного или боле ингибиторов CK1 осуществляют один раз в день.

Известно, что многие ССЗ регулярно происходят в состоянии покоя, то есть ночью, когда пациенты выражают беспокойство. Таким образом, по меньшей мере один ингибитор CK1 предпочтительно вводят в соответствии с режимом, который обеспечивает максимальное фармакологическое действие по меньшей мере одного CK1 во время состояния покоя субъекта, подвергаемого лечению, более предпочтительно в или приблизительно в середине фазы покоя, при этом "приблизительно в середине фазы покоя" предпочтительно составляет в промежутке от приблизительно -2 до приблизительно +2 часов от середины фазы покоя, более предпочтительно в промежутке от приблизительно -1 до приблизительно +1 часа от середины фазы покоя, даже более предпочтительно в промежутке от приблизительно -0,5 до приблизительно +0,5 часа от середины фазы покоя. Для специалиста в данной области техники очевидно, что режим, обеспечивающий максимальный фармакологический эффект по меньшей мере одного ингибитора CK1, зависит от выбранного ингибитора CK1. Например, ингибитор CK1, демонстрирующий сравнительно быстрое разложение активного соединения, можно вводить один раз в день в подходящее время перед фазой покоя (т.е. перед отходом ко сну пациентов), например, за 3, 4, 5 или 6 часов до фазы покоя пациента. В альтернативных вариантах осуществления, где выбранный ингибитор CK1 представляет собой соединение, демонстрирующее медленное разложение, ингибитор CK1 можно вводить с помощью композиции с контролируемым высвобождением, обеспечивающей максимальный эффект, обычно максимальную биодоступную концентрацию у пациента, получающего лечение, во время фазы покоя, предпочтительно в или приблизительно в середине фазы покоя (предпочтительно в соответствии с определением, данным выше). Специалисту в данной области техники известны соответствующие фармацевтические композиции и/или режимы дозирования и введения, например, конкретные ингибиторы СК1, более подробно описанные в данном документе, для обеспечения вышеописанного максимального эффекта во время фазы покоя.

Путь введения ингибитора CK1 не имеет решающего значения, и выбранный путь зависит от индивидуального применяемого соединения или соединений ингибитора CK1 и субъекта, подлежащего лечению. Предпочтительно ингибитор(ы) CK1 вводят системно, например, перорально или внутривенно, особенно предпочтительно перорально.

Термины "пациент" и "субъект" применяются в настоящем документе взаимозаменяемо и каждый означает животное, предпочтительно млекопитающее и наиболее предпочтительно человека.

По меньшей мере один ингибитор СК1, предпочтительно в составе фармацевтической композиции, описанной выше, для применения по настоящему изобретению можно вводить с применением любого количества и любого пути введения, эффективных для лечения цереброваскулярного состояния. В соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что термин "обработка" или "лечение" означает, что тяжесть состояния по меньшей мере не прогрессирует по сравнению с состоянием, для которого лечение не проводили, предпочтительно тяжесть состояния не прогрессирует, более предпочтительно тяжесть состояния уменьшается, еще более предпочтительно существенно уменьшается, и, особенно предпочтительно состояние в значительной степени излечивается. Предпочтительно, тяжесть состояния в соответствии с настоящим изобретением снижается по меньшей мере на 30 %, более предпочтительно по меньшей мере на 50 %, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70 %, особенно предпочтительно по меньшей мере на 90 %, до полного излечения состояния, что представляет собой наиболее предпочтительным результат лечения в соответствии с настоящим изобретением.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: (A) Перед лечением миогенный тонус в артериях кремастера, выделенных от мышей с СН (n = 6), увеличивается по сравнению с артериями, выделенными от ложнооперированных контрольных животных (n = 8). (B) После обработки 550 нМ PF670462 in vitro (30 минут) миогенный тонус в обеих группах снижается до одинакового уровня. Таким образом, увеличение миогенного тонуса, опосредованное СН, устраняется (т.е. кривые после лечения накладываются друг на друга), и новый уровень тонуса лишь незначительно снижается по сравнению с ложнооперированным контролем.

Фиг. 2: показывает, что цитозольная часть mTNF регулирует обратную сигнализацию.

Фиг. 3: показывает, что казеинкиназа 1 регулирует опосредованную mTNF миогенную реактивность.

Фиг. 4: показывает, что казеинкиназа 1 дельта регулирует миогенную реактивность.

Фиг. 5: показывает, что CK1D регулирует циркадные осцилляции миогенной реактивности.

Фиг. 6: показывает, что ингибирование CK1D улучшает микрососудистую дисфункцию и работу сердца при СН.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Ингибирование CK1 снижает миогенную реактивность in vitro и in vivo

Обращаясь к фиг. 1, микрососудистые гладкомышечные клетки культивировали из брыжеечных артерий мыши, и фосфорилирование ERK1/2 оценивали с помощью стандартного вестерн-блоттинга. Резистивные артерии скелетных мышц кремастера мышей оценивали с помощью миографии с применением давления. Обратная сигнализация mTNF индуцировалась внутренне активной конструкцией рецептора TNF типа I, sTNFR1-Fc.

В микрососудистых гладкомышечных клетках sTNFR1-Fc увеличивает фосфорилирование ERK1/2. sTNFR1-Fc-индуцированное фосфорилирование ERK1/2 отменяется как ингибитором пан-CK1 CKI-7, так и специфическим ингибитором CKIδ PF-670462. Эти результаты были подтверждены на резистивных артериях скелетных мышц кремастера. Применение CKI-7 in vitro отменяет индуцированную sTNFR1-Fc обратную сигнализацию mTNF и снижает миогенную реактивность. Ингибирование CK1 не влияло на миогенную реактивность в артериях TNF^-/-. In vitro PF-670462 также снижает миогенную реактивность, а при применении in vivo PF-67062 снижает миогенную реактивность в выделенных артериях кремастера. Важно отметить, что ни один из вышеперечисленных способов лечения не влиял на вызванное агонистами сужение сосудов.

Пример 2: Цитозольная часть mTNF регулирует обратную сигнализацию.

Обращаясь к фиг. 2, клетки эмбриональной почки человека (HEK) временно трансфицировали в течение 24 часов и стимулировали антителом к TNF адалимумабом (Humira^™) в течение 5 минут. На обратную сигнализацию mTNF указывает фосфорилирование ERK1/2, оцениваемое с помощью вестерн-блоттинга. Обратная сигнализация mTNF не стимулируется, если клетки HEK не экспрессируют плазмидную конструкцию фактора некроза опухоли (TNF) (NT = нетрансфицированный); усечение внутриклеточного домена TNF (аминокислоты со 2 по 25) отменяет обратную сигнализацию (Trunc TNF). Важно отметить, что цитоплазматический хвост mTNF содержит сайт узнавания казеинкиназы 1 (CK1) (S(P)-X-X-S), который удаляется в Trunc TNF, что указывает на необходимость связывания CK1 в обратной сигнализации mTNF.

* на фиг. 2 обозначает P < 0,05 при помощи непарного t-критерия Стьюдента, n = от 6 до 12 биологических повторов.

Пример 3: казеинкиназа 1 регулирует опосредованную mTNF миогенную реактивность.

Обращаясь к фиг. 3, резистивные артерии скелетных мышц кремастера мыши выделяли и канюлировали для миографии с применением давления. Поэтапное повышение трансмурального давления (от 20 до 100 мм рт. ст. с шагом 20 мм рт. ст.) вызывает миогенное сужение сосудов. (Фиг. 3a) Ингибитор пан-казеинкиназы 1 (CK1) CKI-7 (10 мкМ in vitro) снижает миогенную реактивность. (Фиг. 3b) CKI-7 не ставит под угрозу здоровье сосудов, поскольку сужение сосудов, вызванное фенилэфрином, остается неизменным. (Фиг. 3c) CKI-7 вызывает дозозависимое снижение миогенной реактивности (n = от 4 до 6 сосудов). (Фиг. 3d) CKI-7 не эффективен в отсутствие сигнализации TNF (т.е. артерии, нокаутные по TNF, TNF KO). (Фиг. 3e) CKI-7 не влияет на индуцированное фенилэфрином сужение сосудов в артериях TNF KO. (Фиг. 3f) Кратковременное введение mTNF-стимулирующего слитого белка sTNFR1-Fc (100 нг/мл) стимулирует сужение сосудов, которое предотвращается с помощью CKI-7, указывая на то, что обратный сигнальный путь mTNF требует функционального CK1. (Фиг. 3g) Все сосуды были здоровыми до эксперимента, на что указывает сильная вазоконстрикция к фенилэфрину (ФЭ). (h) Выделенные резистивные артерии кремастера подвергали миографии с применением давления и последующему вестерн-блоттингу для фосфорилирования ERK1/2, молекулярного считывания обратной сигнализации mTNF. sTNFR1-Fc стимулирует повышенное фосфорилирование ERK1/2, которое ингибируется CKI-7. (i) Иллюстративное изображение вестерн-блоттинга. (j) Гладкомышечные клетки брыжеечных сосудов демонстрируют устойчивое фосфорилирование ERK1/2 в ответ на sTNFR1-Fc, которое ингибируется CKI-7 (1 мкМ).

(Фиг. 3a, b, d, e) * на фиг. 3a, b, c, d и e обозначает P < 0,05 при помощи непарного t-критерия Стьюдента. (Фиг. 3c, f-g) * на фиг. 3c, f и g обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и по сравнению с реакциями контроля без обработки при помощи апостериорного критерия Даннета. * обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и по сравнению с контролем (Контр), и + обозначает P < 0,05 по сравнению с одним TNFR1-Fc (0 моль/л CKI-7) при помощи апостериорного критерия Бонферрони. Количество биологических повторов указано на фиг. 3 в скобках.

Пример 4: Казеинкиназа 1 дельта регулирует миогенную реактивность

Обращаясь к фиг. 4, резистивные артерии скелетных мышц кремастера мыши выделяли и канюлировали для миографии с применением давления. Поэтапное повышение трансмурального давления (от 20 до 100 мм рт. ст. с шагом 20 мм рт. ст.) вызывает миогенное сужение сосудов. (Фиг. 4a) Селективный ингибитор CK1E PF-4800567 устраняет миогенную реактивность (30 мкМ in vitro). (Фиг. 4b) PF-4800567 вызывает дозозависимое снижение миогенной реактивности (n = от 4 до 5 на каждую дозу), хотя и при концентрациях, значительно превышающих IC₅₀ (32 нМ), что позволяет предположить, что такое снижение тонуса может быть связано с ненаправленным действием ингибитора. (Фиг. 4c) Вызванное фенилэфрином сужение сосудов снижается в артериях, обработанных PF-4800567. (Фиг. 4d) Уменьшение вызванного фенилэфрином сужения сосудов сохраняется после корректировки до базового тонуса, что указывает на неспецифический ингибирующий эффект PF-4800567 в дозе 30 мкМ. Вместе эти данные указывают на то, что CK1E вряд ли опосредует миогенную реактивность, поскольку ингибирование реакций происходит только при концентрациях PF-4800567 приблизительно в 1000 раз выше, чем IC₅₀, а PF-4800567 ингибирует общую сократимость сосудов (на что указывают притупленные реакции на фенилэфрин). (Фиг. 4e) Ингибитор CK1D/E PF-670462 снижает миогенную реактивность (550 нМ in vitro), данный эффект обратим путем многократных замен инкубационного буфера в сосуде. (Фиг. 4f) PF-670462 вызывает дозозависимое снижение миогенной реактивности при концентрациях, приближающихся к опубликованным IC₅₀ (от 7,7 до 14 нМ), что позволяет предположить, что снижение тонуса, вероятно, специфично для CK1D или CK1E (n = от 4 до 5 на каждую дозу). Поскольку селективный ингибитор CK1E PF-4800567 был эффективен только далеко за пределами диапазона специфичности для CK1E, авторами изобретения сделано предположение, что более мощный ингибирующий эффект PF-670462 обусловлен нацеливанием на CK1D. (Фиг. 4g) CK1D передает сигналы через TNF, поскольку PF-670462 ингибирует миогенную реактивность в артериях дикого типа (WT), но не в артериях мышей с нокаутом TNF (TNF^-/-). (Фиг. 4h) PF-670462 не влияет на здоровье сосудов, поскольку сужение сосудов, вызванное фенилэфрином, не нарушено.

(Фиг. 4a, c, d) * на фиг. 4a, c и d обозначает P < 0,05 при помощи непарного t-критерия Стьюдента. (Фиг. 4b, f) * на фиг. 4b и f обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и по сравнению с 0 дозой при помощи апостериорного критерия Даннета. (Фиг. 4e) * на фиг. 4e обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и по сравнению с PF-670462 при помощи апостериорного критерия Даннета. (Фиг. 4g, h) * на Фиг. 4g и h обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и по сравнению с реакцией WT на PF-670462 при помощи апостериорного критерия Даннета. Количество биологических повторов указано в скобках на фиг. 4.

Пример 5: CK1D регулирует циркадные осцилляции миогенной реактивности.

Обращаясь к фиг. 5, резистивные артерии скелетных мышц кремастера мышей выделяли в середине фазы покоя (ZT7) или в середине активной фазы (ZT19) и канюлировали для миографии с применением давления. Одноступенчатое повышение трансмурального давления (от 60 до 100 мм рт. ст.) вызывает миогенное сужение сосудов. (Фиг. 5a) PF-670462 (10 мкМ, in vitro) снижает миогенную реактивность только во время фазы покоя (ZT7), а не во время активной фазы (ZT19). (Фиг. 5b) Обработка PF-670462 не влияет на расширение сосудов, что указывает на то, что базовый тонус сосуда постоянен до стимуляции давлением. (Фиг. 5c) Резистивные артерии мышц кремастера подвергали миографии с применением давления, а затем вестерн-блоттингом оценивали фосфорилирование ERK1/2. PF-670462 снижает фосфорилирование ERK1/2 в большей степени во время фазы покоя (ZT7). (Фиг. 5d) Иллюстративное изображение вестерн-блоттинга. (Фиг. 5e) PF-670462 не влияет на диаметр сосудов в покое. (Фиг. 5f) Перед введением PF-670462 состояние сосудов не нарушено, о чем свидетельствует сильное сужение сосудов, вызванное фенилэфрином. (Фиг. 5g) PF-670462 дозозависимо снижает миогенный тонус в середине фазы покоя (ZT7), чтобы достичь максимального снижения, достигнутого в середине активной фазы (ZT19) (n = от 4 до 7 сосудов на дозу). (Фиг. 5h) Введение PF-670462 не влияет на здоровье сосудов, на что указывает сильное сужение сосудов, вызванное фенилэфрином.

(Фиг. 5a-d) * на фиг. 5a, b, c и d обозначает P < 0,05 при помощи непарного t-критерия Стьюдента в течение того же периода времени (ZT7 или ZT19, соответственно). (Фиг. 5e, f) * на фиг. 5e и f обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа. (Фиг. 5g) * на фиг. 5g обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и по сравнению с отсутствием обработки лекарственным средством (0 мкмоль/л) в течение того же периода времени (ZT7 или ZT19, соответственно) при помощи апостериорного критерия Даннета. (Фиг. 5h) * на фиг. 5h обозначает P < 0,05 при помощи непарного t-критерия Стьюдента. Количество биологических повторов указано в скобках на фиг. 5.

Пример 6: Ингибирование CK1D улучшает дисфункцию микрососудов и работу сердца при СН

Обращаясь к фиг. 6a-c, мыши перенесли инфаркт миокарда (перевязку левой передней нисходящей коронарной артерии) или ложную операцию. Через 8 недель после инфаркта миокарда у мышей развивалась сердечная недостаточность (СН). Резистивные артерии скелетных мышц кремастера выделяли и канюлировали для миографии с применением давления. Поэтапное повышение трансмурального давления (от 20 до 100 мм рт. ст. с шагом 20 мм рт. ст.) вызывало миогенное сужение сосудов, которое было значительно сильнее в группе СН, чем в группе ложнооперированных животных. (Фиг. 6a) Обработка PF-670462 (550 нМ in vitro) нормализует миогенную реактивность в артериях мышей с СН (т.е. уровень миогенной реактивности аналогичен значениям ложнооперированных животных). (Фиг. 6b) PF-670462 не влияет на миогенный тонус у ложнооперированных мышей. (Фиг. 6c) Сосуды демонстрируют надежную функцию, поскольку вызванное фенилэфрином сужение сосудов не нарушено.

Обращаясь к фиг. 6d-f, наивных мышей обрабатывали PF-670462 (от 30 до 50 мг/кг, растворенные в 200 мкл воды, внутрибрюшинная инъекция) или носителем (200 мкл воды). Через 24 часа, в середине фазы покоя (ZT7), резистивные артерии скелетных мышц кремастера подвергали миографии с применением давления. (Фиг. 6d) PF-670462 в количестве и 30 мг/кг, и 50 мг/кг снижает миогенную реактивность, что позволяет предположить, что лекарственный препарат действует in vivo. (Фиг. 6e) Вызванное фенилэфрином сужение сосудов не изменяется при применении PF-670462 in vivo. (Фиг. 6f) В соответствии со снижением миогенного тонуса, кратковременная инъекция PF-670462 (30 мг/кг внутрибрюшинно) снижает среднее артериальное кровяное давление (САД) (n = 3 на группу).

Обращаясь к фиг. 6g-j, после инфаркта миокарда или ложной операции мышей длительно обрабатывали PF-670462 (30 мг/кг, внутрибрюшинная инъекция) или носителем (ДМСО) в течение 7 недель (5 дней в неделю). Резистивные артерии скелетных мышц кремастера выделяли для миографии с применением давления. (Фиг. 6g) Экспрессия мРНК CK1D и CK1E в резистивных артериях кремастера не различается в группе с СН и группе ложнооперированных животных (n = 18 образцов на группу), это позволяет предположить, что различия в миогенном тонусе обусловлены посттрансляционными механизмами. (Фиг. 6h) Повышение миогенного тонуса, индуцированное СН, нормализуется при длительной обработке PF-670462. (Фиг. 6i) Вызванное фенилэфрином сужение сосудов не нарушается при длительной обработке PF-670462. Снижение тонуса при более низких концентрациях фенилэфрина в группе, получавшей PF-670462, является результатом изменений миогенного тонуса в состоянии покоя. (Фиг. 6j) Сердечный выброс, количественная оценка оттока крови из сердца, оцениваемая с помощью эхокардиографии, увеличивается при длительной обработке PF-670462.

(Фиг. 6a, b и g-j) * на фиг. 6a, b и g-j обозначает P < 0,05 при помощи непарного t-критерия Стьюдента. (Фиг. 6c-e) * на фиг. 6c-e обозначает P < 0,05 при помощи однофакторного дисперсионного анализа и сравнения с контролем при помощи апостериорного критерия Даннета. Количество биологических повторов указано в скобках на фиг. 6.

Настоящее изобретение показывает, что CK1 действует как регулятор обратной сигнализации mTNF и, следовательно, миогенной реактивности. Продемонстрированная способность ингибиторов CK1 снижать миогенную реактивность, не влияя на вызванное агонистами сужение сосудов, обеспечивает значительный запас безопасности для клинического применения при заболеваниях, при которых повышен тонус микрососудов.

Ссылки на источники:

1. Bayliss. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. J Physiol. 1902;28:220-231.

2. Hill et al. Invited review: arteriolar smooth muscle mechanotransduction: Ca(2+) signaling pathways underlying myogenic reactivity. J Appl Physiol (1985). 2001;91:973-983.

3. Schubert et al. The emerging role of Ca2+ sensitivity regulation in promoting myogenic vasoconstriction. Cardiovasc Res. 2008;77:8-18.

4. Cole et al. Role of myosin light chain kinase and myosin light chain phosphatase in the resistance arterial myogenic response to intravascular pressure. Arch Biochem Biophys. 2011;510:160-173.

5. Lidington et al. Capitalizing on diversity: an integrative approach towards the multiplicity of cellular mechanisms underlying myogenic responsiveness. Cardiovasc Res. 2013;97:404-412.

6. Kuo et al. Coronary arteriolar myogenic response is independent of endothelium. Circ Res. 1990;66:860-866.

7. Falcone et al. Endothelial independence of myogenic response in isolated skeletal muscle arterioles. Am J Physiol. 1991;260:H130-H135.

8. Meininger et al. Cellular mechanisms involved in the vascular myogenic response. Am J Physiol. 1992;263:H647-H659.

9. Metting et al. Systemic vascular autoregulation amplifies pressor responses to vasoconstrictor agents. Am J Physiol. 1989;256:R98-105.

10. Metting et al. Quantitative contribution of systemic vascular autoregulation in acute hypertension in conscious dogs. J Clin Invest. 1989;84:1900-1905.

11. Petersen et al. Coronary artery myogenic response in a genetic model of hypertrophic cardiomyopathy. Am J Physiol Head Circ Physiol. 2002;283:H2244-H2249.

12. Hoefer et al. Sphingosine-1-phosphate-dependent activation of p38 MAPK maintains elevated peripheral resistance in heart failure through increased myogenic vasoconstriction. Circ Res. 2010;107:923-933.

13. Gschwend et al. Myogenic constriction is increased in mesenteric resistance arteries from rats with chronic heart failure: instantaneous counteraction by acute AT1 receptor blockade. Br J Pharmacol. 2003;139:1317.

14. Sauvé et al. Tumor Necrosis Factor/Sphingosine-1-Phosphate Signaling Augments Resistance Artery Myogenic Tone in Diabetes. Diabetes. 2016;65:1916-1928.

15. Ungvari et al. Increased myogenic tone in skeletal muscle arterioles of diabetic rats. Possible role of increased activity of smooth muscle Ca2+ channels and protein kinase C. Cardiovasc Res. 1999;43:1018-1028.

16. Matrougui et al. High sodium intake decreases pressure-induced (myogenic) tone and flow-induced dilation in resistance arteries from hypertensive rats. Hypedension. 1998;32:176-179.

17. Rowell. Human cardiovascular adjustments to exercise and thermal stress. Physiol Rev. 1974;54:75-159.

18. Kroetsch et al. Constitutive smooth muscle tumour necrosis factor regulates microvascular myogenic responsiveness and systemic blood pressure. Nat Commun. 2017;8:14805.

19. Watts et al. A casein kinase I motif present in the cytoplasmic domain of members of the tumour necrosis factor ligand family is implicated in reverse signaling. EMBO J. 1999;18:2119-2126.

20. Venerando et al. Casein kinase: the triple meaning of a misnomer. Biochem J. 2014;460:141-156.

21. Gross et al. Casein kinase I: spatial organization and positioning of a multifunctional protein kinase family. Cell Signal. 1998;10:699-711.

22. Knippschild et al. The casein kinase 1 family: participation in multiple cellular processes in eukaryotes. Cell Signal. 2005;17:675-689.

23. Cheong et al. Casein kinase 1: Complexity in the family. Int J Biochem Cell Biol. 2011;43:465-469.

24. Pulgar et al. Optimal sequences for non-phosphate-directed phosphorylation by protein kinase CK1 (casein kinase-1)--a re-evaluation. Eur J Biochem. 1999;260:520-526.

25. Roach. Multisite and hierarchal protein phosphorylation. J Biol Chem. 1991;266:14139-14142.

Изобретение относится к применению ингибитора казеинкиназы 1 (CK1), представляющего собой PF-670462, для предотвращения и/или лечения сосудистого и/или сердечно-сосудистого заболевания, при котором миогенная реактивность в периферической системе кровеносных сосудов нарушена. Использование изобретения позволят эффективно лечить и предотвращать сосудистые и сердечно-сосудистые заболевания, при которых миогенная реактивность в периферической системе кровеносных сосудов нарушена. 13 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

1. Применение ингибитора казеинкиназы 1 (CK1), представляющего собой PF-670462, для предотвращения и/или лечения сосудистого и/или сердечно-сосудистого заболевания, при котором миогенная реактивность в периферической системе кровеносных сосудов нарушена.

2. Применение ингибитора CK1 по п. 1, где сосудистое заболевание или сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, инсульта, сердечной недостаточности, гипертонической болезни сердца, ревматической болезни сердца, кардиомиопатии, нарушений сердечного ритма, врожденного порока сердца, порока клапана сердца, кардита, аневризмы аорты, заболевания периферических артерий, тромбоэмболического заболевания, венозного тромбоза, субарахноидального кровоизлияния и гипертензии.

3. Применение ингибитора CK1 по п. 2, где сосудистое заболевание или сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из сердечной недостаточности, субарахноидального кровоизлияния и гипертензии.

4. Применение ингибитора CK1 по любому из пп. 1-3, где ингибитор CK1 вводят пациенту один, два или три раза в день.

5. Применение ингибитора CK1 по п. 4, где ингибитор CK1 вводят пациенту в соответствии с режимом, обеспечивающим максимальное фармакологическое действие ингибитора CK1 во время состояния покоя пациента.

6. Применение ингибитора CK1 по п. 5, где ингибитор CK1 вводят пациенту в соответствии с режимом, обеспечивающим максимальное фармакологическое действие ингибитора CK1 в середине фазы покоя или в промежутке от - 2 до +2 часов от середины фазы покоя, предпочтительно в промежутке от -1 до +1 часа от середины фазы покоя.

7. Способ предотвращения и/или лечения сосудистого и/или сердечно-сосудистого заболевания, при котором миогенная реактивность в периферической системе кровеносных сосудов нарушена, включающий стадию введения эффективного количества ингибитора CK1, представляющего собой PF-670462, пациенту, нуждающемуся в этом.

8. Способ по п. 7, где сосудистое заболевание или сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, инсульта, сердечной недостаточности, гипертонической болезни сердца, ревматической болезни сердца, кардиомиопатии, нарушений сердечного ритма, врожденного порока сердца, порока клапана сердца, кардита, аневризмы аорты, заболевания периферических артерий, тромбоэмболического заболевания, венозного тромбоза, субарахноидального кровоизлияния и гипертензии.

9. Способ по п. 8, где сосудистое заболевание или сердечно-сосудистое заболевание выбрано из группы, состоящей из сердечной недостаточности, субарахноидального кровоизлияния и гипертензии.

10. Способ по любому из пп. 7-9, где ингибитор CK1 вводят пациенту один, два или три раза в день.

11. Способ по п. 10, где ингибитор CK1 вводят пациенту в соответствии с режимом, обеспечивающим максимальное фармакологическое действие ингибитора CK1 во время состояния покоя пациента.

12. Способ по п. 11, где ингибитор CK1 вводят пациенту в соответствии с режимом, обеспечивающим максимальное фармакологическое действие ингибитора CK1 в середине фазы покоя или в промежутке от -2 до приблизительно +2 часов от середины фазы покоя.

13. Способ по п. 12, где ингибитор CK1 вводят пациенту в соответствии с режимом, обеспечивающим максимальное фармакологическое действие ингибитора CK1 в промежутке от приблизительно -1 до приблизительно +1 часа от середины фазы покоя.

14. Способ по любому из пп. 7-13, где пациент представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека.