СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА - НАДРОПАРИНА КАЛЬЦИЯ Российский патент 2025 года по МПК C08B37/10 

Описание изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к способу получения низкомолекулярного гепарина, такого как надропарин кальция, который может быть использован для производства лекарственных препаратов.

Уровень техники

Изобретение относится к новым способам получения низкомолекулярного гепарина (НМГ), а именно, надропарина кальция, который имеет среднюю молекулярную массу 4,5 кДа. Сопряженное основание надропарина характеризуется следующей общей структурной формулой:

Низкомолекулярные гепарины представляют собой отрицательно заряженные высокосульфатированные гликозаминогликаны, состоящие из цепей связанных между собой остатков d-гликозамина и глюкуроновой или идуроновой кислот. Антитромботическое действие НМГ, подобно нефракционированному гепарину (НФГ), обусловлено инактивацией тромбина в результате образования комплекса с антитромбином. Уменьшение размеров молекулы в результате деполимеризации приводит к изменению антикоагулянтных свойств: если действие НФГ направлено против тромбина (IIa-фактор) и активированного Х фактора свертывания (Ха), то действие НМГ преимущественно против Ха, в чем и состоит основное отличие НМГ от обычного гепарина. Связывание пентасахаридов с антитромбином вызывает конформационные изменения в его молекуле, ускоряя взаимодействие с тромбином и Ха-фактором почти в 1000 раз. НМГ обладают лучшей биодоступностью по сравнению с обычным гепарином, имеют большее время полувыведения и независимый от дозы клиренс, тем самым обеспечивают более предсказуемый антикоагулянтный эффект. В свою очередь эти особенности фармакокинетики НМГ обусловлены более низкой способностью связывания с белками плазмы, эндотелием и макрофагами [Н.Л. Козловская. Низкомолекулярные гепарины в профилактике и лечении тромбозов у пациентов с хронической болезнью почек. Эффективная фармакотерапия. Урология и Нефрология. Спецвыпуск, 2012]. Период полувыведения у НМГ в 2-4 раза больше, чем у НФГ, поэтому удлиняется срок действия препарата. Таким образом, препараты низкомолекулярных гепаринов можно вводить 1-2 раза в сутки. НМГ вводят подкожно, внутримышечно, а некоторые препараты и перорально. Согласно инструкции по применению лекарственного препарата «Фраксипарин», раствор для подкожного введения, где действующим веществом выступает надропарин кальция, его биодоступность составляет почти 98% [П №015872/01 от 18.05.2023]. Надропарин кальция применяется для профилактики тромбоэмболических осложнений, лечения тромбоэмболии легочной артерии или проксимального тромбоза нижних конечностей, профилактики свертывания крови во время гемодиализа, лечения нестабильной стенокардии и инфаркта миокарда без зубца Q.

Известные способы получения надропарина кальция, включающие стадии деполимеризации, очистки с использованием катионитов, осаждением этиловым спиртом с последующим высушиванием либо лиофилизацией, представлены в патентных документах EP 0014184 A2, EP 0163582 A2, RU 2639574 С2, RU 2753678 С1, RU 2133253 С1, CN 103408676 A, CN 103382232 B, CN 104072639 B, CN 109748984 A, CN 109942726 A, CN 111019014 A. Описанные в них способы получения являются технологически сложными, длительными и не всегда обеспечивают высокий выход продукта. Общим недостатком данных способов является то, что проведение процессов в таких условиях сопровождается избыточной деполимеризацией, и в результате доля низкомолекулярной фракции (менее 2000 Да) становится более 15%. Это ведет к снижению выхода целевого продукта и его качества.

Известны способы получения надропарина кальция, включающие использование ферментативного гидролиза сырья гепарина натрия папаином и рибонуклеазой II. Такие примеры приведены в патентных заявках CN 103275246 B (опубл. 26.08.2015; МПК C08B 37/10), WO 2019000336 A1 (опубл. 03.01.2019; МПК C08B 37/10, C12Q 1/00). Описанные в них способы также довольно затратны по времени и требовательны к технологическому оборудованию. Первая стадия ферментативного гидролиза включает взаимодействие сырьевого гепарина натрия с ферментами в течение 8-10 ч, затем фильтрат обесцвечивают перекисью водорода, проводят ультрафильтрацию в течение 5-6 ч и осаждают этиловым спиртом также в течение длительного времени. Далее осадок подвергают разложению в забуференной ледяной уксусной кислоте нитритом кальция. После завершения процесса проводят реакцию восстановления борогидридом натрия в течение 10-15 ч. Полученный осадок растворяют в воде, облучают УФ светом, далее окисляют перекисью водорода в течение 6-8 ч. Высаживанием из этилового спирта получают осадок, затем его растворяют в воде и добавляют хлорид кальция для замещения на ионы кальция в течение 8-10 ч. Раствор подвергают нанофильтрации, ультрафильтрационной очистке и дальнейшей лиофилизации. Таким образом, процесс занимает большое количество последовательных превращений и очисток в течение примерно 60 ч. Это может существенно сказаться на выходе продукта, т.к. с каждой стадией увеличиваются потери целевого продукта. Стоит отметить, что осаждение этиловым спиртом представляет собой статичный процесс, который является равновесным, т.е. при достижении равновесия скорость осаждения уменьшается.

Прототипом предлагаемого нами способа можно считать способ получения надропарина кальция, описанный в патентной заявке Китая CN 104072638 А (опубл. 01.10.2014, МПК C08B 37/10), который включает нижеприведенные этапы. К раствору гепарина в воде, добавляют ледяную уксусную кислоту для доведения величины рН до 3,0-6,0, после чего добавляют нитрит натрия при температуре 20-300°C и выдерживают 4-6 часов. Далее рН раствора доводят до значения 8,0-12,0 с помощью гидроксида натрия, затем к полученному раствору добавляют борогидрид натрия, выдерживают 4-16 часов, далее доводят рН до 5,0-7,0 ледяной уксусной кислотой. Замену ионов натрия на ионы кальция осуществляют методом диа/ультрафильтрации с использованием мембран с пределом исключения по молекулярной массе 1,0 - 5,0 кДа. Надропарин кальция осаждают 95 % этанолом. Осадок разводят водой, фильтруют, полученный фильтрат стерилизуют и подвергают сублимационной сушке. К сожалению, авторы публикации указывают только время протекания реакции деполимеризации и дальнейшего восстановления, которое согласно представленным примерам, составляет от 8 до 22 ч. Для оценки общего времени получения надропарина кальция стоит также учитывать время, потраченное на диа/ультрафильтрацию и высаживание этанолом, которое не было указано. Недостатками приведенного способа получения надропарина кальция являются длительность технологического процесса, использование в технологическом процессе легковоспламеняющегося органического растворителя - этилового спирта. Кроме того, проведение процессов в таких условиях сопровождается потерей продукта, что ведет к снижению выхода целевого продукта и дополнительным затратам на его очистку. Выбранный в качестве прототипа способ, хотя и позволяет получать целевой продукт с хорошим качеством, пригодным для производства лекарственного средства, в технологическом отношении является менее предпочтительным, так как вышеуказанные недостатки значительно сокращают эффективность и способа.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в расширении арсенала технических средств получения надропарина кальция и в том, чтобы предложить способ получения надропарина кальция, позволяющий повысить выход целевого продукта за счет уменьшения числа и длительности технологических стадий.

К техническими результатам предлагаемого изобретения относятся реализация изобретением своего назначения, сокращение общего времени проведения основных технологических операций до 7-8 ч и повышении выхода целевого продукта, высокая воспроизводимость, осуществление всех стадий без использования органических растворителей. Достигнутые технические результаты делают возможным промышленное получение надропарина кальция экономичным и воспроизводимым образом.

Раскрытие сущности изобретения

В предлагаемом способе получения надропарина кальция в качестве сырья используют гепарин натрия, представляющий собой нефракционированный гепарин с удельной активностью 280-285 МЕ/кг, полученный из слизистой оболочки кишечника свиньи. Такой гепарин натрия может быть получен, в частности, согласно способу, описанному в патентной заявке RU 2023134113 A с датой подачи 20.12.2023.

В реактор добавляют расчетное количество воды очищенной, затем при перемешивании загружают расчетное количество гепарина натрия. Перемешивание продолжается до полного растворения гепарина натрия в воде. К полученному раствору добавляется расчетное количество уксусной кислоты, при этом рН раствора должен быть 3,0 - 3,5. Затем добавляют нитрит натрия из расчёта гепарин/натрия нитрит = 30/1 по массе. Реакционную массу перемешивают в течение 2,0±0,1 часов при температуре 40±2°С. После завершения деполимеризации к смеси добавляются раствор гидроксида натрия до значения pH 10,0-10,5. Далее добавляют натрия борогидрид в качестве восстановителя в количестве 1,67% от массы исходного гепарина натрия и смесь перемешивают в течение 4,0±0,1 часов при температуре 40±2°С. Для окисления остатков нитрита при перемешивании прибавляют раствор водорода пероксида и выдерживают около 0,10±0,05 часа. Для разложения водорода пероксида устанавливают значение рН 3,5 - 4,0, используя хлористоводородную кислоту, после чего реакционную массу выдерживают при перемешивании 0,5±0,2 часа. Далее рН раствора повышают до 7,0-7,5 раствором натрия гидроксида, и смесь выдерживают в течение 1,0±0,1 часа при температуре 40±2°С. Затем реакционную массу охлаждают до температуры 20±2°С. С целью концентрирования реакционной смеси проводится ультрафильтрация на ультрафильтрационной кассете с мембраной с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа. Для замены ионов натрия на ионы кальция проводят диафильтрацию с применением вышеуказанной мембраны относительно 1,5 М раствора кальция хлорида. После завершения диафильтрации раствор направляют на стерилизующую фильтрацию с использованием фильтра с диаметром пор 0,22 мкм. После этого стерильный раствор надропарина кальция лиофильно высушивают и расфасовывают в стерильные полиэтиленовые пакеты.

Под ультрафильтрацией и диафильтрацией в настоящем изобретении понимают следующее. Ультрафильтрация - это процесс мембранной фильтрации по молекулярной массе, т.е. вещества с высокой молекулярной массой задерживаются, а низкомолекулярные вещества проходят через мембрану, в том числе вода. Таким образом происходит концентрирование высокомолекулярных веществ. Диафильтрация также представляет собой процесс мембранной фильтрации, аналогично ультрафильтрации, но с вводом растворителя или раствора, при этом происходит замена одного растворителя или раствора на другой. Так, в приведенных ниже примерах происходит замена ионов натрия на ионы кальция.

Время, затраченное на проведение реакции деполимеризации и восстановления, согласно предлагаемому изобретению, составляет 6 ч, что почти в 2-4 раза меньше, чем время, указанное в способе, выбранном в качестве прототипа. Общее время основных технологических стадий составило порядка 7-8 часов.

Подтверждение структуры полученного вещества проводили по следующим показателям: средняя относительная молекулярная масса, молярное соотношение сульфатных и карбоксильных групп, количественное определение (определение активностей анти-фактор Ха и анти-фактор IIa). Все полученные значения приведены в Таблице 1. На Фиг. 1 приведена хроматограмма молекулярно-массового распределения надропарина кальция, полученного способом по Примеру 1. На Фиг. 2 приведен ¹³C-ЯМР спектр надропарина кальция, полученного способом по Примеру 1.

Образцы надропарина кальция, полученные по примерам 1-3, имеют крайне близкие показатели качества и соответствуют требованиям, предъявляемым к активным фармацевтическим субстанциям согласно монографии европейской фармакопеи (European Pharmacopoeia, Ph. Eur) издания №11.4 (2024 г.).

Таблица 1. Физико-химические показатели надропарина кальция, полученного способом согласно Примеру 1

Показатель Надропарин кальция Описание Порошок белого цвета Растворимость Легко растворим в воде pH 6,5 Содержание свободных сульфатов, % 0,13 Содержание нитритов, м.д. 0,2 Содержание азота, % 1,8 Содержание кальция, % 10,7 Молярное отношение сульфатных и карбоксилатных групп 2,1 Молекулярно-массовое распределение Значение средней молекулярной массы 4637 Содержание фракций с молекулярной массой менее 2000 Да, % 6,6 Содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 8000 Да, % 84,2 Содержание фракций от 2000 до 4000 Да, %6 42,2 Количественное содержание (активность) Анти-Xa активность 113 Анти-IIa активность 31 Отношение анти-Xa активности к анти-IIa активности 3,6

Перечень фигур

Для пояснения сущности заявляемого технического результата к описанию приложены следующие Фиг. 1, 2.

На Фиг. 1 приведена хроматограмма молекулярно-массового распределения надропарина кальция, полученного способом по Примеру 1.

На Фиг. 2 приведен ¹³C-ЯМР спектр надропарина кальция, полученного способом по Примеру 1.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Спектры ¹³C ЯМР были зарегистрированы на спектрометре ЯМР JEOL JNM ECA 600 с использованием дейтерия оксида, содержащего 0,02 мг/мл натрия тетрадейтеродиметилсилапентаноата в качестве растворителя. Высокоэффективную хроматографию осуществляли на жидкостном хроматографе, снабженном диодно-матричным детектором «Agilent 1260 Infinity II LC» («Agilent Technologies», США) c использованием колонки «Dionex IonPac AS11-HC» («Thermo Scientific», США).

Возможность осуществления заявленной группы изобретений иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается только ими.

Пример 1. Получение надропарина кальция

В химический реактор загружают 50 л воды очищенной и при перемешивании загружают 1200 г гепарина натрия. Перемешивание продолжают до полного растворения гепарина натрия в воде. Затем добавляют 1,15 л ледяной уксусной кислоты и доводят рН раствора до 3,0. Добавляют 40,0 г натрия нитрита и продолжают перемешивание в течение 2 часов. После завершения деполимеризации рН раствора устанавливают равной 10,0 с помощью раствора натрия гидроксида. К реакционной массе добавляют 20,0 г натрия борогидрида и перемешивают в течение 4 часов, после чего в смесь добавляют 0,07 л 3% водорода пероксида и выдерживают при перемешивании 0,10 часа. Затем устанавливают рН 3,5, используя хлористоводородную кислоту концентрированную, и выдерживают при перемешивании еще 0,5 часа. Далее рН раствора повышают до 7,0, используя 5М раствор натрия гидроксида. Выдерживают реакционную массу в течение 1 часа. Вышеперечисленные стадии ведут при температуре 40°С.

Затем реакционную смесь охлаждают до температуры 20°С и проводят очистку на ультрафильтрационной кассете с мембраной с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа. Для замены на ионы кальция проводят диафильтрацию с применением вышеуказанной мембраны, относительно 1,5 М раствора кальция хлорида. После завершения диафильтрации раствор направляют на стерилизующую фильтрацию с использованием фильтра с диаметром пор 0,22 мкм. После этого стерильный раствор надропарина кальция лиофильно высушивают и упаковывают в стерильные полиэтиленовые пакеты. Выход продукта составляет 960 г.

Пример 2. Получение надропарина кальция

В химический реактор добавляют 50 л воды очищенной и при перемешивании загружают 1200 г гепарина натрия. Перемешивание продолжают до полного растворения гепарина натрия в воде. Затем добавляют 1,1 л ледяной уксусной кислоты и доводят рН раствора до 3,3. Добавляют 40,0 г натрия нитрита, и продолжают перемешивание в течение 2 часов. После завершения деполимеризации рН раствора устанавливают равной 10,2 с помощью раствора натрия гидроксида. К реакционной массе добавляют 20,0 г натрия борогидрид и перемешивают в течение 4 часов, после чего в смесь добавляют 0,07 л 3% водорода пероксида и выдерживают при перемешивании 0,10 часа. Затем устанавливают рН 3,7, используя хлористоводородную кислоту концентрированную, и выдерживают при перемешивании еще 0,5 часа. Далее рН раствора повышают до 7,4, используя 5 М раствор натрия гидроксида. Выдерживают реакционную массу в течение 1 часа. Вышеперечисленные стадии ведут при температуре 38°С.

Затем реакционную смесь охлаждают до температуры 18°С и проводят очистку на ультрафильтрационной кассете с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа. Для замены на ионы кальция проводят диафильтрацию с применением вышеуказанной мембраны, относительно 1,5 М раствора кальция хлорида. После завершения диафильтрации раствор направляют на стерилизующую фильтрацию с использованием фильтра с диаметром пор 0,22 мкм. После этого стерильный раствор надропарина кальция лиофильно высушивают и упаковывают в стерильные полиэтиленовые пакеты. Выход продукта составляет 963 г.

Пример 3. Получение надропарина кальция

В химический реактор добавляют 50 л воды очищенной и при перемешивании загружают 1200 г гепарина натрия. Перемешивание продолжают до полного растворения гепарина натрия в воде. Затем добавляют 0,9 л ледяной уксусной кислоты и доводят рН раствора до 3,5. Добавляют 40,0 г натрия нитрита, и продолжают перемешивание в течение 2 часов. После завершения деполимеризации рН раствора устанавливают равной 10,5 с помощью раствора натрия гидроксида. К реакционной массе добавляют 20,0 г натрия борогидрид и перемешивают в течение 4 часов, после чего в смесь добавляют 0,07 л 3% водорода пероксида и выдерживают при перемешивании 0,10 часа. Затем устанавливают рН 4,0, используя хлористоводородную кислоту концентрированную, и выдерживают при перемешивании еще 0,5 часа. Далее рН раствора повышают до 7,5, используя 5М раствор натрия гидроксида. Выдерживают реакционную массу в течение 1 часа. Вышеперечисленные стадии ведут при температуре 42°С.

Затем реакционную смесь охлаждают до температуры 22°С и проводят очистку на ультрафильтрационной кассете с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа. Для замены на ионы кальция проводят диафильтрацию с применением вышеуказанной мембраны, относительно 1,5 М раствора кальция хлорида. После завершения диафильтрации раствор направляют на стерилизующую фильтрацию с использованием фильтра с диаметром пор 0,22 мкм. После этого стерильный раствор надропарина кальция лиофильно высушивают и упаковывают в стерильные полиэтиленовые пакеты. Выход продукта составляет 965 г.

Изобретение относится к способу получения надропарина кальция. Способ включает растворение гепарина натрия в воде, добавление уксусной кислоты до pH раствора 3,0-3,5. Затем осуществляют деполимеризацию гепарина нитритом натрия при массовом соотношении нитрита натрия и гепарина натрия 1:30. Увеличивают рН раствора до 10,0-10,5, добавляют натрия борогидрид в количестве 1,67% от массы гепарина натрия и перемешивают. Далее добавляют пероксид водорода и перемешивают. Обеспечивают разложение пероксида водорода хлористоводородной кислотой при pH 3,5-4,0 и доводят рН раствора до 7,0-7,5. Проводят очистку полученной смеси ультрафильтрацией на мембране с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа, диафильтрацию полученного раствора на мембране с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа относительно раствора хлорида кальция, стерилизующую фильтрацию раствора и направляют стерильный раствор на лиофилизацию. Изобретение позволяет увеличить выход надропарина кальция, сократить число стадий и не использовать растворитель этанол. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Способ получения надропарина кальция из гепарина натрия, включающий следующие стадии:

a) растворение гепарина натрия в воде;

b) добавление уксусной кислоты до pH раствора 3,0-3,5;

c) деполимеризация гепарина нитритом натрия при массовом соотношении нитрита натрия и гепарина натрия 1:30;

d) увеличение рН раствора до 10,0-10,5, добавление натрия борогидрида в количестве 1,67% от массы гепарина натрия и перемешивание;

e) добавление пероксида водорода и перемешивание;

f) разложение пероксида водорода хлористоводородной кислотой при pH 3,5-4,0;

g) доведение рН раствора до 7,0-7,5;

h) очистка полученной смеси ультрафильтрацией на мембране с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа;

i) диафильтрация полученного раствора на мембране с пределом исключения по молекулярной массе 1 кДа относительно раствора хлорида кальция;

j) стерилизующая фильтрация раствора;

k) лиофилизация стерильного раствора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадии 1a-g проводят при температуре 40±2°С, деполимеризацию гепарина натрия проводят в течение 2,0±0,1 часов, восстановление натрия борогидридом проводят в течение 4,0±0,2 часов, обработку пероксидом водорода проводят в течение 0,10±0,05 часа, разложение пероксида водорода проводят в течение 0,5±0,2 часа.