Область техники
Изобретение относится к средствам, обладающим прямым антикоагулянтным действием и может быть использовано для лечения патологических состояний, возникающих вследствие нарушения работы системы гемостаза.
Уровень техники
Антикоагулянты - препараты, блокирующие реакции плазменного гемостаза - в настоящее время очень широко используются в клинической медицине. Антикоагулянты прямого действия препятствуют тромбообразованию за счет воздействия на факторы свертывания крови, что приводит к уменьшению числа активно функционирующих молекул тромбина и подавлению образования фибрина.
Препараты низкомолекулярного (фракционированного) гепарина получают в результате химической или ферментативной деполимеризации нефракционированного гепарина. Их молекулярная масса колеблется от 1000 до 10000 Да и составляет в среднем 4000-6000 Да. По механизму действия препараты низкомолекулярного гепарина не отличаются от нефракционированного гепарина, но в большей степени влияют на фактор свертывания крови (ФСК) Ха, чем на ФСК IIа (тромбин). Кроме того, по сравнению с нефракционированным гепарином у препаратов низкомолекулярного гепарина наблюдается более выраженное действие в отношении стимуляции высвобождения ингибитора пути тканевого фактора, инактивации фактора Виллебранда, указанные фракции гепарина меньше связываются тромбоцитами, тромбоцитарным фактором 4 и остеобластами, меньше активируют остеокласты. Помимо различий в способах получения, препараты низкомолекулярного гепарина заметно различаются по составу и биологической активности. Поэтому их рассматривают как отдельные, не взаимозаменяемые лекарственные средства (Сторожаков Г.И., Горбаченков А.А., 2009).
Из уровня техники известно средство, содержащее фракции гепарина в следующем соотношении: гепарин с молекулярной массой менее 3000 Да - 25-35%, гепарин, имеющий молекулярную массу от 3000 Да и менее 5000 Да - 15-25%, гепарин с молекулярной массой от 5000 Да до 8000 Да составляет 20-30%, гепарин, имеющий молекулярную массу более 8000 Да - 20-30%) всего низкомолекулярного гепарина. Однако, данное средство применяется для лечения фиброза легких, и не обладает антикоагулянтной активностью (патент CN 0108117615 В, 14.04.2020).
Также известен и широко применяется в клинической практике для профилактики и лечения тромбоэмболии, тромбообразования в системе экстракорпорального кровообращения, лечения нестабильной стенокардии и инфаркта миокарда препарат эноксапарин натрия, содержащий гепарин натрия, среднее значение молекулярной массы которого находится в диапазоне 3800-5000 (характерно 4500) Да, количество молекул с молекулярной массой менее 2000 Да - в пределах 12-20%, количество молекул с молекулярной массой от 2000 до 8000 Да - в пределах 68.0-82.0%. Активность анти-Ха не менее 90 и не более 125 МЕ/мг. Соотношение активности по фактору Ха и IIа в пределах 3.3-5.3. (Савельева К.Р. и др., Биоаналог низкомолекулярного гепарина эноксапарина натрия, доклад на Научно-практической конференции "Новые химико-фармацевтические технологии", 28 мая 2014 г, РХТУ им. Д.И. Менделеева).
В то же время уменьшение размера и стандартизация молекул низкомолекулярного гепарина (НМГ) позволяют им оказывать более предсказуемое антикоагулянтное действие благодаря лучшей биодоступности и независимому от введенной дозы клиренсу.
С этой точки зрения интерес представляет относительно новая группа НМГ, называемая ультранизкомолекулярными гепаринами (УНМГ). Данная группа препаратов в клинике в настоящее время включает бемипарин и семулопарин.
Оба препарата (бемипарин около 3600 кДа, семулопарин около 3000 кДа) имеют существенно сниженную молекулярную массу в сравнении с наименьшим из применяемых НМГ - эноксапарином (4600 кДа). Это различие предполагает, в первую очередь, еще большую активность в отношении Ха-фактора в сравнении с тромбином (8:1, 10:1), меньшее взаимодействие с молекулами на поверхности клеток эндотелияи, соответственно, больший период выведения, а также меньший риск геморрагических осложнений. Кроме того, различные по длине цепочки, могут дифференцированно взаимодействовать с такими биологически активными молекулами, как факторы роста (В.В. Птушкин, Влияние низкомолекулярных гепаринов на выживаемость онкологических больных, Фармакотерапия, №2, 2013, с. 70-76).
С учетом изложенного наиболее близким аналогом изобретения является антикоагулянтное средство Цибор (регистрационный номер ЛСР-004370/09. Выдан 2009.06.02) и способ его применения, содержащее бемипарин натрия со средней молекулярной массой 3000-4200 Да. Молекулярно-массовое распределение бемипарина натрия в данном препарате следующее:
- низкомолекулярная фракция (не более 2000 Да) - не более 35%;
- фракция с молекулярной массой (2000-6000 Да) - 50-75%;
- высокомолекулярная фракция (не менее 6000 Да) - не более 15%.
Антифактор-Ха активность бемипарина натрия составляет 80-120 МЕ/мг, а антифактор-IIа активность составляет 5-20 МЕ/мг в пересчете на сухое вещество. Соотношение активностей антифактор-Ха/антифактор-IIа приблизительно равно 8.
Бемипарин натрия является антикоагулянтом прямого действия и относится к группе низкомолекулярных гепаринов. Снижение свертываемости крови под влиянием бемипарина натрия связано с тем, что он усиливает угнетающее действие антитромбина III на ряд факторов свертывания крови (Ха и в меньшей степени - на IIа).
После п/к введения бемипарин натрия быстро всасывается, биодоступность составляет 96%. Максимальная антифактор-Ха активность в плазме крови при введении препарата в профилактических дозах - 2500 ME и 3500 ME - достигается через 2-3 ч с пиками активности порядка (0,34±0,08) и (0,45±0,07) ME антифактор-Ха/мл соответственно. Антифактор-IIа активность при введении препарата в вышеуказанных дозах не обнаруживается. Показания к применению:
профилактика тромбоэмболии у пациентов при общехирургических вмешательствах и ортопедических операциях;
профилактика тромбоэмболии у пациентов с высоким или умеренным риском тромбообразования (без хирургического вмешательства);
вторичная профилактика рецидивов венозной тромбоэмболии у пациентов с тромбозом глубоких вен и преходящими факторами риска;
профилактика свертывания крови в системе экстракорпорального кровообращения при проведении гемодиализа.
Недостатком данного средства является наличие умеренного геморрагического эффекта, обусловленного наличием антифактор-IIа активности в диапазоне 5-20 МЕ/мг (соотношение активностей антифактор-Ха/антифактор-IIа более 8).
Задачей настоящего изобретения является разработка средства, содержащего ультранизкомолекулярный гепарин, обладающего антикоагулянтными свойствами, более избирательно воздействующего на антифактор-Ха.
Для решения этой задачи мы предлагаем средство, обладающее антикоагулянтным действием, содержащее в качестве активного вещества, фракции ультранизкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 1700-2600 Да при следующем молекулярно-массовом распределении:
содержание фракций с молекулярной массой менее 2000Да - 30-50%;
содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000Да - 40-70%;
содержание фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - не более 10%.
В частном случае воплощения изобретения заявленное средство содержит фракции в качестве активного вещества в количестве 12000 МЕ/мл.
В частном случае воплощения изобретения заявленное средство содержит фракции в качестве активного вещества в количестве 17-24 масс. % и воду для инъекций - до 100 масс %,
Также предлагается способ лечения состояний, связанных с нарушением работы системы гемостаза, включающий введение заявляемого средства в эффективном количестве.
В частном случае воплощения изобретения предлагается способ лечения состояний, связанных с нарушением работы системы гемостаза, включающий введение заявляемого средства в дозе 30-240 МЕ/кг.
В частном случае воплощения изобретения предлагается способ лечения состояний, связанных с нарушением работы системы гемостаза, включающий введение заявляемого средства, причем введение средства осуществляют внутривенно или подкожно.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в расширении спектра антикоагулянтных средств, в получении антикоагулянтного средства, обладающего выраженным избирательным действием в отношении ФСК Ха, характеризующимся практическим отсутствием антифактор-Па активности и, вследствие этого, низким геморрагическим эффектом.
Особенностью заявляемого средства является возможность его получения из отходов синтеза надропарина кальция. Под отходами мы подразумеваем фракции менее 2000 Да и более 8000 Да, которые отсекаются на разных этапах синтеза надропарина кальция. Наибольшее содержание фракций менее 2000 Да наблюдается на стадии переосаждения надропарина натрия. Выделение данных фракций происходит без использования дорогостоящих методов, а именно ультрафильтрации и диализа, путем высаживания их из водного раствора этиловым спиртом. Содержание данных фракций в растворе составляет порядка 35% от массы исходного гепарина натрия.
Краткое описание поясняющих материалов.
Фиг. 1 - к Примеру 1. Хроматограммы молекулярно-массового распределения образцов бемипарина натрия и заявленного средства.
Таблица 1. Молекулярно-массовое распределение (ММР) для образцов заявленного средства и препарата Цибор.
Таблица 2. Анти-Ха и анти-IIа активность заявленного средства, полученного, как описано в Примере 1.
Осуществление изобретения.
Получение средства, обладающего антикоагулирующим действием.
Проводят контролируемый гидролиз гепарина натрия в трехгорлой кинетической ячейке с рубашкой, производитель NK Labware Factory Store, с использованием нитрита натрия в присутствии боргидрида натрия в кислой среде, после чего реакционную массу нейтрализуют водным раствором гидроксида натрия. Затем с помощью мерного цилиндра через химическую воронку к раствору приливают этиловый спирт и оставляют до выпадения масла. Раствор декантируют. Декантируемый раствор собирают в сборник (канистра с крышкой и уплотнительным кольцом), а оставшееся масло перемешивают с этиловом спиртом. Полученный осадок отфильтровывают и сушат до постоянной массы.
Полученный высушенный осадок растворяют в дистиллированной воде и добавляют хлорид натрия, затем к раствору добавляют 10%-ый раствор соляной кислоты, доводя рН до значения 3.9±0.05. Затем в смесь добавляют этиловый спирт и оставляют раствор без перемешивания до выпадения масла. Затем раствор декантируют, а оставшееся масло перемешивают с этиловым спиртом. Полученный осадок отфильтровывают и сушат до постоянной массы.
Полученный высушенный осадок растворяют в дистиллированной воде. В полученный раствор при интенсивном перемешивании с помощью магнитной мешалки добавляют этиловый спирт, перемешивают и выдерживают суспензию в течение 5 часов для выпадения осадка. Затем раствор декантируют, а оставшийся осадок фильтруют на фильтре Шотта. Полученный порошок сушат под вакуумом в течение 24 часов. Получают заявленное средство.
Молекулярно-массовое распределение (ММР) определяют методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке TSKgel G2000 SW 7,5×300 мм, 10 мкм (Tosoh Bioscience).
Также проводят определение активности анти-фактор-Ха и анти-фактор-IIа для средства и средства прототипа биохимическим методом с хромогенными субстратами, (Ренапарин-тест код ГП-6) согласно ГФ РФ ОФС 1.8.2.0003.18.
Полученные данные иллюстрируют, что полученное средство обладает выраженным избирательным действием в отношении ФСК Ха, характеризующимся практическим отсутствием антифактор-IIа активностью.
Приготовление средства для терапевтических манипуляций осуществляется путем внесения в воду для инъекций заявленного средства, которое перемешивают при комнатной температуре до полного растворения и измеряют рН. При необходимости доводят рН до значения 6,8 медленным добавлением раствора кислоты хлористоводородной или 0,1% раствора гидроксида натрия и после этого доводят объем раствора водой для инъекций до 100 масс %. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливают в ампулы и герметично запаивают. Измеряют анти-фактор-Ха активность полученной композиции. Активность полученной композиции для подкожного и внутрикожного введения составляет 12000 ЕД/мл.
Оценку антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при внутривенном введении проводили на модели венозного стаза у крыс-самцов линии Wistar, согласно «Руководству по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н.
Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при подкожном введении проведены на беспородных кроликах массой 4-5 кг.
Всего для оценки действия in vivo нами проводилось исследование у 91 крысы линии Wistar, а также 12 кроликах, как при подкожном, так и внутривенном введении. Полученные результаты подтвердили хорошую всасываемость средства, его избирательное действие в отношении ФСК Ха, и практическое отсутствие геморрагического эффекта, обусловленного низкой антифактор-Па активностью.
При осмотре в месте инъекции гематомы и/или экхимоза не обнаружено, также отсутствует кровоточивость слизистых оболочек, что свидетельствует об отсутствии выраженной местной и системной побочной реакции.
Дополнительно для иллюстрации осуществления изобретений приводятся нижеследующие примеры.
Пример 1. Получение средства, обладающего антикоагулирующим действием.
Заявляемое средство получали следующим образом:
Проводили контролируемый гидролиз гепарина натрия в кинетической ячейке с использованием нитрита натрия в присутствии боргидрида натрия в кислой среде (рН 2,3-2,5), при температуре 15°С, после чего реакционную массу нейтрализовали до рН 7,0 водным раствором гидроксида натрия. Затем к раствору добавляли этиловый спирт и оставляли до выпадения масла. Раствор декантировали, а оставшееся масло перемешивали с этиловым спиртом. Полученный осадок отфильтровывали и сушили до постоянной массы.
Полученный высушенный осадок растворяли в дистиллированной воде и добавляли хлорид натрия, при температуре раствора 24°С, рН раствора=6.8±0.3. Затем к раствору добавляли 10%-ый раствор соляной кислоты, доводя рН до значения 3.9±0.05. По окончании добавления соляной кислоты в колбу загружали дополнительно 40 мл дистиллированной воды. Затем в смесь добавляли этиловый спирт и оставляли раствор на 2 часа без перемешивания до выпадения масла. Затем раствор декантировали, а оставшееся масло перемешивали с этиловом спиртом. Полученный осадок отфильтровывали и сушили до постоянной массы.
Полученный высушенный осадок растворяли в дистиллированной воде. В полученный раствор при интенсивном перемешивании добавляли в этиловый спирт, перемешивали еще 15 минут, затем перемешивание отключали и выдерживали суспензию в течение 5 часов для выпадения осадка. Затем раствор декантировали, а оставшийся осадок фильтровали на фильтре Шотта.
Полученный порошок сушили под вакуумом в течение 24 часов. Получают заявленное средство.
Молекулярно-массовое распределение (ММР) определялось методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке TSKgel G2000 SW 7,5×300 мм, 10 мкм (Tosoh Bioscience).
В таблице 1 приведены примеры ММР ряда образцов заявленного средства, в сравнении с образцом бемипарина натрия.
Хроматограммы, характеризующие молекулярно-массовое распределение образцов бемипарина натрия и заявленного средства приведены рисунке 1.
Таким образом получаемое средство, характеризуется со средней молекулярной массой 1700-2600 Да при следующем молекулярно-массовом распределении:
содержание фракций с молекулярной массой менее 2000да - 30-50%; содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000да - 40-70%; содержание фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - не более 10%.
Пример 2. Количественное определение анти-Ха и анти-IIа активности (in vitro) заявленного средства и средства-прототипа.
Определение активности анти-фактор-Ха и анти-фактор-IIа для средства и средства прототипа проводят биохимическим методом с хромогенными субстратами (Ренапарин-тест код ГП-6)согласно ГФ РФ ОФС 1.8.2.0003.18. Исследование проводили на спектрофотометре Tecan infinite 200Pro.
Приготовление рабочего буферного раствора рН 7,4.
В мерный стакан вместимостью 100 мл помещают 5 мл буферного раствора концентрированного, входящего в набор и доливают водой до 80 мл, затем при перемешивании количественно переносят бычий сывороточный альбумин, входящий в набор, и тщательно перемешивают до растворения, доводят объем раствора до 100 мл водой и перемешивают. Срок годности раствора 7 дней при температуре от +2 до +8°С.
Приготовление 70% раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 70 мл кислоты уксусной ледяной, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранится 3 месяца.
Приготовление раствора антитромбина III (АТ-III) для определения анти-Ха активности.
Во флакон с лиофильно высушенным АТIII, входящий в набор, вносят 1,0 мл рабочего буферного раствора рН 7,4 и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Срок годности раствора 3 суток при температуре от +2 до +8°С.
Приготовление раствора антитромбина III (АТIII) для определения анти-IIа активности.
Во флакон с лиофильно высушенным АТIII, входящий в набор, вносят 2,0 мл рабочего буферного раствора рН 7,4 и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Срок годности раствора 3 суток при температуре от +2 до +8°С. Приготовление раствора фактора Ха.
Во флакон с лиофильно высушенным фактором Ха, входящий в набор, вносят 6,0 мл рабочего буферного раствора рН 7,4 и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Срок годности раствора 3 суток при температуре от +2 до +8°С. Приготовление раствора фактора IIа.
Во флакон с лиофильно высушенным фактором IIа, входящий в набор, вносят 9,0 мл рабочего буферного раствора рН 7,4 и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Срок годности раствора 3 суток при температуре от +2 до +8°С.
Приготовление раствора хромогенного субстрата для фактора Ха.
Во флакон с лиофильно высушенным хромогенным субстратом для фактора Ха, входящий в набор, вносят 6,0 мл воды и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Срок годности раствора 10 суток при температуре от +2 до +8°С.
Приготовление раствора хромогенного субстрата для фактора Па.
Во флакон с лиофильно высушенным хромогенным субстратом для фактора Па, входящий в набор, вносят 6,0 мл воды и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Срок годности раствора 10 суток при температуре от +2 до +8°С.
Приготовление раствора рабочего стандартного образца низкомолекулярного гепарины (РСО НМГ).
В ходе выполнения аналитического контроля для определения активностей анти-фактор Ха и анти-фактор IIа использовали стандарт низкомолекулярного гепарина производства НПО Ренам серия №0718 (поставлялся вместе с набором для определения активности).
Во флакон с РСО НМГ, входящий в набор, вносят 1,0 мл воды и растворяют при осторожном покачивании.
Раствор готов к проведению анализа через 15 минут после разведения. Раствор хранят в холодильнике не более 7 дней.
Построение калибровочного графика. Раствор стандарта с активностью 9,5 разводят в 50 раз буферным раствором (разведение S1). Затем готовят серию последовательных разведений, пошагово в 1,5 раза (S2-S6). Разведения стандартного образца устанавливают в штатив прибора. Измеряют оптическую плотность растворов. Строят график зависимости логарифма активности гепарина от оптической плотности.
Проведение анализа. 10 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, содержащую 9 мл воды, перемешивают, доводят объем водой до метки. Полученный раствор разводят водой в 100 раз.
200 мкл полученного раствора помещают в пробирку, добавляют 1800 мкл буферного раствора, перемешивают (разведение Т1). Последовательным разведением в 1,5 раза получают еще три разведения (Т2-Т4). В полумикрокюветах измеряют оптическую плотность растворов при 405 нм. В качестве раствора сравнения используют буферный раствор для разведения. Холостое определение проводят в начале и в конце каждой серии, используя буферный раствор вместо растворов препарата низкомолекулярного гепарина. Активность испытуемого раствора препарата в ME анти-IIа-факторной активности/мл рассчитывают по зависимости оптической плотности от логарифма концентрации растворов препарата и растворов сравнения, используя обычные статистические методы для параллельных определений для 4 доз.
Результаты четырех образцов заявляемого средства и Цибора представлены в таблице 2.
Как следует из данных приведенных в таблице 2, заявленное средство обладает выраженным избирательным действием в отношении ФСК Ха, характеризующимся практическим отсутствием антифактор-IIа активностью.
Пример 3. Приготовление композиции для подкожного введения, содержащей заявленное средство.
В 40 мл воды для инъекций вносят при перемешивании 9,97 г заявленного средства с содержанием фракций с молекулярной массой менее 2000Да - 30%, содержанием фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000Да - 65%, содержанием фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - 5%о и имеющего анти-Ха активность 60,2 МЕ/мг, перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре до полного растворения и измеряют рН. При необходимости доводят рН до значения 6,5 медленным добавлением 1М раствора кислоты хлористоводородной или 0,1% раствора гидроксида натрия и после этого доводят объем раствора водой для инъекций до 50 мл. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану с размером пор 0,2 мкм, разливают в ампулы по 0,3 мл и герметично запаивают. Измеряют анти-фактор-Ха активность полученной композиции. Активность полученной композиции для подкожного и внутрикожного введения составляет 12000 ЕД/мл.
Пример 4.
Приготовление композиции для подкожного введения, содержащей заявленное средство.
В 60 мл воды для инъекций вносят при перемешивании 15,0 г заявленного средства с содержанием фракций с молекулярной массой менее 2000Да - 50%, содержанием фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000Да - 40%, содержанием фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - 10% и имеющего анти-Ха активность 240 МЕ/мг, перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре до полного растворения и измеряют рН. При необходимости доводят рН до значения 6,8 медленным добавлением 1М раствора кислоты хлористоводородной или 0,1%) раствора гидроксида натрия и после этого доводят объем раствора водой для инъекций до 50 мл. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану с размером пор 0,2 мкм, разливают в ампулы по 0,3 мл и герметично запаивают. Измеряют анти-фактор-Ха активность полученной композиции. Активность полученной композиции для подкожного и внутрикожного введения составляет 12000 ЕД/мл.
Пример 5. Приготовление композиции для внутривенного введения, содержащей заявленное средство.
В 800 мл воды для инъекций растворяют при перемешивании 9,0 г натрия хлорида фармакопейного качества, затем в полученный раствор вносят при перемешивании 3,99 г заявленного средства с содержанием фракций с молекулярной массой менее 2000Да - 30%, содержанием фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000Да - 65%, содержанием фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - 5% и имеющего анти-Ха активность 60,2 МЕ/мг, перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре до полного растворения и измеряют рН. При необходимости доводят рН до значения 7,0 медленным добавлением 1М раствора кислоты хлористоводородной или 0,1% раствора гидроксида натрия и после этого доводят объем раствора водой для инъекций до 1000 мл. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану с размером пор 0,2 мкм, разливают в стеклянные флаконы вместимостью 100 мл, закрывают резиновой пробкой и закатывают. Измеряют анти-фактор-Ха активность полученной композиции. Активность полученной композиции для внутривенного введения составляет 12000 ЕД/мл.
Пример 6. Приготовление композиции для внутривенного введения, содержащей заявленное средство.
В 1000 мл воды для инъекций растворяют при перемешивании 11,25 г натрия хлорида фармакопейного качества, затем в полученный раствор вносят при перемешивании 5,0 г заявленного средства с содержанием фракций с молекулярной массой менее 2000Да - 50%, содержанием фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000Да - 40%, содержанием фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - 10% и имеющего анти-Ха активность 240 МЕ/мг, перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре до полного растворения и измеряют рН. При необходимости доводят рН до значения 7,1 медленным добавлением 1М раствора кислоты хлористоводородной или 0,1%) раствора гидроксида натрия и после этого доводят объем раствора водой для инъекций до 1000 мл. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану с размером пор 0,2 мкм, разливают в стеклянные флаконы вместимостью 100 мл, закрывают резиновой пробкой и закатывают. Измеряют анти-фактор-Ха активность полученной композиции. Активность полученной композиции для внутривенного введения составляет 12000 ЕД/мл.
Пример 7. Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при внутривенном введении
Оценку антитромботической активности заявляемого средства проводили на модели венозного стаза у крыс-самцов линии Wistar, согласно «Руководству по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н.
Наркотизированным животным (нембутал, 40 мг/кг, внутрибрюшинно) в левую яремную вену вводили заявляемую композицию, содержащую 17% заявленного средства в дозе 60 МЕ/кг. Контрольным животным введен 0,9% раствор NaCl в эквивалентном объеме. С целью подавления защитной реакции противосвертывающей системы в эту же вену введен раствор атропина сульфата в дозе 5 мг/кг. Для активации тромбоза через 15 минут после введения заявленного средства или 0,9% раствора NaCl вводят активированную стеклом сыворотку человека (0,75 мл/кг). Затем перевязывают нитью участок вены (0,7 см), который не использован для введения веществ (яремная вена с противоположной стороны).
Эффективность антитромботической активности оценивали:
1) по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены,
2) по весу влажного тромба на аналитических весах.
Вводимое заявляемое средство показало выраженный антитромботический эффект, а именно - вес образовавшегося тромба в присутствии заявляемого средства почти в 6 раз меньше, чем в контроле.
При осмотре гематомы и/или экхимоза в месте инъекции не обнаружено, также отсутствует кровоточивость слизистых оболочек, что свидетельствует о низком геморрагическом эффекте.
Пример 8. Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при внутривенном введении.
Оценку антитромботической активности заявляемого средства проводили на модели венозного стаза у крыс-самцов линии Wistar, согласно «Руководству по доклиническому исследованию лекарственных средств» под редакцией Миронова А.Н.
Наркотизированным животным (нембутал, 40 мг/кг, внутрибрюшинно) в левую яремную вену вводили заявляемую композицию, содержащую 24% заявленного средства в дозе 240 МЕ/кг. Контрольным животным введен 0,9% раствор NaCl в эквивалентном объеме. С целью подавления защитной реакции противосвертывающей системы в эту же вену введен раствор атропина сульфата в дозе 5 мг/кг. Для активации тромбоза через 15 минут после введения заявленного средства или 0,9% раствора NaCl вводят активированную стеклом сыворотку человека (0,75 мл/кг). Затем перевязывают нитью участок вены (0,7 см), который не использован для введения веществ (яремная вена с противоположной стороны).
Эффективность антитромботической активности оценивали:
1) по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены,
2) по весу влажного тромба на аналитических весах.
Вводимое заявляемое средство показало выраженный антитромботический эффект, а именно - вес образовавшегося тромба в присутствии заявляемого средства в 6,5 раз меньше, чем в контроле.
При осмотре гематомы и/или экхимоза в месте инъекции не обнаружено, также отсутствует кровоточивость слизистых оболочек, что свидетельствует о низком геморрагическом эффекте.
Пример 9. Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при подкожном введении
Исследования in vivo проведены на беспородных кроликах массой 4-5 кг. Для изучения антикоагулянтного эффекта композицию, содержащую 17% заявляемого средства с активностью 12000 МЕ/мл вводили подкожно в дозе 30 МЕ/кг. Объем введения композиции для одного кролика составлял 20-25 мкл.
Забор крови производили до введения заявляемого средства и через 30, 60 и 120 мин после него. Из краевой вены уха отбирали 2 мл крови, стабилизировали 0,2 мл 3,8%ного раствора цитрата натрия.
Изучение времени свертывания крови проводилось с помощью коагулометра «Минилаб 701». В кювету помещали 100 мкл крови и добавляли 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия. Пробы инкубировали в течение 60 с, затем добавляли 100 мкл 1% раствора хлорида кальция и приступали к измерению времени свертывания крови.
Полученные результаты показали, что при подкожном введении заявляемое средство быстро всасывается, и максимальное снижение свертываемости отмечается уже через 30 мин после введения. Активность заявляемого средства сохранялась около 2 ч.
При осмотре гематомы и/или экхимоза в месте инъекции не обнаружено, что свидетельствует о низком геморрагическом эффекте.
Пример 10. Оценка антикоагулянтного действия заявляемого лекарственного средства in vivo при подкожном введении
Исследования in vivo проведены на беспородных кроликах массой 4-5 кг. Для изучения антикоагулянтного эффекта композицию, содержащую 24% заявляемого средства с активностью 12000 МЕ/мл вводили подкожно в дозе 240 МЕ/кг.
Забор крови производили до введения заявляемого средства и через 30, 60 и 120 мин после него. Из краевой вены уха отбирали 2 мл крови, стабилизировали 0,2 мл 3,8%ного раствора цитрата натрия.
Изучение времени свертывания крови проводилось с помощью коагулометра «Минилаб 701». В кювету помещали 100 мкл крови и добавляли 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия. Пробы инкубировали в течение 60 с, затем добавляли 100 мкл 1% раствора хлорида кальция и приступали к измерению времени свертывания крови.
Полученные результаты показали, что при подкожном введении заявляемое средство быстро всасывается, и максимальное снижение свертываемости отмечается уже через 25 мин после введения. Активность заявляемого средства сохранялась около 2 ч.
При осмотре гематомы и/или экхимоза в месте инъекции не обнаружено, что свидетельствует о низком геморрагическом эффекте.
Таким образом нами разработано средство и способ его применения обладающее выраженным избирательным действием в отношении ФСК Ха, характеризующимся практическим отсутствием антифактор-IIа активностью и, вследствие этого, низким геморрагическим эффектом
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА | 2016 |
|
RU2639574C2 |
Способ получения надропарина кальция | 2020 |
|
RU2753678C1 |
НЕАНТИКОАГУЛЯНТНЫЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ДИСАХАРИДНЫЕ ЗВЕНЬЯ, И ИХ МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2617764C2 |
КОМПОЗИЦИИ ГЕПАРИНА НИЗКОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2007 |
|
RU2451515C2 |
ОЧИЩЕННАЯ ГЕПАРИНОВАЯ ФРАКЦИЯ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СОДЕРЖАЩАЯ ЕЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1994 |
|
RU2133253C1 |
ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИСАХАРИДОВ С ВЫСОКОЙ АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ПЛАЗМЕ | 2004 |
|
RU2361881C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА | 2007 |
|
RU2377993C2 |
ТВЕРДАЯ ПЕРОРАЛЬНАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА, СОДЕРЖАЩАЯ УСИЛИТЕЛЬ | 2007 |
|
RU2437662C2 |
Вещество 4-амино-1-{ 2-[3-метил-5-(бензолсульфонилокси)фенокси] этил} -пиридиний хлорид, обладающее свойствами биологически активного агента, влияющими на естественно текущие процессы свертываемости крови млекопитающих, антикоагулянт на его основе и способ его получения путем химического синтеза | 2018 |
|
RU2685261C1 |
СРЕДСТВО С АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2016 |
|
RU2627435C1 |
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к средству, обладающему антикоагулянтным действием, и к способу лечения состояний, связанных с нарушением работы системы гемостаза. Средство, обладающее антикоагулянтным действием, содержащее в качестве активного вещества фракции ультранизкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 1700-2600 Да при следующем молекулярно-массовом распределении: содержание фракций с молекулярной массой менее 2000 Да - 30-50%; содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000 Да - 40-70%; содержание фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000 Да - не более 10%. Способ лечения состояний, связанных с нарушением работы системы гемостаза, включающий введение вышеуказанного средства. Вышеуказанная группа изобретений позволяет расширить спектр антикоагулянтных средств, обладающих выраженным избирательным действием в отношении ФСК Xа, характеризующимся практическим отсутствием антифактор-IIа активности и низким геморрагическим эффектом. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 10 пр.
1. Средство, обладающее антикоагулянтным действием, содержащее в качестве активного вещества фракции ультранизкомолекулярного гепарина со средней молекулярной массой 1700-2600 Да при следующем молекулярно-массовом распределении:
содержание фракций с молекулярной массой менее 2000да - 30-50%;
содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000да - 40-70%;
содержание фракций с молекулярной массой от 4000 до 8000Да - не более 10%.
2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что содержит фракции в качестве активного вещества в количестве 12000 МЕ/мл.
3. Средство по п. 1, отличающееся тем, что содержит фракции в качестве активного вещества в количестве 17-24 масс. % и воду для инъекций - до 100 масс %.
4. Способ лечения состояний, связанных с нарушением работы системы гемостаза, включающий введение средства по п. 1 в эффективном количестве.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что осуществляют введение средства по п. 1 в дозе 30-240 МЕ/кг.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что введение средства осуществляют внутривенно или подкожно.
RICO, S., et al | |||
Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
КОМПОЗИЦИИ ГЕПАРИНА НИЗКОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2007 |
|
RU2451515C2 |
DE 3851973 T2, 08.06.1995 | |||
AU 2005298641 A1, 04.05.2006 | |||
ПРИБОР ДЛЯ ВЫЧЕРЧИВАНИЯ ТЯГОВЫХ КРИВЫХ | 1916 |
|
SU3500A1 |
Раствор для инъекций |
Авторы
Даты
2023-07-03—Публикация
2021-10-15—Подача