НЕАНТИКОАГУЛЯНТНЫЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ДИСАХАРИДНЫЕ ЗВЕНЬЯ, И ИХ МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2017 года по МПК C08B37/10 A61K31/727 A61P15/04 

Область изобретения, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым модифицированным гликозаминогликанам с низкой антикоагулянтной активностью, а также к способу их получения. Способ получения специально приспособлен для получения модифицированных гепаринов и гепаринсульфатов, обладающих высокой биодоступностью, например, после парентеральной инъекции, и высокой структурной стабильностью, обеспечивающей возможность хранения и их подходящие для работы свойства.

Уровень техники

Гепарин - полидисперсный натуральный полисахарид, подавляющий свертывание крови - процесс, в результате которого развивается тромбоз. Гепарин состоит из неразветвленных полисахаридных цепей, имеющих различную длину и молекулярный вес. Полисахаридные цепи с молекулярным весом от 5000 до более 40000 дальтон образуют фармацевтический гепарин.

Гепарин, полученный из природных источников, главным образом из свиного кишечника и бычьих легких, можно вводить в терапевтических целях при тромбозах. Однако эффект нефракционированного гепарина (далее просто гепарин) труднопредсказуем. При лечении тромбоза гепарином необходимо тщательно контролировать показатели свертывания крови во избежание гипер- или гипокоагуляции.

В настоящее время доступны для применения многочисленные препараты нефракционированного и низкомолекулярного гепарина (НМГ), например дальтепарин и эноксапарин, предназначенные для применения в лечении, основанном на антикоагулянтной активности. Многочисленные исследования, проведенные in vitro и на животных, и даже клинические испытания показывают, что гепарин и его производные, помимо антикоагулянтного свойства, обладают и другими благоприятными свойствами. Однако имеющиеся препараты нефракционированного и низкомолекулярного гепарина непригодны для лечения других состояний из-за риска вызвать кровотечение, обусловленного антикоагулянтным эффектом. Хотя НМГ имеет существенные клинические преимущества перед гепарином, он, тем не менее, сохраняет высокую антикоагулянтную активность, которая может вызвать опасные для жизни побочные эффекты.

Поскольку НМГ можно вводить подкожно, то нет необходимости в мониторинге активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), что дает возможность применять его в амбулаторных условиях для лечения больных с тромбозом или тромбоэмболией легочной артерии, которых раньше для лечения гепарином надо было госпитализировать.

Было показано, что у женщин, которые с целью профилактики тромбоза глубоких вен получают НМГ дальтепарин, затяжные роды случаются реже. Этот эффект объясняют тем, что дальтепарин повышает уровень интерлейкинов, вызывая благоприятную воспалительную реакцию, которая способствует созреванию шейки матки. Кроме того, было показано, что дальтепарин повышает сократительную способность матки (Acta Obstétrica et Gynecologies 2010; 89:147-150).

Однако гепарин и НМГ не подходят для профилактики и лечения таких заболеваний по целому ряду причин. Во-первых, как известно, НМГ оказывает выраженный антикоагулянтный эффект, что ограничивает его применение в поздние сроки беременности и во время родов как для профилактики, так и для и лечения острых заболеваний из-за высокого риска начала кровотечения. Так, применение дальтепарина строго противопоказано при выполнении эпидуральной анестезии, к которой нередко прибегают для обезболивания родов. Во-вторых, гепарин может вызвать тромбоцитопению, тяжелую иммунную реакцию, которая может возникнуть у пациента, получающего гепарин. Это тяжелое протромботическое состояние, вызываемое гепарин-зависимыми антителами, которые образуются либо спустя 5 суток после введения гепарина, либо после введение его пациенту, который ранее уже получал гепарин. Другим побочным эффектом, который может развиться при длительном применении гепарина, является деминерализация костей и развитие остеопороза.

Предпринималось множество попыток устранить или уменьшить антикоагулянтную активность гепаринов или НМГ для получения гепаринов со слабым антикоагулянтным эффектом, которые оказывают другие благоприятные клинические эффекты, присущие гепариновым цепям, без неоправданного риска, главным образом гепарин-ассоциированного кровотечения. Однако опыт клинического применения таких гепаринов ограничен и пока они не разрешены для применения в клинике.

В Европейском патенте EP 1053049 описан продукт, полученный из гепарина путем его ферментативного расщепления или окисления, оказывающий слабый антикоагулянтный эффект, имеющий средний молекулярный вес от 9 до 13 кДа и предложенный для лечения нейродегенеративных заболеваний.

В патенте США 4,990,502 описан способ обработки нативного гепарина, заключающийся в расщеплении пентасахаридных остатков, ответственных за антикоагулянтный эффект, и последующей деполимеризации, в результате которой образуется низкомолекулярный гепарин со слабой антикоагулянтной активностью, имеющий средний молекулярный вес от 5,8 до 7,0 кДа. В US 4,990,502 для прекращения процесса окисления используются трудоемкие способы, такие как диализ длительностью 15 часов. Такие процессы могут влиять на распределение молекулярного веса конечного продукта. Контроль молекулярного веса и длины полисахаридных цепей имеет решающее значение для получения соединений с желаемым биологическим эффектом.

Биодоступность гепаринов с длинной цепью после подкожной инъекции низка и, кроме того, существует положительная корреляция между вероятностью развития гепариновой тромбоцитопении и длиной цепи гепаринов. Для ослабления этих нежелательных клинически значимых свойств производное гепарина должно иметь неполную длину цепи. Гепариновые цепи с определенным молекулярным весом можно получить путем фракционирования стандартного гепарина. Однако способы фракционирования, такие, как гель-фильтрация, осаждение спиртом и ионообменная хроматография, для получения производных гепарина с промежуточным или низким молекулярным весом связаны со значительным расходом высокомолекулярного гепарина как исходного материала и потому не используются.

В настоящем изобретении, раскрытом в последующих разделах, описан новый способ, отличающийся тем, что полисахаридные цепи укорачиваются и достигается подходящее распределение по молекулярному весу, чем обеспечивается желаемый клинический эффект, снижение риска, ассоциированного с особенно длинными полисахаридными цепями, и минимальная потеря исходного материала.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 приведена схема синтеза гепарина по изобретению с низкой антикоагулянтной активностью.

На фиг. 2 приведены результаты исследования стабильности лекарственного вещества.

На фиг. 3 приведены результаты исследования стабильности лекарственного продукта.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к химически модифицированным гликозаминогликанам, выбираемым из гепаринов и гепарансульфатов, обладающих активностью антифактора Па менее 10 МЕ/мг, активностью антифактора Xa менее 10 МЕ/мг и имеющих молекулярный вес (средневесовая молекулярная масса Mw) от 4,6 до 6,9 кДа, которые отличаются тем, что:

- полисахаридные цепи имеют от 2 до 20 (n в формуле I) дисахаридных звеньев, молекулярный вес которых соответствует диапазону от 1,2 до 12 кДа;

- превалирующим сахаридом является (формула I)

в которой

n является целым числом от 2 до 20.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению упомянутых гликозаминогликанов и способу их получения.

Подробное описание изобретения

В целом, настоящее изобретение относится к химически модифицированным гепаринам и гепарансульфатам, которые избирательно сохраняют терапевтическую активность полисахаридных цепей и оптимальное распределение полисахаридных цепей по размеру, обеспечивающее высокую биодоступность и стабильность и, в то же время, слабую антикоагулянтную активность, по существу устраняющую риск кровотечения.

Настоящее изобретение также относится к разработке высокопродуктивного способа получения в большом количестве рыночного продукта с низкой себестоимостью. Как стоимость продукта, так и доступность исходных материалов становятся важными факторами при получении лекарств. Возможность модификации нефракционированных гепаринов в фармакологически приемлемые производные с благоприятным распределением цепей по длине дает возможность парентерального введения и достижения высокой биодоступности. Кроме того, такая модификация позволяет осуществлять лечение во внебольничных условиях, например самолечение, что является положительным качеством с социально-экономической точки зрения.

При общем или детальном описании изобретения, а также при описании экспериментов использован ряд терминов и определений.

Следует отметить, что в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа охватывают также множество объектов, если из контекста не явствует иное.

Слово «около», используемое в тексте, обозначает отклонение в пределах ±2% от указанного значения, предпочтительно ±5% и особенно предпочтительно ±10% от численного значения, где это возможно.

Гепарин это натуральный гликозаминогликан, который синтезируется и хранится у человека и животных так называемыми тучными клетками. Гепарин, получаемый в промышленном масштабе из слизистой оболочки кишечника свиньи, оказывает сильное антикоагулянтное действие и применяется в клинике уже более 60 лет как препарат выбора при лечении тромбоэмболических осложнений. Серьезным побочным эффектом, который возможен при лечении гепарином, является кровотечение, связанное с антикоагулянтным свойством этого препарата.

Гепарин представляет собой полидисперсную систему и содержит молекулы полисахаридов с молекулярным весом от 5 до 40 кДа, в среднем от 15 до 18 кДа.

Низкомолекулярные гепарины (НМГ) в соответствии с Европейской фармакопеей определены как «соли сульфатированных гликозаминогликанов, имеющих среднюю молекулярную массу 8 кДа, в которых по меньшей мере 60% общей массы имеет молекулярную массу менее 8 кДа. Они имеют различную химическую структуру восстанавливающего и невосстанавливающего конца полисахаридных цепей. Антикоагулянтная активность составляет не менее 70 ME активности антифактора Xa на 1 мг сухого вещества. Отношение активности антифактора Xa к активности антифактора IIa равно не менее 1,5. Низкомолекулярные гепарины, применяемые в клинике, имеют молекулярный вес в диапазоне от 3 до 15 кДА, в среднем около 4-7 кДа. Низкомолекулярные гепарины, получаемые путем контролируемой деполимеризации гепарина, обладают более ценными фармакологическими и фармакокинетическими свойствами по сравнению с нефракционированным гепарином включая и менее выраженную способность вызывать кровотечение, более высокую биодоступность и более длительный период полураспада после подкожного введения.

Гепарансульфат - линейный полисахарид, который в целом менее сульфатирован, чем гепарин и может быть получен из слизистой оболочки кишечника свиньи или бычьих легких либо из побочных фракций гепарина путем фракционирования цетилпиридиния хлорида и последовательной экстракции с помощью расплава солей, описанного Fransson et al. в Structural studies on heparin sulfates, Eur. J. Biochem. 106, 59-69 (1980). Гепарансульфат содержит чередующиеся друг с другом глюкозамин и остатки уроновьгх кислот, которые образуют N-ацетилированные, N-сульфатированные или (в меньшей степени) N-незамещенные дисахаридные звенья, упорядоченные в основном в виде доменов. Однако антикоагулянтная активность некоторых гепарансульфатов по сравнению с гепарином в значительно меньшей степени зависит от конкретного антикоагулянтного пентасахарида.

Гепарин оказывает антикоагулянтный эффект в основном в результате связывания и активации ингибитора сериновой протеазы, антитромбина (AT). Антитромбин является важным физиологическим ингибитором свертывания крови, нейтрализует активированные факторы свертывания, образуя с ними стабильный комплекс. Связывание с конкретным пентасахаридом в полисахаридных цепях гепарина приводит к конформационному изменению антитромбина, что резко повышает скорость ингибирования факторов коагуляции, тем самым препятствуя свертыванию крови и образованию кровяных сгустков.

Для связывания с антитромбином существенное значение имеет уникальная специфическая пентасахаридная последовательность, распределенная произвольно в полимерах гепарина. Было показано, что для взаимодействия гепарина с антитромбином крайне важны ряд структурных особенностей этой последовательности. В этой пентасахаридной последовательности, в частности, присутствуют остатки идуроновой кислоты, которые расположены в положении 2-го атома углерода, а гидроксильные группы при 2-м и 3-м атомах углерода глюкуроновой кислоты являются незамещенными (формула II).

Структурные варианты, сохраняющие антикоагулянтную активность, включают варианты не с N-сульфатированным, а N-ацетилированным глюкозамином у невосстанавливающего конца и с незамещенной C₆-гидроксильной, а не с 6-O-сульфатированной группой у двух других остатков глюкозамина.

Используя способ по изобретению, можно воспрепятствовать взаимодействию с антитромбином и тем самым существенно уменьшить антикоагулянтную активность.

В контексте настоящего изобретения антикоагулянтная активность гликозаминогликана, проявляющаяся клинически, связана с потенцированием ингибирования факторов свертывания Xa и IIa (тромбин) антитромбином. В одном варианте осуществления изобретения у химически модифицированных гликозаминогликанов по изобретению по существу отсутствует антикоагулянтная активность.

В процессе получения гепарина со слабой антикоагулянтной активностью важно избежать или не допустить неспецифическую деполимеризацию, то есть деполимеризацию, не связанную с предсказуемыми результатами гидролиза и β-элиминирования, инициируемого основанием, которые собственно, и являются деполимеризацией. Неспецифическая деполимеризация может привести к непредсказуемому уменьшению молекулярного веса, образованию окрашенных продуктов (с нестабильными показателями поглощения света), изменению стабильности и появлению неидентифицированных остатков и остатков, которые не соответствуют тем, которые соответствуют обработке гепарина или низкомолекулярных гепаринов. Продукты, подвергнутые неспецифической деполимеризации, могут вызвать неблагоприятное или нестабильное распределение молекулярного веса полисахаридов.

Одним важным аспектом настоящего изобретения является контроль деполимеризации для получения продукта с оптимальным распределением цепи и благоприятными параметрами стабильности. В одном аспекте деполимеризация контролируется путем регулирования условий, при которых допускается перйодирование, а также вытекающее из него йодирование для окисления гепарина. Способ по изобретению был оптимизирован для сведения к минимуму неспецифической деполимеризации, которая неблагоприятно сказывается на распределении и стабильности цепей.

В контексте приводимого далее описания следует определить и другие термины.

Один аспект настоящего изобретения касается способа получения химически модифицированных гликозаминогликанов, выбираемых из гепаринов и гепарансульфатов, обладающих активностью антифактора Па менее 10 МЕ/мг и активностью антифактора Xa менее 10 МЕ/мг и имеющих средний молекулярный вес (средневесовая молекулярная масса Mw) от около 4,6 до около 6,9 кДа. Этот способ обычно включает селективное окисление нефракционированного гепарина или гепарансульфата, присутствующего в водном растворе, путем воздействия на них окисляющими агентами, способными окислить несульфатированные уроновые кислоты, и восстановление образующихся окисленных сахаридов. Способ обычно включает также деполимеризацию цепей гепарина путем щелочного гидролиза.

В одном аспекте способ по изобретению включает:

- окисление глюкуроновой и идуроновой кислот путем обработки периодатом,

- элиминирование или сведение к минимуму эффектов окисляющих йодсодержащих соединений,

- деполимеризацию полисахаридных цепей в основных условиях (процесс β-элиминирования) и

- восстановление и стабилизацию концевых альдегидных групп в реакции с восстанавливающим агентом, например борогидридом натрия NaBH₄.

В другом аспекте способ по изобретению включает одну или более из следующих стадий:

- окончательная очистка продукта путем удаления бората (окисленного NaBH₄), удаление мелких фрагментов гликозаминогликанов, добавление противоионов и выделение продукта в твердой форме,

- высушивание продукта путем нагревания в вакууме или лиофилизации, чтобы продукт можно было хранить в течение длительного времени,

- растворение продукта и приготовление композиции в водном фосфатно-буферном растворе, доведение pH раствора до 6-8. Добавление эксципиента для коррекции тоничности раствора,

- разливка продукта во флаконы или в шприцы либо лиофилизация в стерильных условиях.

В одном аспекте изобретения способ по изобретению включает последовательное осуществление окисления, деполимеризации с гидролизом и восстановления и, в частности включает следующие стадии:

a) окисление глюкуроновой и идуроновой кислот путем обработки периодатом,

b) элиминирование или сведение к минимуму эффектов окисляющих йодсодержащих соединений,

c) деполимеризация полисахаридных цепей в основных условиях (процесс β-элиминирования) и

d) восстановление и стабилизация концевых альдегидных групп в реакции с восстанавливающим агентом, таким как NaBH₄.

Другой вариант настоящего изобретения состоит в том, что способ включает также одну или более из следующих стадий:

e) окончательная очистка продукта путем удаления бората (окисленного NaBH₄), удаления мелких фрагментов гликозаминогликанов, добавление противоионов и выделение продукта в твердой форме,

f) высушивание продукта нагреванием под вакуумом или лиофилизацией, чтобы его можно было хранить в течение длительного времени,

g) растворение продукта и приготовление композиции в водном фосфатно-буферном растворе, доведение pH раствора до 6-8. Добавление эксципиента для коррекции тоничности раствора,

h) разливка продукта во флаконы или в шприцы либо лиофилизация в стерильных условиях.

Одна из особенностей способа по изобретению состоит в том, что химически модифицированным гликозаминогликаном является нефракционированный гепарин и что несульфатированную идуроновую и/или несульфатированную глюкуроновую кислоту селективно окисляют, ингибируя тем самым антикоагулянтный эффект, опосредуемый взаимодействием между антитромбином ATIII и специфическим пентасахаридом. Окисление расщепляет несульфатированную уроновую кислоту с двумя смежными гидроксильными группами при углеродных атомах C2 и C3 в молекуле пентасахарида, ответственного за связывание с антитромбином.

В качестве одного из примеров, которым, однако, не ограничивается изобретение, композицию нефракционированного гепарина обрабатывают деионизированной водой и метапериодатом натрия в подходящих пропорциях. Можно использовать и другие окисляющие агенты, если они оказывают такое же влияние на эффективность окисления и на несульфатированные остатки, не влияя на другие структуры или на стабильность конечного продукта.

Другая особенность способа по изобретению состоит в том, что химически модифицированный гликозаминогликан по изобретению содержит остатки расщепленного гликоля с химической структурой (формула III):

Остатки расщепленного гликоля появляются в полисахаридных цепях химически модифицированных гепаринов в результате окислительно-восстановительных процессов, о чем ранее говорилось в контексте описываемого способа и специфической стадии гидролиза. Изображенный выше остаток расщепленного гликоля получают при окислении и восстановлении несульфатированной идуроновой и глюкуроновой кислоты.

Чтобы достичь полного окисления стадию окисления предпочтительно осуществляют при температуре выше 10°C, предпочтительно около 15±2°C и в течение по меньшей мере 15 часов, предпочтительно около 18-24 часов.

В одном варианте осуществления изобретения окисление периодатом осуществляют в растворе с исходной концентрацией гликозаминогликана (например, гепарина) около 10-20 мас. %, предпочтительно около 15 мас. %. Высокая концентрация исходного материала способствует экономии, так как стадии осаждения, которые следуют после этого, напрямую зависят от отношения объем растворителя/объем продукта.

В конкретном примере осуществления изобретения стадию окисления осуществляют добавлением метаперйодата при температуре около 15±2°C при концентрации гликозаминогликана (например, гепарина или гепарансульфата) около 15 мас. % и pH реакционной среды около 5 в течение около 18-24 часов.

Применение нефракционированного гепарина в описываемом способе является в целом выгодным для изобретения, так как это способствует уменьшению расхода материала и повышению эффективности затрат, позволяет получить продукт, имеющий полисахаридную цепь средней длины и достичь приемлемого уровня биодоступности.

После окисления периодатом способы по изобретению могут включать также по меньшей мере одну стадию прекращения окисления и элиминирования остающегося окисляющего агента. По меньшей мере одна стадия элиминирования включает удаление восстановленных форм окисляющего агента. В этом контексте восстановленные формы означают окисляемый агент, превращенный в его восстановленную форму и способствующий окислению целевых сахаридных остатков в гликозаминогликаны по изобретению. В этом контексте восстановительная стадия может включать добавление восстанавливающего агента, который, помимо восстановления окисленного гликозаминогликана, способствует исчерпанию (восстановлению) остающегося окисляющего агента.

Настоящее изобретение в целом направлено на способ, включающий стадии селективного окисления нефракционированных гликозаминогликанов, таких как гепарин или гепарансульфат, путем воздействия на них окисляющего агента, способного окислять несульфатированные сахариды; элиминирования остающегося окисляющего агента и восстановленных форм окисляющего агента; и деполимеризации цепей гликозаминогликана под действием основания. Для указанных целей стадия элиминирования может включать в себя добавление спирта, например водного спирта, в количестве, достаточном для осаждения химически модифицированного гликозаминогликана. Этим спиртом может быть метанол, пропанол, этанол или аналогичные спирты и он может вызвать осаждение химически модифицированного гликозаминогликана, в то время как окисляющий агент и его восстановленные формы удаляют спиртом. Осаждение можно выполнять однократно или повторять один или более раз, чтобы оптимизировать процедуру удаления. Однако, однократное осуществление осаждения выгодно, так как на это уходит меньше времени и при этом уменьшается время взаимодействия между остаточными йодсодержащими соединениями и гликозаминогликаном.

Стадия элиминирования может также включать добавление гасящего агента, способного химически инактивировать окисляющий агент для предотвращения дальнейшего окисляющего воздействия на гликозаминогликан. Можно использовать любое гасящее вещество, имеющее две соседние (вицинальные) гидроксильные группы. Неограничивающими примерами подходящих гасителей являются этиленгликоль и глицерин. Добавляя гаситель, содержащий соседние дигидроксильные группы, периодат в самом конце стадии окисления превращают в более безвредное вещество йодат.

В целом, считается, что описанная стадия или стадии элиминирования способствуют противодействию неспецифической деполимеризации гликозаминогликана или сведению ее к минимуму, то есть противодействуют эффектам деполимеризации, отличающейся от процесса щелочной деполимеризации с ее предсказуемыми результатами. Как было упомянуто выше, неспецифическая деполимеризация может вызвать непредсказуемое уменьшение молекулярного веса, изменение цвета продуктов (с повышенной поглощающей способностью при хранении), нарушение стабильности и появление неидентифицированных остатков, появление которых в гликозаминогликанах, в частности гепарине и низкомолекулярных гепаринах, не ожидалось.

Введение стадии элиминирования позволяет лучше контролировать неспецифическую деполимеризацию. Другой путь уменьшения неспецифической деполимеризации, применимый в описанном выше способе, состоит в значительном снижении температуры до уровня ниже температуры окружающей среды (комнатной температуры) во время предшествующей стадии или стадий осаждения при добавлении спирта. Например, температуру можно снизить до около 5°C, чтобы предупредить нежелательные реакции, вызывающие неспецифическую деполяризацию.

В альтернативном варианте стадии процесса a), b), c) и d) осуществляют в одной прямой последовательности, предпочтительно без какой-либо задержки. Под выражением «в прямой последовательности» в данном контексте авторы имеют в виду, что стадии осуществляются без какой-либо промежуточной стадии осаждения. Особенно важно сократить до минимума время от момента окончания стадии окисления до начала стадии восстановления.

В одном аспекте изобретения стадии процесса a), b), c) и d) осуществляют в одной прямой последовательности, предпочтительно без какой-либо задержки. Под выражением «в прямой последовательности» в данном контексте означает, что стадии осуществляют без какой-либо промежуточной стадии осаждения. В данном аспекте стадия элиминирования или сведения к минимуму эффектов окисляющих йодных соединений включает уменьшение времени воздействия любых остаточных окисляющих йодных соединений, которые могут оказать неконтролируемое химическое воздействие на полисахариды в период между прекращением стадии селективного окисления и началом восстановительной стадии.

Поэтому отличительная особенность данного изобретения состоит в сокращении до минимума времени, которое проходит от конца стадии окисления до начала стадии восстановления, то есть от начала деполимеризации (добавление основания) до добавления боргидрида. В одном аспекте изобретения время между окончанием стадии окисления и добавлением борогидрида составляет от около 1 часа до около 6 часов. В другом аспекте изобретения время между окончанием стадии окисления и добавлением борогидрида составляет не более чем около 5 часов, предпочтительно не более чем около 4 часов, более предпочтительно не более чем около 3 часов и наиболее предпочтительно не более чем 2 часа. Минимальное время, которое для этого необходимо, определяется динамикой деполимеризации, которую регулируют, изменяя pH реакционной среды. В одном аспекте изобретения необходимое минимальное время составляет около 1 часа. Более низкий pH, как в примере 3, обусловливает наиболее длительное время и, наоборот, при высоком pH это время короткое. Предпочтительно, чтобы все три стадии были осуществлены в одном и том же контейнере. Преимуществом такого варианта является уменьшение времени экспозиции гепарина или гепарансульфата действию йодсодержащих соединений от момента окончания окисления периодатом до их элиминирования восстанавливающим борогидридом в восстановительной стадии. Добавление борогидрида сразу гасит остаточный периодат и превращает его в другие более безвредные для продукта инертные формы, такие как йодид и йод. Борогидрид следует добавить в таком количестве, чтобы эффективно погасить остаточное количество периодата и восстановить концевые альдегидные группы. Положительный эффект от подобного «укорочения» процесса приведен в табл. II и III.

После окончания стадии окисления полисахаридные цепи деполимеризуют под действием основания. Деполимеризацию предпочтительно осуществляют при температуре около 5-25°C для получения подходящих фракционированных цепей с желаемым молекулярным весом. pH реакционной среды в реакции деполимеризации равен 10-12. Это необходимо, чтобы сохранить 2-О-сульфатные группы остатков сульфатированной уроновой кислоты и предотвратить усиление желтого окрашивания продукта при повышении pH. Это влияет на срок хранения продукта, так как является показателем качества/стабильности продукта. Цвет является необходимой характеристикой показателя деградации. Предпочтительно, чтобы pH не достигал 13 (0,1 N NaOH или более высокой концентрации), так как это повышает риск десульфатации 2-О-сульфатированной уроновой кислоты и даже может вызвать изменение цвета продукта. Время реакции предпочтительно составляет 15-95 мин, что обусловлено достаточным расщеплением окисленных несульфатированных уроновых кислот.

Окисленные гликозаминогликаны затем обрабатывают восстанавливающим агентом, например борогидридом натрия, чтобы восстановить концевые альдегидные группы. Этот процесс предназначен для восстановления концевых альдегидных групп и превращения их в первичные спирты, так чтобы альдегиды невозможно было обнаружить с помощью, например, ¹³C ЯМР-спектроскопии. Столь высокая степень восстановления восстанавливающих концов, способствует высокой стабильности продукта, так как альдегиды по природе своей химически неустойчивы. Элиминирование альдегидов необходимо и потому, что они потенциально токсичны. Можно использовать и другие восстанавливающие агенты, если они способны так же, как борогидрид, обеспечить восстановление окисленных остатков глюкуроновой кислоты, не вызывая неоправданной модификации или разрушения сульфатных групп других сахаридов. Восстановленные цепи можно изолировать, например, путем осаждения спиртом.

Для облегчения выбора желаемых цепей способ может включать стадию обогащения производных гепарина или гепарансульфата полисахаридными цепями, имеющими молекулярный вес от более чем около 3 до около 12 кДа. Стадия обогащения обычно включает традиционные осаждение, хроматографию, фильтрацию или молекулярное просеивание, которые известны специалистам по производству биополимеров.

Условия осуществления стадии осаждения (концентрация продукта, концентрация органического растворителя, pH и дополнительные противоионы) оптимизируют для сохранения молекулярного веса полисахаридов более 3 кДа.

Авторы изобретения разработали новую высокопроизводительную методику, отличающуюся тем, что неспецифическую деполимеризацию сводят к минимуму. В одном аспекте изобретения происходит одновременное прекращение реакции окисления, удаление йодсодержащих соединений и осаждение модифицированных гепаринов или гепарансульфатов. Эта особенность методики является ее преимуществом, так как йодсодержащие соединения, которые могут оказаться вредными для продукта, остаются растворенными в водном растворе этанола, что дает возможность удалить их при осаждении. Этим данный способ отличается от ранее описанных, например, в патенте US 4,990,502, в котором используется диализ или ионообменная сорбция и которые являются трудоемкими. Диализ - чрезвычайно обременительный способ и потому используется редко. Он требует тщательного соблюдения чистоты, чтобы не произошло микробного загрязнения.

В одном аспекте изобретения от 4 до 15% полисахаридных цепей химически модифицированного гепарина имеют молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа.

В одном аспекте изобретения от 10 до 25% полисахаридных цепей химически модифицированного гепарина имеют молекулярную массу по меньшей мере 8 кДа.

В одном аспекте изобретения от 22 до 45% полисахаридных цепей химически модифицированного гепарина имеет молекулярную массу по меньшей мере 6 кДа.

В одном аспекте изобретения по меньшей мере 70% полисахаридных цепей химически модифицированного гепарина имеет молекулярную массу по меньшей мере 3 кДа.

При осуществлении стадий способа по изобретению распределение гепарина со слабой антикоагулянтной активностью и полисахарида по молекулярному весу соответствует приведенному в таблице 1.

Соответствующие значения средневесового молекулярного веса Mw соответствует диапазону 4,6-6,9 кДа.

В одном аспекте изобретения химически модифицированный гликозаминогликан, прошедший упомянутые стадии способа, имеет низкое контролируемое содержание химически модифицированных остатков глюкозамина.

В одном аспекте изобретения химически модифицированные гликозаминогликаны включают в себя глюкозамины, представленные в виде сигналов в диапазоне от 5,0 до 6,5 ¹Н ЯМР-спектра с интенсивностью (отношение, %) менее 4% по сравнению с сигналом в области 5,42 м.д. в спектре нативного гепарина.

В одном аспекте изобретения такие сигналы от сигналов модифицированного гликозаминогликана представлены в области 6,15 м.д. и 5,95 м.д. ¹H ЯМР-спектра.

В одном аспекте изобретения гликозаминогликан содержит менее 1% модифицированных глюкозаминов от общего содержания глюкозамина. Такие модифицированные глюкозамины могут локализоваться на невосстанавливающих концах полисахаридных цепей и могут включать двойную связь при углеродных атомах C4-C5 в структуре остатка. Такие модифицированные гликозамины вызывают сигналы в области 5,95 м.д. и 6,15 м.д. ¹Н ЯМР-спектра.

Химически модифицированные глюкозамины образуются в результате модификации реакционноспособных глюкозаминовых остатков на стадиях способа получения и могут способствовать появлению рассмотренного выше феномена неспецифической деполимеризации и непредвиденных характеристик у продукта гликозаминогликана.

В одном аспекте изобретения описывается способ, который позволяет свести к минимуму как неспецифическую деполимеризацию, так и образование химически модифицированных глюкозаминов путем контроля взаимодействия гликозаминогликанов с агентами, участвующими в модификации глюказаминов.

Таким образом, способы по изобретению сводят к минимуму модификацию глюкозаминов с образованием непредсказуемых или неизвестных остатков на полисахаридных цепях. Тем самым, эти способы способствуют образованию подходящих продуктов, близких к гепарину или низкомолекулярному гепарину и удовлетворяющих критериям качества для гепарина, выдвинутым EDQM (European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare - Европейское управление по качеству медикаментов и здравоохранению), Совет Европы, 2012 (Н ЯМР-спектроскопический критерий приемлемости).

С этой целью один аспект способа по изобретению включает в себя стадию элиминирования и сведения к минимуму эффектов окисляющего агента, использованного для селективного окисления гликозаминогликана. Когда окисляющий агент является соединением периодата, стадия элиминирования включает удаление восстановленных форм окисляющего агента (йод со держащие соединения).

В одном аспекте изобретения стадия элиминирования или сведения к минимуму эффектов окисляющих йодсодержащих соединений может включать сокращение длительности воздействия окисляющего агента в промежутке между прекращением стадии окисления и началом восстановительной стадии.

Описанный способ, в целом, позволяет обогатить полисахаридные цепи с оптимальным распределением по размеру так, чтобы обеспечить продукт с желаемыми фармакологическими свойствами, свести к минимуму побочные эффекты, повысить биодоступность, устойчивость при обращении и хранении. Способ, соответственно, включает условия, которые обеспечивают полное окисление, а также способствуют образованию цепей с предпочтительным распределением по размеру, которые обеспечивают желаемую терапевтическую эффективность и повышают терапевтический индекс по сравнению с другими описанными гепаринами со слабой антикоагулянтной активностью. Вообще говоря, настоящее изобретение распространяется и на производные гликозаминогликана, полученные упомянутыми способами.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к химически модифицированным гепаринам или гепарансульфатам с активностью антифактора IIа менее 10 МЕ/мг, активностью антифактора Xa менее 10 МЕ/мг и средним молекулярным весом (Mw) от около 4,6 до около 6,9 кДа. Такие производные можно получать способами по изобретению. Химически модифицированные гепарины и гепарансульфаты по изобретению отличаются также тем, что:

- полисахаридные цепи в них имеют от 2 до 20 (n в формуле I) дисахаридных единиц с молекулярным весом от 1,2 до 12 кДа;

- предпочтительным дисахаридом в них является (формула I)

где

n является целым числом от 2 до 20.

Предпочтительный дисахарид имеет молекулярный вес около 600 Да. Под словом «предпочтительный» в данном контексте авторы имеют в виду «наиболее часто присутствующие» полисахаридные цепи.

Далее, в гликозаминогликанах, модифицированных по описанному выше способу по изобретению, полисахаридные цепи сохраняют по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и даже более предпочтительно все сульфатные группы соответствующего нативного гликозаминогликана. Другой отличительной особенностью является то, что полисахаридные цепи по существу не содержат химически интактных пентасахридных последовательностей, опосредующих антикоагулянтный эффект, по сравнению с цепями соответствующего нативного гликозаминогликана.

Далее, в модифицированных гликозаминогликанах по изобретению превалирующий размер цепей соответствует 6-12 дисахаридным звеньям с молекулярным весом 3,6-7,2 кДа. В данном контексте слово «предпочтительный» означает «наиболее часто присутствующие» полисахаридные цепи.

В одном аспекте изобретения химически модифицированный гликозаминогликан является по существу свободной интактной несульфатированной идуроновой и/или глюкуроновой кислотой. «Свободный» в данном контексте по существу означает недетектируемый в ¹³С ЯМР-спектре. В типичном случае предел детекции установлен на 0,1%.

Предпочтительно также, чтобы модифицированные гликозаминогликаны были производными гепарина и чтобы цепи по сравнению с цепями соответствующего нативного гепарина были по существу свободны от несульфатированной идуроновой и/или сульфатированной глюкуроновой кислот, предпочтительно D-глюкуроновой кислоты, и не содержали химически интактных пентасахаридов, опосредующих антикоагулянтный эффект.

Предпочтительно также, чтобы химически модифицированные гликозаминогликаны содержали цепи с восстанавливающими концевыми R', как показано на фиг. 1. Невосстанавливающие концы предпочтительно являются остатками сульфатированных глюкозаминов (GlcN).

Предпочтительно также, чтобы химически модифицированные гликозаминогликаны имели по меньшей мере 70% полисахаридных цепей с молекулярным весом более 3 кДа. Можно также, чтобы по меньшей мере 5%, предпочтительно менее 3% и более предпочтительно менее 1% полисахаридных цепей имели молекулярный вес более 15 кДа.

Предпочтительно, чтобы химически модифицированные сульфатированные гепарины по изобретению имели средний молекулярный вес, который оставался бы стабильным в течение по меньшей мере 36 мес при 5°C в водном фосфатно-буферном растворе, предпочтительно по меньшей мере 48 мес и более предпочтительно в течение по меньшей мере 60 мес. При хранении в форме порошка при 25°C средний молекулярный вес остается стабильным в течение по меньшей мере 5 лет. Дополнительные подробности о стабильности приведены в примере 2.

Настоящее изобретение относится также к химически модифицированным гликозаминогликанам, полученным описанным выше способом.

Настоящее изобретение далее относится к фармакологическим композициям, подходящим для лечения упомянутых ранее осложнений, и предпочтительным терапевтическим вариантам, включающим терапевтически эффективные количества описанных химически модифицированных гликозаминогликанов, и терапевтически приемлемого носителя. Такие композиции можно вводить системно парентеральным путем, например подкожным или внутривенным. Фармацевтические композиции можно также принимать внутрь. Для парентерального введения активные соединения можно включить в раствор или суспензию, которая также содержит один или более адъювант, например стерильные растворители, такие, как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты, буферы и агенты для коррекции осмоляльности. Препарат для парентерального введения можно распределить в ампулы, флаконы, разовые шприцы или инфузионные системы, в том числе и для самостоятельного введения.

Модифицированные гликозаминогликаны по изобретению адаптированы для подкожного введения и находятся в подходящих средствах для самостоятельного введения, например шприцах, так как имеют благоприятное распределение по молекулярному весу, позволяющее легко всасываться из подкожного депо, и таким образом похожи на коммерческий препарат низкомолекулярных гепаринов.

В результате благоприятного распределения по молекулярному весу модифицированные гликозаминогликаны по изобретению подходят для местного применения, в том числе на слизистых оболочках, включая, но не ограничиваясь только этим, слизистую оболочку влагалища, прямой кишки, матки, носа.

Настоящее изобретение также относится к описанным выше химически модифицированным гликозаминогликанам для медицинского применения, не связанного с антикоагулянтным эффектом.

Настоящее изобретение далее относится к применению химически модифицированного гликозаминогликана по изобретению для получения препарата, предназначенного для медицинского применения, не связанного с антикоагулянтным эффектом.

Примерами медицинского применения, которыми, однако, не исчерпывается настоящее изобретение, являются профилактика и лечение затянувшихся родов (дистопия) и потеря белка, например при синдроме Горема-Стаута. Потеря белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку наблюдается и при таких заболеваниях, как сепсис и энтеропатия с потерей белка. Химически модифицированные гликозаминогликаны по изобретению вводят больным в терапевтически эффективном количестве.

Низкомолекулярный гепарин и гепарин со слабой антикоагулянтной активностью усиливают индуцированную окситоцином сократительную деятельность матки как in vitro, так и in vivo при доношенной беременности у женщин. Добавление НМГ или гепарина со слабой антикоагулянтной активностью к культуре клеток шеечного эпителия, полученного с помощью биопсии шейки матки при влагалищных родах, вызывает усиление синтеза интерлейкина-6 и интерлейкина-8. Эти данные подтверждают эффект НМГ и гепарина со слабой антикоагулянтной активностью, проявляющийся в созревании шейки матки. Низкомолекулярный гепарин и гепарин со слабой антикоагулянтной активностью вызывают воспалительную реакцию в шейке матки, оказывая противовоспалительное действие на другие органы. Таким образом, химически модифицированные гликозаминогликаны по изобретению можно использовать в качестве средства для профилактики и лечения затянувшихся родов.

Было высказано предположение, что введение НМГ больному снижает способность белков проникать через клеточный барьер и поэтому может быть использовано для лечения или профилактики заболеваний, сопровождающихся потерей белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку. Далее полагают также, что гепарин со слабой антикоагулянтной активностью, как было описано выше, связывает факторы, такие, как цитокины и факторы роста (например, VEGF), и тем самым модулирует активность этих факторов. Другой подобный фактор, гепаринсвязьшающий протеин (HBP, азуроцидин), играет роль в потере белка через эндотелий и, как полагают в настоящее время, является высокоинформативным маркером ранней стадии сепсиса. Учитывая возможную роль гепаринсвязывающего протеина в патологическом ангиогенном процессе, например, при синдроме Горема-Стаута и при заболеваниях, сопровождающихся потерей белка, а также возможную потерю белка через эпителий кишечника при снижении содержания гепарансульфата, можно предположить, что введение гепарина со слабой антикоагулянтной активностью по изобретению в сочетании с традиционными средствами лечения окажет благоприятный эффект и что гепарин замедлит потерю белка (Acta Paediatrica2011 100, pp. 1448-1453).

В заключение отметим, что эффект химически модифицированных гликозаминогликанов по изобретению in vivo обусловлен подходящим распределением по молекулярному весу и сильно выраженными полианионными свойствами. Способ по изобретению был оптимизирован, расширен и приведен в соответствие с требованиями Надлежащей производственной практики (GMP), что позволяет вводить продукт человеку.

Далее изобретение описывается на примерах, которыми, оно, однако не ограничивается.

Примеры

Подробное описание процесса производства химически модифицированного гепарина по изобретению

Вещество получают из гепарината натрия. Получение включает селективное окисление остатков несульфатированной уроновой кислоты в гепарине периодатом включая глюкуроновую часть в пентасахаридной последовательности, связывающейся с антитромбином. Разрушение структуры этого остатка приводит к прекращению высоко-афинного взаимодействия с антитромбином и, следовательно, значительному ослаблению антикоагулянтного эффекта (о котором судят путем измерения активности антифактора Xa и антифактора IIa). Последующая обработка основанием, реакция β-элиминирования, приводит к расщеплению полимера на уровне несульфатированных глюкуроновых кислот, которые были окислены периодатом. Эти манипуляции в совокупности приводят к потере антикоагулянтной активности и адекватной деполимеризации цепи гепарина.

Восстанавливающий конец, образовавшийся в месте расщепления, восстанавливают с помощью NaBH₄, который превращает концевой альдегид в соответствующие более стабильные диолы. Затем удаляют добавки, примеси и побочные продукты путем повторных осаждений с этанолом, фильтрацией и центрифугированием. После этого получают вещество в форме порошка путем высушивания нагреванием под вакуумом. Лекарственное вещество растворяют в стерильном буферном растворе для получения лекарственного продукта, предназначенного для внутривенного и подкожного введения.

Описанный процесс обычно включает стадии окисления, расщепления полимера (гидролиз, инициируемый основанием) и восстановления. Процесс по изобретению разработан с целью воспрепятствовать неспецифической деполимеризации цепей гепарина или устранить возможность неспецифической деполимеризации. Под термином «неспецифический» в данном контексте понимается такая деполимеризация, которая не связана со специфической реакцией β-элиминирования, инициируемой основанием. Неспецифическая деполимеризация приводит к структурной нестабильности продукта, которая может привести к дальнейшей деполимеризации и изменению цвета в процессе хранения очищенного продукта. Кроме того, она вызывает атипичные изменения в ЯМР-спектре, которые в норме в ЯМР-спектре гепарина отсутствуют.

Описанный далее процесс вместе с примерами включает различные аспекты противодействия неспецифической деполимеризации или ее устранения.

Пример 1

Окисление (остатков) несульфатированной глюкуроновой и идуроновой кислот, деления пентасахарида, связывающегося с антитромбином и антикоагулянтная активность

Навеску гепарина около 3000 г растворяют в очищенной воде для получения 10-20% мас./об. раствора. pH раствора доводят до 4,5-5,5, затем в него добавляют метапериодат натрия (NaIO₄) в количестве, составляющем 15-25 мас. % от количества гепарина. pH раствора снова доводят до 4,5-5,5. Реакцию осуществляют в тщательно защищенном от света месте в течение 18-24 ч при постоянном перемешивании при температуре 13-17°C со снижением ее в течение последних двух часов до 5°C.

Окончание реакции и удаление йодсодержащих соединений

В реакционную смесь добавляют этанол (95-99,5%) в течение 0,5-1 часа при 5-25°C и тщательном перемешивании. Количество этанола, которое нужно добавить, составляет 1-2 объема этанола на один объем раствора. Образующийся окисленный гепарин можно выделить путем осаждения и отстаивания в течение 15-20 часов и последующего сливания маточного раствора.

Полученный осадок растворяют в очищенной воде для получения 15-30% мас./об. раствора. В раствор добавляют NaCl до концентрации 0,15-0,30 моль/л, перемешивают в течение 0,5-1 часа, поддерживая температуру 5-25°C. Затем добавляют этанол из расчета 1,0-2,0 объема этанола (95-99,5%) на один объем раствора при постоянном перемешивании в течение 0,5-1 ч. Это приводит к выпадению продукта в осадок.

Деполимеризация полисахаридных цепей в процессе β-элиминирования, инициируемого основанием

После сливания маточного раствора осадок перемешивают в приблизительно 7 л воды до полного растворения; концентрация полученного раствора составляет 15-30%. Поддерживая температуру 5-25°C, к раствору медленно добавляют 4 M раствор NaOH до достижения pH 10,5-12. Инициируют реакцию, которая длится 15-95 мин, при этом регистрируют pH и медленно добавляют 4 M HCl, доводя pH до 5,5-7.

Восстановление восстанавливающих концов

Поддерживая температуру на уровне 13-17°C, pH раствора доводят до 5,5-6,5. Затем в раствор добавляют навеску борогидрида натрия 130-150 г, что приводит к повышению pH до 10-11. Реакцию осуществляют в течение 14-20 часов, по истечении которых в реакционную среду медленно добавляют разбавленный раствор кислоты, доводя pH до 4, что приводит к разрушению оставшегося борогидрида натрия. После выдерживания раствора при pH 4 в течение 45-60 мин в него добавляют раствор NaOH, доводя pH раствора до 7.

Затем очистку продолжают в соответствии с примером 5.

Пример 2

Окисление (остатков) глюкуроновой и идуроновой кислот, деления антикоагулянтной активности

Навеску гепарина около 3000 г растворяют в очищенной воде для получения 10-20% мас./об. раствора. pH раствора доводят до 4,5-5,5. Затем добавляют метапериодат натрия (NaIO₄) в количестве, составляющем 15-25 мас. % от количества гепарина. pH раствора вновь доводят до 4,5-5,5. Реакционную среду защищают от попадания света. Реакцию выдерживают в течение 22-26 часов при постоянном перемешивании при температуре 13-17°C со снижением ее в течение последних двух часов до 5°C. В конце реакции измеряют pH.

Окончание реакции окисления и удаление йодсодержащих соединений

В реакционную смесь в течение 0,5-1 часа добавляют этанол (95-99,5%) при тщательном перемешивании при 5-25°C. Количество этанола составляет 1-2 объема на 1 объем раствора. Затем образовавшийся окисленный гепарин осаждают, отстаивая раствор в течение 15-20 часов, после чего маточный раствор сливают.

Деполимеризация полисахаридных цепей путем β-элиминирования, инициируемого основанием

После сливания маточного раствора осадок добавляют в приблизительно 7 л воды, перемешивая до полного растворения. Поддерживая температуру раствора на уровне 20-25°C, в него медленно добавляют 4 M NaOH до достижения pH до 10,5-12 и поддерживают реакцию в течение 15-95 мин. К концу реакции регистрируют pH раствора и в раствор медленно добавляют 4 M HCl до получения pH 5,5-7.

Восстановление восстанавливающих концов

После сливания маточного раствора осадок растворяют, добавляя очищенную воду до концентрации 15-30% мас./об. Поддерживая температуру раствора на уровне 13-17°C, доводят его pH до 5,5-6,5. Затем в раствор добавляют навеску борогидрида натрия 130-150 г и растворяют ее; pH раствора сразу повышается до 10-11, реакция продолжается 14-20 ч. Регистрируют pH раствора до и после реакции. После окончания реакции в раствор медленно добавляют разбавленную кислоту, чтобы довести pH до 4. Кислота разрушает оставшийся борогидрид натрия. Выдержав раствор при pH 4 в течение 45-60 минут, доводят pH до 7, добавляя разбавленный раствор NaOH.

Очистку продукта продолжают, как описано в примере 5.

Пример 3

Окисление (остатков) глюкуроновой и идуроновой кислоты, устранение антикоагулянтной активности

Навеску гепарина около 3000 г растворяют в очищенной воде для получения раствора 10-20% мас./об. pH раствора доводят до 4,5-5,5. Затем добавляют в раствор метапериодат натрия (NaIO₄) в количестве 15-25 мас. % от количества гепарина. pH раствора вновь доводят до 4,5-5,5. Реакционную среду защищают от попадания света. Реакция длится 18-24 часа при постоянном перемешивании при температуре 13-17°C со снижением ее в течение последних двух часов до 5°C.

Деполимеризация полисахаридных цепей путем β-элиминирования, инициируемого основанием

Поддерживая температуру раствора на уровне 5-25°C, в него медленно добавляют 4 M NaOH, доводя pH до 10,5-12. Инициируют реакцию, которая протекает в течение 15-95 минут. К концу реакции регистрируют pH раствора и в раствор медленно добавляют 4 M HCl, доводя pH до 5,5-7.

Восстановление восстанавливающих концов

Поддерживая температуру раствора на уровне 13-17°C, доводят его pH до 5,5-6,5. Затем добавляют в него навеску борогидрида натрия 130-200 г, pH раствора повышается до 10-11. Реакция продолжается 14-20 часов, после чего в раствор медленно добавляют разбавленную кислоту, доводят pH до 4. Кислота разрушает оставшееся количество борогидрида натрия. Выдерживая раствор при pH 4 в течение 45-60 мин, pH доводят до 7, добавляя в раствор разбавленный раствор NaOH.

Осаждение восстановленного продукта и предварительное удаление йодсодержащих соединений

В реакционную смесь в течение 0,5-1 часа добавляют этанол (95-99,5%) при тщательном перемешивании при 5-25°C. Количество этанола составляет 1-2 объема на 1 объем раствора. Окисленный гепарин затем осаждают и раствор отстаивают в течение 15-20 часов, после чего маточный раствор сливают.

Далее осадок растворяют в очищенной воде до концентрации 15-30% мас./об. Добавляют NaCl до концентрации 0,15-0,30 моль/л.

Очистку продукта осуществляют, как описано в примере 5.

Пример 4

Окисление (остатков) глюкуроновой и идуроновой кислот, устранение антикоагулянтной активности

Навеску гепарина около 3000 г растворяют в очищенной воде для получения 10-20% мас./об раствора. pH раствора доводят до 4,5-5,5. Затем добавляют метапериодат натрия (NaIO₄) в количестве 15-25 мас. % от количества гепарина. pH раствора вновь доводят до 4,5-5,5. Реакционную смесь защищают от попадания света. Растворенный гепарин подвергают взаимодействию в течение 18-24 часов при постоянном перемешивании при температуре 13-17°C со снижением ее в течение последних двух часов до 5°C. Далее для гашения реакции добавляют глицерин, то есть оставшееся количество периодата переводят в йодат; добавляют 150-200 мл 85% раствора глицерина и позволяют ему взаимодействовать в течение 30-60 мин при постоянном перемешивании.

Осаждение продукта, удаление йодсодержащих соединений и гасителей/продуктов реакции

В реакционную смесь в течение 0,5-1 часа добавляют этанол (95-99,5%) при тщательном перемешивании при 5-25°C. Количество добавляемого этанола составляет 1-2 объема на 1 объем раствора. Окисленный гепарин осаждают отстаиванием раствора в течение 15-20 ч, после чего маточный раствор сливают.

Далее осадок растворяют в очищенной воде для получения 15-30% мас./об. раствора, добавляют NaCl до концентрации его в растворе 0,15-0,30 моль/л. Раствор перемешивают еще 0,5-1 час, поддерживая его температуру на уровне 5-25°C. Затем добавляют этанол (95-99,5%) в течение 0,5-1 часа из расчета 1,0-2,0 объема на 1 объем раствора при постоянном перемешивании. Это приводит к осаждению продукта.

Деполимеризация полисахаридных цепей путем β-элиминирования, инициируемого основанием.

После сливания маточного раствора осадок перемешивают в приблизительно 7 л воды до полного растворения. Поддерживая температуру раствора на уровне 5-25°C, медленно добавляют 4 M NaOH, пока pH не достигнет 10,5-12 и таким образом инициируют реакцию, длящуюся 60-95 минут. К концу реакции регистрируют pH раствора и в раствор медленно добавляют 4 M HCl, пока pH раствора не достигнет 5,5-7.

Восстановление восстанавливающих концов

После сливания маточного раствора осадок растворяют, добавляя очищенную воду до достижения концентрации 15-30% мас./об. Поддерживая температуру раствора на уровне 13-17°C, доводят его pH до 5,5-6,5. Затем в него добавляют навеску борогидрида натрия 130-150 г и растворяют, при этом pH раствора сразу повышается до 10-11. Реакция длится 14-20 часов. Регистрируют pH раствора до и после реакции. Затем добавляют разбавленный раствор кислоты и доводят pH до 4; кислота разрушает оставшийся борогидрид натрия. После выдерживания раствора при pH 4 в течение 45-60 мин, добавляют разбавленный раствор NaOH и доводят pH раствора до 7.

Очистку продукта осуществляют, как описано в примере 5.

Пример 5

Очистка продукта

Удаление добавок, примесей и добавление противоионов и фильтрация

Раствор, упомянутый в примерах 1-4, получаемый после химической модификации восстанавливающего конца борогидридом на последней стадии, подвергают следующим манипуляциям.

Один объем раствора добавляют к 1,5-2 объемам этанола (95-99,5%), затем центрифугируют при >2000 G, температуре ниже 20°C в течение 20-30 мин, после чего надосадочную жидкость сливают.

Продукт, полученный в виде пасты путем центрифугирования, растворяют в очищенной воде до концентрации 10-20% мас./об. Добавляют NaCl до достижения концентрации 0,20-0,35 моль/л. Затем добавляют этанол (95-99,5%) в количестве 1,5-2,5 объема на 1 объем раствора, что приводит к выпадению продукта в осадок. Затем раствор центрифугируют, как описано выше.

Затем остающуюся пасту добавляют в очищенную воду до растворения. Концентрация продукта должна составить 10-20% мас./об. pH раствора с продуктом составляет теперь 6,5-7,5. Раствор затем фильтруют для удаления частиц. К раствору добавляют этанол (95-99,5%) из расчета 1,5-2,5 объема на 1 объем раствора, после чего центрифугируют при >2000 G и <20°C в течение 20-30 мин и надосадочную жидкость сливают.

Обезвоживание пастообразного осадка и уменьшение размера частиц В реакционный сосуд помещают около 2 л этанола. Перемешивая этанол, добавляют пастообразный осадок. Механическое перемешивание вызывает отверждение пасты и замещение присутствующей в ней воды этанолом, способствуя образованию гомогенной суспензии частиц. Перемешивание прекращают через 1-2 часа, после чего дают частицам осесть. После удаления избытка жидкости, частицы просеивают через сито или измельчают в мельнице, чтобы сделать их более однородными.

Высушивание продукта

Продукт равномерно распределяют по лоткам, помещают в вакуумную камеру и высушивают нагреванием (при 35-40°C) под вакуумом. Сохраняя пониженное давление в сушильном аппарате, пропускают через него поток азота. После стабилизации массы продукта, то есть при прекращении образования пара, высушивание считается завершенным. Продукт упаковывают и защищают от влаги.

Пример 6

Окисление (остатков) глюкуроновой и идуроновой кислот, устранение антикоагулянтной активности

Навеску гепарина около 3000 г растворяют в очищенной воде для получения 10-20% мас./об. раствора. pH раствора доводят до 4,5-5,5. Добавляют метапериодат натрия (NaIO₄) в количестве 15-25 мас. % от количества гепарина. pH раствора вновь доводят до 4,5-5,5. Реакционную смесь защищают от попадания света. Растворенный- гепарин и метапериодат натрия подвергают взаимодействию в течение 18-24 ч при постоянном перемешивании при температуре 13-17°C со снижением ее в течение последних двух часов до 5°C.

Деполимеризация полисахаридных цепей путем β-элиминирования, инициируемого основанием

Поддерживая температуру раствора на уровне 5-25°C, медленно добавляют в него 4 M NaOH, пока pH не достигнет значения 10,5-12, и инициируют реакцию, которая длится от 15 до 95 мин. К окончанию реакции регистрируют pH раствора и в раствор медленно добавляют HCl, пока pH не достигнет 5,5-7.

Восстановление восстанавливающих концов

После сливания маточного раствора осадок растворяют, добавляя к нему очищенную воду до достижения концентрации 15-30% мас./об. Поддерживая температуру раствора на уровне 13-17°C, доводят его pH до 5,5-6,5. Навеску борогидрида 130-200 г добавляют в раствор, pH которого сразу повышается до 10-11, реакцию осуществляют в течение 14-20 ч. Регистрируют pH раствора до и после реакции, после чего в раствор медленно добавляют разбавленный раствор кислоты, пока pH не достигает 4; кислота разрушает оставшийся борогидрид натрия. Раствор при pH 4 выдерживают в течение 45-60 мин, затем в него добавляют разбавленный раствор NaOH, пока pH не достигнет 7, после чего добавляют очищенную воду, пока электропроводность раствора не достигнет 15-20 мС/см.

Очистка продукта анионообменной хроматографией

Колонку диаметром 500 мм заправляют DEAE-сефарозой или QAE-сефарозой в объеме 25-30 л, что соответствует высоте слоя 10-15 см. Хроматографию выполняют в 3-4 цикла для использования всего продукта.

Затем готовят буферные растворы:

Равновесный буфер, буфер А, 15 мМ фосфат, 150 мМ NaCl

Элюирующий буфер, буфер В, 2 M раствор NaCl

Очищающий буфер, 0,5 M раствор NaOH

Стадию хроматографирования выполняют при 15-25°C при скорости потока ≤200 см/час или около 350 л/час.

Колонку уравновешивают равновесным буфером, пока электропроводность элюента не достигнет 15-20 мС/см. Затем в колонку закачивают раствор окисленного гепарина. Количество неочищенного продукта, которое необходимо нанести на колонку, составляет <40 г на 1 л хроматографической среды.

Затем колонку изократически промывают равновесным буфером, пока поглощение УФ при 210-254 нм не достигнет исходного уровня. В типичных случаях для достижения исходного уровня буферного раствора требуется в пятикратном объеме. Химические вещества, добавленные в раствор и образовавшиеся из них продукты удаляют.

Затем выполняют градиентное элюирование, увеличивая по линейному закону ионную силу буферного раствора, которым заполнена колонка. Содержание буферного раствора А уменьшают со 100% до 0%, замещая его 100% буферным раствором В, для чего его количество должно на протяжении 5 объемов. Элюированный продукт собирают, когда поглощение УФ превышает 0,1 единицы активности (ЕА), и прекращают, когда величина сигнала меньше 0,1 ЕА. Затем приступают к очистке колонки и готовятся к следующему циклу хроматографии. Элюаты, полученные во всех сериях, собирают вместе и хранят при 15-25°C.

Обессоливание продукта

Один объем собранных на предыдущих стадиях элюатов добавляют к трем объемам 95-99,5% этанола при 15-25°C и постоянном перемешивании. Это приводит к выпадению продукта в осадок. Продукт оставляют для осаждения в течение более 3 часов. Затем осадок растворяют в очищенной воде до концентрации 15-25%. Затем раствор добавляют к холодному 95-99,5% этанолу (<-5°C), в типичном случае расходуют 5 объемов этанола на один объем раствора продукта. Полученный раствор центрифугируют при >2000 G и пастообразный продукт собирают и готовят к высушиванию.

Высушивание продукта

Продукт равномерно распределяют по лоткам и помещают в вакуумную камеру. Высушивают при нагревании до 35-40°C под вакуумом. Поддерживая пониженное давление в сушильном шкафу, через него пропускают азот. Когда масса продукта перестает меняться, то есть парообразование прекращается, высушивание заканчивают. Продукт размельчают, доводят до гомогенного состояния, затем пакуют, защищая от влаги.

Пример 8

Гепарин со слабой антикоагулянтной активностью, образовавшийся в примере 1 и 3 подвергают ¹Н ЯМР-анализу и сравнивают полученный спектр со спектром нативного гепарина.

В таблице II приведены сигналы в области от 5,00 м.д. до 6,50 м.д., которые отсутствуют в спектре нативного гепарина, образовавшегося из ненасыщенных гликозаминогликанов с невосстанавливающим концом. Результаты, приведенные в табл.И, показывают, что можно уменьшить долю соединений, которые необычны для спектра нативного гепарина, до низкого уровня. Принятый в настоящее время EDQM предел, в отношении контроля качества гепарина для любого сигнала в диапазоне 5,70-8,00 м.д. (монография 7) составляет <4% по сравнению с сигналом в области 5,42.

Присутствие ненасыщенных глюкозаминов с невосстанавливающим концом также определяли количественно по комбинированной оценке ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР-спектров (HSQC) и выражали как мол. % от совокупного количества глюкозаминов (см. таблицу III).

Кроме того, образец был проанализирован методом двумерной (2D) ЯМР-спектроскопии, включающим комбинированное использование ¹Н и ¹³С ЯМР-спектроскопии (HSQC) по описанной ранее методике (см. Guerrini M., Naggi A., Guglieri S, Santarsiero R, Torn G. Anal Biochem 2005; 337, 35-47).

В таблице III приведена процентная доля модифицированных глюкозаминов по сравнению с общим количеством глюкозаминов гепарина со слабой антикоагулянтной активностью, определенная по сигналу в области 5,95 м.д. и 6,15 м.д. в ¹Н ЯМР-спектре.

Пример 9

Из продукта, полученного по любой из методик описанных выше экспериментов, можно приготовить лекарство, используя традиционный процесс с соблюдением асептических условий, например раствор, содержащий 150 мг/мл активного продукта и до 15 мМ фосфата натрия при pH 6-8. Полученный таким образом лекарственный продукт предназначен в основном для подкожного введения, но его можно вводить и внутривенно.

Полученный продукт является деполимеризованной формой гепарина со средним молекулярным весом 4,6-6,9 кДа, которая по существу не обладает антикоагулянтной активностью.

Продукт имеет полисахаридные полимеры с распределением по размеру с диапазоном для n от 2 до 20, соответствующим молекулярному весу 1,2-15 кДа. Превалирующим размером является 6-16 дисахаридных звеньев, что соответствует молекулярному весу 3,6-9,6 кДа.

Молекулярный вес определяли гельпроникающей ВЭЖХ, выполненной последовательно на колонках TSK 2000 и TSK 3000 SW. Оценку осуществляли с помощью коэффициента преломления. Для этого использовали первый международный эталон калибрующего вещества НМГ.

Ниже приведено распределение по молекулярной массе и соответствующая процентная доля от общего веса.

Соответствующее значение средневесового молекулярного веса Mw приходится на диапазон 4,6-6,9 кДа.

Пример 10

Изучена стабильность порошкообразного лекарственного вещества и лекарственного вещества, растворенного в фосфатно-буферном растворе химически модифицированного гликозаминогликана. Результаты приведены на фиг. 2 и фиг. 3.

Пример 11

Подкожное введение

Меченный тритием гепарин, полученный способом по изобретению и описанный в примере 1, вводили крысам линии Sprauge Dawley и собакам.

Результаты:

После подкожного введения гепарина в дозе 2, 8 и 24 мг/кг/сут крысам и в дозе 3, 15 и 45 мг/кг/сут собакам всасывание происходило быстро и максимальный уровень гепарина в плазме достигался обычно в течение 0,5 ч у крыс и 1,5 ч у собак. Биодоступность как у крыс, так и у собак при подкожном введении составила около 90%. Примечательно, что соответствующая биодоступность для гепарина равна около 10%. Хотя в настоящем документе подробно описаны конкретные варианты осуществления изобретения, они приведены исключительно в целях наглядности, при этом их описание не ограничивает объем прилагаемой формулы изобретения. В частности, авторы изобретения полагают, что в настоящем изобретении могут быть сделаны различные замены, изменения и модификации без выхода за рамки сущности и объема изобретения, как они определены прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение относится к химически модифицированному гликозаминогликану, который является гепарином или гепарансульфатом, обладающему активностью антифактора IIа менее 10 МЕ/мг, активностью антифактора Xa менее 10 МЕ/мг и средним молекулярным весом от 4,6 до 6,9 кДа. Изобретение относится также к способу получения модифицированного гликозаминогликана и его медицинскому применению. 7 н. и 38 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.

1. Химически модифицированный гликозаминогликан при условии, что гликозаминогликаном является гепарин или гепарансульфат, характеризующийся следующими признаками:

(i) он обладает активностью антифактора IIa менее 10 МЕ/мг;

(ii) он обладает активностью антифактора Ха менее 10 МЕ/мг;

(iii) он обладает средневесовой молекулярной массой (Mw) от около 4,6 до около 6,9 кДа; и

(iv) превалирующий сахарид в химически модифицированном гликозаминогликане имеет формулу I:

в которой

или , и

n является целым числом от 2 до 20, так что указанные полисахаридные цепи имеют от 2 до 20 дисахаридных звеньев, что соответствует молекулярному весу в диапазоне от 1,2 до 12 кДа; и

(v) полисахаридные цепи по существу не содержат интактных несульфатированных идуроновых и/или глюкуроновых кислот из пентасахаридных последовательностей, опосредующих антикоагулянтный эффект, и

(vi) химически модифицированный гликозаминогликан имеет распределение полисахаридов и их молекулярных масс, выраженных как суммарная доля в мас. %, в соответствии с таблицей:

2. Химически модифицированный гликозаминогликан по п.1, отличающийся тем, что превалирующие полисахаридные цепи имеют от 6 до 12 дисахаридных звеньев с молекулярным весом 3,6-7,2 кДа.

3. Химически модифицированный гликозаминогликан по п.1, содержащий ненасыщенные глюкозамины с невосстанавливающим концом, представленные сигналами в интервале от 5,0 до 6,5 м.д. на ¹Н ЯМР-спектре с интенсивностью (процентное отношение) менее 4% относительно сигнала в области 5,42 м.д. для нативного гепарина.

4. Химически модифицированный гликозаминогликан по п.2, содержащий ненасыщенные глюкозамины с невосстанавливающим концом, представленные сигналами в интервале от 5,0 до 6,5 м.д. на ¹Н ЯМР-спектре с интенсивностью (процентное отношение) менее 4% относительно сигнала в области 5,42 м.д. для нативного гепарина.

5. Химически модифицированный гликозаминогликан по п.3, отличающийся тем, что модифицированные глюкозамины представлены сигналами в области 5,95 м.д. и 6,15 м.д. на ¹Н ЯМР-спектре.

6. Химически модифицированный гликозаминогликан по п.4, отличающийся тем, что модифицированные глюкозамины представлены сигналами в области 5,95 м.д. и 6,15 м.д. на ¹Н ЯМР-спектре.

7. Химически модифицированный гликозаминогликан по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что гликозаминогликаном, подвергнутым химической модификации, является гепарин.

8. Способ получения химически модифицированного сульфатированного гликозаминогликана, выбираемого из группы, состоящей из гепарина и гепарансульфата, с активностью антифактора IIа менее 10 МЕ/мг, активностью антифактора Ха менее 10 МЕ/мг и средневесовой молекулярной массой (Mw) от около 4,6 до около 6,9 кДа, включающий следующие последовательные стадии:

(a) окисления глюкуроновой и идуроновой кислот путем обработки периодатом,

(b) деполимеризации полисахаридных цепей в основных условиях, и

(c) восстановления и стабилизации концевых альдегидных групп путем реакции с восстанавливающим агентом, и

элиминирования или сведения к минимуму эффектов окисляющих йодсодержащих соединений путем контроля времени между моментом завершения стадии а) и началом стадии с).

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что время от момента завершения стадии а) до начала стадии с) не превышает 6 часов.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют при температуре выше 10°С.

11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют при температуре выше 10°С.

12. Способ по п. 8, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют в растворе с исходной концентрацией гликозаминогликана около 10-20% мас./об.

13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют в растворе с исходной концентрацией гликозаминогликана около 10-20% мас./об.

14. Способ по п. 10, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют в растворе с исходной концентрацией гликозаминогликана около 10-20% мас./об.

15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют в растворе с исходной концентрацией гликозаминогликана около 10-20% мас./об.

16. Способ по любому из пп 8-15, отличающийся тем, что процесс окисления выполняют в течение по меньшей мере 15 ч.

17. Способ по любому из пп. 8-15, отличающийся тем, что процесс окисления выполняют в течение около 18-24 ч.

18. Способ по любому из пп 8-15, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют при температуре около 15±2°С и концентрации гликозаминогликана около 15% и при рН около 5 в течение около 18-24 ч.

19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют при температуре около 15±2°С и концентрации гликозаминогликана около 15% и при рН около 5 в течение около 18-24 ч.

20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что окисление периодатом осуществляют при температуре около 15±2°С и концентрации гликозаминогликана около 15% и при рН около 5 в течение около 18-24 ч.

21. Способ по любому из пп 8-15 и 19-20, отличающийся тем, что деполимеризацию выполняют при температуре выше около 20°С.

22. Способ по п. 16, отличающийся тем, что деполимеризацию выполняют при температуре выше около 20°С.

23. Способ по п. 17, отличающийся тем, что деполимеризацию выполняют при температуре выше около 20°С.

24. Способ по п. 18, отличающийся тем, что деполимеризацию выполняют при температуре выше около 20°С.

25. Способ по любому из пп. 8-15, 19-20 и 22-24, предназначенный для обогащения производных гликозаминогликанов полисахаридными цепями, имеющими молекулярный вес от около 1,2 до около 12 кДа.

26. Способ по п. 16, предназначенный для обогащения производных гликозаминогликанов полисахаридными цепями, имеющими молекулярный вес от около 1,2 до около 12 кДа.

27. Способ по п. 17, предназначенный для обогащения производных гликозаминогликанов полисахаридными цепями, имеющими молекулярный вес от около 1,2 до около 12 кДа.

28. Способ по п. 18, предназначенный для обогащения производных гликозаминогликанов полисахаридными цепями, имеющими молекулярный вес от около 1,2 до около 12 кДа.

29. Способ по п. 21, предназначенный для обогащения производных гликозаминогликанов полисахаридными цепями, имеющими молекулярный вес от около 1,2 до около 12 кДа.

30. Способ по любому из пп. 8-15, 19-20, 22-24, 26-29, отличающийся тем, что глюкозаминогликаном, подвергнутым химической модификации, является гепарин.

31. Способ по п. 16, отличающийся тем, что глюкозаминогликаном является гепарин.

32. Способ по п. 17, отличающийся тем, что глюкозаминогликаном является гепарин.

33. Способ по п. 18, отличающийся тем, что глюкозаминогликаном является гепарин.

34. Способ по п. 21, отличающийся тем, что глюкозаминогликаном является гепарин.

35. Способ по п. 25, отличающийся тем, что глюкозаминогликаном является гепарин.

36. Химически модифицированный гликозаминогликан, который может быть получен способом по любому из пп. 8-35.

37. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения и профилактики состояния, выбираемого из группы, состоящей из дистоции и состояний, при которых в качестве осложнений отмечается потеря белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку, содержащая терапевтически эффективное количество химически модифицированных сульфатированных гликозаминогликанов по любому из пп. 1-7 и 36 и терапевтически приемлемый носитель.

38. Химически модифицированный гликозаминогликан по любому из пп. 1-6 и 36 для медицинского применения, не связанного с антикоагулянтным эффектом.

39. Химически модифицированный гликозаминогликан по п. 7 для медицинского применения, не связанного с антикоагулянтным эффектом.

40. Химически модифицированный гликозаминогликан по любому из пп. 1-6 и 36 для лечения и профилактики заболеваний состояний, выбираемых из группы, состоящей из дистоции и состояний, при которых в качестве осложнения отмечается потеря белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку.

41. Химически модифицированный гликозаминогликан по п. 7 для лечения и профилактики заболеваний состояний, выбираемых из группы, состоящей из дистоции и состояний, при которых в качестве осложнения отмечается потеря белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку.

42. Применение химически модифицированного гликозаминогликана по любому из пп. 1-7 и 36 для производства медикамента для лечения, не связанного с антикоагулянтным эффектом.

43. Применение химически модифицированного гликозаминогликана по любому из пп. 1-7 и 36 для производства медикамента, предназначенного для лечения и профилактики состояния, выбираемого из группы, состоящей из дистоции и состояний, при которых в качестве осложнений отмечается потеря белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку.

44. Способ лечения состояния, не зависящего от антикоагулянтного эффекта, отличающийся тем, что химически модифицированный гликозаминогликан по любому из пп. 1-7 и 36 вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве.

45. Способ по п.44, отличающийся тем, что состояние и заболевание выбирают из группы, состоящей из дистоции и состояний, при которых в качестве осложнений отмечается потеря белка через эндотелиальную и эпителиальную выстилку.