Способ синтеза трансфецирующего наноагента для генотерапевтических применений (варианты) Российский патент 2025 года по МПК B82B3/00 B82Y5/00 B82Y40/00 C12N15/113 C12N15/12 C07K14/47 C08G73/02 A61K48/00 A61K47/34 A61P43/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биомедицины и наномедицины, в частности, к получению агентов для трансфекции и генотерапевтических препаратов на основе белков и ДНК.

Описание предшествующего уровня техники

За последние несколько десятилетий был разработан широкий спектр реагентов и методов для переноса нуклеиновых кислот в клетки с целью модуляции экспрессии генов как in vitro, так и in vivo. В частности, были идентифицированы многие гены, участвующие в патологических процессах, и поэтому генная терапия рассматривается как очень многообещающий терапевтический инструмент для обращения вспять генетических изменений в указанных патологиях, которые включают, например, аутосомно-рецессивные заболевания, вызванные дефектом одного гена, например кистозный фиброз, гемофилия, болезнь Фабри; аутосомно-доминантные заболевания; некоторые виды рака; ВИЧ и другие инфекционные заболевания; воспалительные заболевания; или глазные заболевания, такие как ретиношизис и многие другие.

Существует большое количество систем доставки и способов создания трансфецирующих агентов. Как правило, для трансфекции конструируются и используются надмолекулярные конструкции, содержащие ДНК/РНК. Наноконструкции существенно эффективнее молекулярных ДНК/РНК для трансфекции в силу того, что наночастица стабилизирует и защищает переносимые нуклеиновые кислоты от деградации нуклеазами, способствует эндоцитозу внутрь клеток-мишеней, а также последующему выходу нуклеиновых кислот из эндосом.

Известны как традиционные методы получения наночастиц для трансфекции, так и передовые, например, метод микроэмульсии, гидротермальный метод, золь-гель метод.

Традиционные методы получения наночастиц делятся на физические и химические. Физические методы включают механическое измельчение и физическое осаждение из паровой фазы. К недостаткам можно отнести сложное технологическое оборудование, низкий выход и сложности крупномасштабного производства. Метод микроэмульсии и метод пиролиза распылением обычно сопровождаются высокотемпературной термообработкой, в результате чего частицы легко агломерируются и происходит аномальный рост частиц. Однако обычный цикл гидротермальной реакции является длительным, и обычно он занимает несколько часов, даже несколько дней времени реакции, и неизбежен значительный рост частиц. Получение наночастиц металла с помощью химического электролиза является относительно зрелым и промышленным методом производства, но полученный металлический порошок обычно необходимо подвергать «шаровой мельнице», просеивание и тому подобное, чтобы окончательно получить сверхмелкозернистые частицы металла, а отработанная жидкость электролита содержит большое количество ионов металла. Любой сброс приведет к неэффективному использованию ресурсов и загрязнению окружающей среды, что ограничивает широкомасштабное промышленное применение метода. Метод жидкофазного восстановления является относительно активным методом получения наночастиц в последние годы, но этот метод обычно требует большого количества органических растворителей или высокотоксичных добавочных компонентов, что вызывает серьезное загрязнение при производстве, и его применение сильно ограничено. Поэтому очень важно изучить экологически чистую и эффективную технологию получения наночастиц с использованием воды в качестве реакционной среды.

Известен гидротермальный метод синтеза, который имеет преимущества простого оборудования, легкого доступа к сырью, высокой чистоты получаемого продукта, хорошей однородности и точного контроля химического состава и т.д., что имеет предпочтение у многих исследователей. Гидротермальный метод заключается в создании отражающей среды с высокой температурой и высоким давлением за счет нагрева реакционной системы до критической температуры или близкой к критической температуре в специально созданном закрытом реакторе/ автоклаве с использованием таких жидкостей, как вода, органические растворители или реакционные вещества. Это эффективный метод для ускорения реакции, проводимой в жидкой фазе или в газовой фазе, для растворения и перекристаллизации первоначально нерастворимых веществ, а затем для получения продукта путем разделения и термической обработки. Гидротермальный метод имеет следующие преимущества: 1) В нем используется регулировка жидкой фазы при средней температуре, обычно от 120 до 200°С, потребление энергии относительно низкое, а область применения широкая. Его можно использовать как для получения наночастиц небольшого размера, так и для монокристаллов большого размера; 2) Сырье относительно дешевое и его легко получить, реакция проводится в жидкой фазе с быстрой конвекцией, выход высокий, фаза однородная, чистота высокая, кристаллизация хорошая, форма и размер можно контролировать; 3) в воде. В ходе термического процесса цель эффективного управления реакцией и характеристиками роста кристаллов может быть достигнута путем регулирования температуры реакции, давления, времени, рН, прекурсоров и поверхностно-активных веществ; 4) Реакция проводится в герметичном контейнере.

Эффективность и безопасность терапевтических агентов можно повысить с помощью наноразмерных систем доставки лекарств. Системы доставки лекарств в наномасштабе локализуют лекарственные средства в тканях-мишенях в увеличенном количестве, увеличивают стабильность лекарств и проницаемость через биологические мембраны, тем самым улучшая их биодоступность и терапевтическую эффективность.

Наночастицы на основе белка привлекают внимание благодаря своей биоразлагаемости, биосовместимости, простоте модификации поверхности и контролю размеров. На сегодняшний день доступны химические, физические и биотехнологические методы создания белковых наночастиц с использованием альбумина, фиброина, желатина, ферритина, меланина, липопротеинов, проникающих в клетки белков, вирусных капсидных белков и т.д.

Однако эти методы имеют следующие ограничения:

i) неблагоприятные условия синтеза, приводящие к полной или частичной денатурации белка (это относится к десольватации, электрораспылению, высаливанию);

ii) крупный размер и/или широкое распределение наночастиц по размеру (это относится к коацервации, поперечному сшиванию, эмульгированию);

iii) ограниченное количество белков, с которыми совместим метод (это относится к самосборке).

Эти методы требуют значительного количества энергии, воды и реагентов, а также использования растворителей, поверхностно-активных веществ или даже тяжелых металлов. Кроме того, почти все типы наночастиц модифицируются лигандом или рецептором, чтобы действовать в качестве прицельного наноагента. Эти модификации часто требуют сложных многоступенчатых операций синтеза. Таким образом, экологически чистый, универсальный и простой синтез прицельных белковых наночастиц представляет большой интерес.

Агрегация белков, вызванная нагреванием, является хорошо известным и изученным фактом. Однако агрегацию иммуноглобулинов можно рассматривать не как препятствие, которого следует избегать, а как устойчивый подход к проектированию/ разработке функциональных наночастицы. Среди упомянутых методов десольватация (добавление органического растворителя), высаливание (увеличение ионной силы), коацервация (добавление взаимодействия с белковым агентом) и агрегация нагнетательным электрораспылением. Однако, производственная база нанодиапазона для белковой наномедицины накладывает на метод следующие условия: белок должен сохранять свои функциональные свойства, например, сходство, размер продукта должен контролироваться так, чтобы он не превышал сотен нанометров.

С точки зрения термодинамики агрегация означает, что белок находится в некотором состоянии, при котором связь с другим белком снижает/ уменьшает свободную энергию/ термодинамический потенциал. Известны многие механизмы агрегации, такие как на основе нативных/ естественных мономеров, вызванная конъюгацией модификация, обусловленные химической модификацией, вызванные нуклеацией и поверхностно-индуцированные. Существует множество факторов, которые делают иммуноглобулины термоагрегируемыми, например, множественные внутри- и междоменные гидрофобные взаимодействия, неспаренные сульфгидрильные группы, сложная многодоменная структура со значительной стоимостью свободной энергии.

Известен способ (US6936243 B2, опубл. 30.08.2005), в котором используют аденоассоциированные вирусы для доставки генетических конструкций.

Однако, данный известный способ имеет следующие недостатки: вирусы вызывают иммунный ответ, который существенно снижает эффективность трансфекции in vivo после повторной администрации вируса; аденоассоциированные вирусы существенно ограничены по длине генетических конструкций, которые они способны переносить; аденоассоциированные вирусы чрезвычайно дороги в производстве; а кроме того, они лишены универсальности в доставке нуклеиновых кислот различных типов (ДНК, мРНК, антисенс олигонуклеотиды и т.п.).

Известен наиболее близкий способ (KR101368170 B1, опубл. 19.03.2014), в котором смешивают полиэтиленимин и оксид графена с ДНК или РНК для образования полиплексов.

Однако, данный известный способ имеет следующие недостатки: полиэтиленимин крайне токсичен, а потому введение таких агентов in vivo существенно ограничено; мРНК в таких полиплексах подвержены деградации нуклеазами.

Таким образом, требуемый технический результат заключается в универсальном способе создания трансфецирующих агентов, которые бы имели пониженный иммунный ответ и токсичность, были бы универсальны по типам переносимых нуклеиновых кислот (генетических конструкций), отличались дешевизной производства.

Краткое описание изобретения

Для достижения указанного технического результата предложен способ синтеза трансфецирующего наноагента, состоящего из белковых молекул, нуклеиновых кислот (НК) и полиэтиленимина (ПЭИ), характеризующийся тем, что он включает стадии: нагрева раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, полиэтиленимин и белок и последующего нагрева полученной смеси до температуры в диапазоне от 45 до 99 градусов Цельсия.

Другой аспект изобретения относится к способу доставки нуклеиновой кислоты к клетке-мишени in vitro, при котором трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом, вводят в организм, при этом суспензию упомянутого трансфецирующего наноагента добавляют к упомянутой клетке-мишени.

Следующий аспект изобретения относится к способу доставки нуклеиновой кислоты к клетке-мишени in vivo, при котором трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом, вводят в организм, при этом суспензию упомянутого трансфецирующего наноагента добавляют к упомянутой клетке-мишени.

Следующий аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного вещества трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом.

Одним из аспектов изобретения является также фармацевтическая композиция лекарственного препарата для лечения генетического заболевания, содержащая в качестве активного вещества трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом.

Еще одним из аспектов изобретения является применение фармацевтически активного трансфецирующего наноагента, полученного упомянутым способом, в медицинской продукции или для получения лекарственного средства.

Сущность изобретения поясняется чертежами

Фиг. 1. Общая схема синтеза трансфекционного наноагента.

Фиг. 2. Результат доставки гена GFP как описано в Примере 9.

Фиг. 3 Результат доставки гена люциферазы светлячка как описано в Примере 10.

Подробное описание изобретения

Используемые в данном документе термины: «наночастицы», «одновременная инкубация», «полученная смесь», «кратковременный нагрев», «флуорофор», «матричная РНК», «плазмидная ДНК», «линейная двухцепочечная ДНК» означают / представляют собой следующее:

«наночастицы» - это коллоидно-стабильные изолированные агенты размером не более 500 нм;

«одновременная инкубация» - нагрев раствора содержащего перечисление вещества;

«кратковременный нагрев» - нагрев, длительностью не более 30 минут;

«матричная РНК» - молекула одноцепочечной рибонуклеииновой кислоты, пригодной для синтеза белка на ее основе;

«плазмидная ДНК» - кольцевая молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты, способная к автономной репликации внутри клеток;

«линейная двух цепочечная ДНК» - две гибридизованные молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, как с полной, так и неполной комплементарностью.

Для достижения указанного технического результата предложен способ синтеза трансфецирующего наноагента, состоящего из белковых молекул, нуклеиновых кислот (НК) и полиэтиленимина (ПЭИ), характеризующийся тем, что он включает стадии: нагрева раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, полиэтиленимин и белок и последующего нагрева полученной смеси до температуры в диапазоне от 45 до 99 градусов Цельсия.

Кроме того, способ, характеризующийся тем, что он дополнительно включает стадию инкубации белковых молекул, нуклеиновых кислот (НК) и полиэтиленимина (ПЭИ) при температуре от 4 до 40 градусов Цельсия, причем упомянутая стадия инкубации предшествует упомянутому нагреву смеси.

Кроме того, способ, характеризующийся тем, что он дополнительно включает стадию инкубации смеси белковых молекул и полиэтиленимина (ПЭИ) при температуре от 4 до 40 градусов Цельсия, и дополнительную стадию добавления к полученной смеси упомянутых кислот.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят при температуре от 40 до 45 градусов.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят при температуре от 45 до 55 градусов.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят при температуре от 55 до 75 градусов.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят при температуре от 75 до 95 градусов.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят в течение от 30 секунд до 2 минут.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят в течение от 2 секунд до 4 минут.

Кроме того, способ, в котором упомянутый нагрев смеси проводят в течение от 4 секунд до 6 минут.

Кроме того, способ, в котором после упомянутого нагрева полученную смесь остужают до комнатной температуры с помощью метода активного охлаждения.

Кроме того, способ, в котором после кратковременного нагрева смеси дополнительно проводят ее инкубацию с концентрированным раствором кросс-линкера.

Кроме того, способ, в котором после упомянутого кратковременного нагрева смеси дополнительно проводят ее инкубацию с концентрированным раствором формальдегида при конечной концентрации формальдегида не более 0.1% в течение ночи при комнатной температуре.

Кроме того, способ, в котором для облегчения обнаружения частиц in vitro и in vivo в полученную смесь добавляют водный раствор эфира флуорофора.

Кроме того, способ, в котором нуклеиновой кислотой может быть матричная РНК.

Кроме того, способ, в котором нуклеиновой кислотой может быть плазмидная ДНК.

Кроме того, способ, в котором нуклеиновой кислотой может быть линейная двуцепочечная ДНК.

Кроме того, способ, в котором нуклеиновой кислотой может быть линейная одноцепочечная ДНК.

Кроме того, способ, в котором полиэтиленимин может быть линейным.

Кроме того, способ, в котором полиэтиленимин может быть разветвленным.

Кроме того, способ, в котором упомянутые белковые молекулы является смесью нескольких белков.

Кроме того, способ, в котором упомянутые белковые молекулы является молекулами иммуноглобулинов, гамма-иммуноглобулинов, бычьего сывороточного альбумина, трансферрина.

Кроме того, способ, в котором упомянутые белковые молекулы ковалентно сшиты с упомянутыми молекулами полиэтиленимина.

Кроме того, способ, в котором добавляют электролит для увеличения ионной силы раствора.

Кроме того, способ, в котором упомянутый электролит является хлоридом натрия.

Кроме того, способ, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pi от 3 до 7.

Кроме того, способ, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pi от 7 до 11.

Второй аспект изобретения относится к способу доставки нуклеиновой кислоты к клетке-мишени in vitro, при котором трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом, вводят в организм, при этом суспензию упомянутого трансфецирующего наноагента добавляют к упомянутой клетке-мишени.

Третий аспект изобретения относится к способу доставки нуклеиновой кислоты к клетке-мишени in vivo, при котором трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом, вводят в организм, при этом суспензию упомянутого трансфецирующего наноагента добавляют к упомянутой клетке-мишени.

Четвертый аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного вещества трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом.

Пятым аспектом изобретения является фармацевтическая композиция лекарственного препарата для лечения генетического заболевания, содержащая в качестве активного вещества трансфецирующий наноагент, полученный упомянутым способом.

Шестым аспектом изобретения является применение фармацевтически активного трансфецирующего наноагента, полученного упомянутым способом, в медицинской продукции или для получения лекарственного средства.

Далее мы продемонстрируем одноэтапный синтез наночастиц иммуноглобулина (IgNPs) с возможностью управлять размером синтеза - сначала без добавления полиэтиленмина илинуклеиновых кислот. Такие наночастицы сохраняют специфичность родительских антител и нацелены на раковые клетки лиганд-зависимым образом. Мы демонстрируем биосовместимость наночастиц и их применимость in vivo.

Иммуноглобулины человека в водном растворе с рН, который ниже изоэлектрической точки белка, были кратковременно нагреты, охлаждены и стабилизированы. Наночастицы были относительно монодисперсными, гидродинамический диаметр составлял 84±8 нм. Мы выбрали рН 5,0 и время инкубации 1 мин в качестве сбалансированных условий. Однако время нагрева, а также рН повлияли на размер наночастиц. Таким образом, синтез контролировался по размеру. Кроме того, наночастицы продемонстрировали почти сферическую геометрию, согласно анализу SEM-изображения (растровый/ сканирующий электронный микроскоп). Мы измерили выход синтеза с помощью гравиметрического анализа - около 11% и анализа ВС А (бицинхониновая кислота) - около 15%. Мы предположили, что анализ ВСА завысил выход, такой эффект был продемонстрирован для наночастиц с низким содержанием сшитых белков. Наконец, STF является воспроизводимым синтезом, относительное стандартное отклонение гидродинамических диаметров было рассчитано как 10% (n=10). Наконец, мы изучили IgNPs с помощью анализа ELISA (иммуноферментный анализ) и обнаружили, что наночастицы все еще распознаются антивидовыми антителами. Таким образом, мы пришли к выводу, что иммуноглобулины, образованные наночастицами, не были полностью денатурированы и, возможно, способны проявлять надлежащее сродство и специфичность.

Для изучения способности наночастиц взаимодействовать со специфическими лигандами мы синтезировали наночастицы (Т₁₀₀ -IgNPs), полученные из одобренного FDA трастузумаба моноклонального антитела против рецептора HER2/neu. Кроме того, мы синтезировали наночастицы, полученные из различных смесей иммуноглобулинов человека/трастузумаба (Т _х -IgNPs, х - фракция трастузумаба).

Мы изучили взаимодействия Тх -IgNPs с клеточными линиями SKBR3 (сверхэкспрессия HER2/neu) и СНО (отрицательный контроль) с использованием визуализации проточной цитометрии. Скрининг показал, что даже Т₁₀ -IgNP по-прежнему обладают высокой специфичностью. Этот результат показывает, что STF может быть применен для создания/ разработки наноагентов, нацеленных на многие лиганды, и позволяет сократить использование ключевых антитела. К счастью, на сегодняшний день многие терапевтические антитела клинически одобрены и коммерчески доступны, все они могут быть использованы для разработки специфически нацеленных наноагентов на основе иммуноглобулинов. Мы хотели бы отметить, что сыворотка пациентов может использоваться в качестве источника иммуноглобулинов. Такая стратегия может быть применена для разработки персонализированной наномедицины.

Нагретые белки теряют нативную конформацию и имеют тенденцию к агрегации. Однако агрегация, вызванная денатурацией, может существенно не влиять на сродство иммуноглобулинов из-за различных температур денатурации домена. В частности, домен C_H2 (часть области Fc) имеет значительно более низкую температуру перехода, чем домены области Fab. Кроме того, кислотные условия могут стабилизировать домены V_H и V_L (части области Fab). Авторы не видят препятствий для применения STF для создания наночастиц на основе других белков. Мы считаем, что белок должен иметь функциональный домен и, по крайней мере, один менее термостойкий домен, который становится «липким» при нагревании и может способствовать образованию наночастиц. Стоит отметить, что белок может быть тонко настроен с помощью подходов белковой инженерии. Оптимизированные или химерные белки могут образовывать наночастицы в особо мягких условиях.

Устойчивость синтеза IgNP можно количественно оценить с использованием проверенного десятилетиями показателя Е-фактор, который представляет собой отношение массы отходов к полученному продукту. Таким образом, чем меньше значение Е-фактора, тем больше устойчивым является процесс. Ожидается, что значения Е-фактора для синтеза наночастиц будут находиться в диапазоне от 10² до 10⁶. Однако такие огромные значения Е-фактора относятся к методам изготовления нефункционализированных и нецелевых наночастиц, например, золота, кремнезема и т.д. В отличие от этого, STF демонстрирует чрезвычайно низкое воздействие на окружающую среду со значением коэффициента 16,9 (подробности расчета приведены во вспомогательной информации). Такое сравнение показывает, что STF является уникальным методом получения целевых наночастиц с крайне низким воздействием на окружающую среду.

Быстрое термическое образование (swift thermal formation - STF) позволяет синтезировать наночастицы на основе иммуноглобулинов и контролировать их свойства. Наночастицы сохраняют сродство к фракциям иммуноглобулинов. Способ также может быть применим для синтеза гибридных наночастиц без дополнительных химических модификаций. Наноагенты специфическим образом взаимодействуют с рецепторами клеток, не обладают токсичностью и подходят для применения in vivo. Кроме того, мы предполагаем, что STF позволяет синтезировать наночастицы из материалов пациентов и это может стать прорывом в области персонализированной медицины. Рассчитанный Е-фактор доказывает, что STF оказывает впечатляюще низкое воздействие на окружающую среду по сравнению с современными технологиями синтеза наноматериалов. Таким образом, STF является перспективной и экологически чистой синтетической стратегией, которая может применяться во многих биомедицинских областях благодаря своей гибкости и биобезопасность.

Затем, подобные частицы были синтезированы с использованием других белков - альбумина, трансферрина, овальбумина и т.д.

Затем, трансфецирующие агенты были синтезированы с помощью описанного метода, но с добавлением полиэтиленимина (линейного или разветвленного) и разичных нуклеиновых кислот: мРНК, плазмидной ДНК, кДНК, антисенс-олигонуклеотидов, siRNA. Оказалось, что получаемые наночастицы эффективно трансфецируют различные клетки - мышиные, человеческие линии, такие как: SKBR-3, SKOV-3, СНО, В16 (в т.ч. B16-F10), СТ26 (см. Примеры 1-13).

Влияние состава - подбор условий (рН, соль).

В одном воплощении метода для получения наноагентов (частиц) выбирают рН раствора, а также ионную силу раствора. Изменения рН раствора добиваются, например, путем титрования раствора нужным количеством таких сильных кислот как соляная, серная, азотная и др., сильных щелочей - гидроксид натрия, гидроксид калия, или слабых кислот - угольной, уксусной и др., или слабых щелочей - гидроксид аммония и др. Ионную силу изменяют (доводят) путем, например, добавления (титрования) различных солей сильных и слабых кислот и щелочей, например, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат аммония, хлорид аммония и др.

Кроме того, в одном воплощении метода рН и концентрацию раствора белка доводят до нужных значений с помощью добавления к раствору белка буферного раствора или непосредственна за счет растворения белка в буферном растворе.

Однако, параметр рН и ионной силы - это взаимосвязанные параметры, обоюдно влияющие на параметры получаемых частиц. Как показано в Примерах, для таких белков как альбумин, иммуноглобулин, овальбумин, и др. - чем выше рН, тем больше ионной силы (соли) требуется для генерации частиц.

Кросс-сшивка

В одном воплощении метода, полученные частицы кросс-сшивают для обеспечения большей стабильности частиц с точки зрения дезинтеграции (растворения за счет перехода индивидуальных белковых молекул из наночастиц обратно в раствор; или за счет деградации различными ферментами организма (например, протеазами) или клеток или иных биологических систем).

В одном воплощениии метода для кросс-сшивки наночастиц, их смешивают с бифункциональными кросс-линкерами. Это может быть глутаровый альдегид, формальдегид, диглицидиловый эфир, генипин и т.п. В одном воплощении метода, используют такой кросс-линкер, который оставляет частицы или делает их высокоспецифичными с точки зрения распознавания/связывания со своей биологической мишенью. В частности, кросс-сшивка формальдегидом или диглицидиловым эфиром предпочтительнее использования глутарового альдегида, т.к. как правило позволяет добиться более специфичных частиц. В то же время, для таких задач как неспецифическая трансфекция клеток генетическим материалом предпочтительно использовать кросс-сшивающий агент, который приводит не к избирательности частиц, а наоборот позволяет им высокоэффективно связываться с различными мишенями. Так, например, глутаровый альдегид приводит к образованию оснований Шиффа, которые обладают частичным положительным зарядом, а потому будут эффективно выполнять задачу связывания ДНК (которая заряжена отрицательно) для целей доставки генетического материала в клетки.

Дополнительные компоненты:

Как уже было упомянуто выше, помимо белковых молекул, реакционная смесь может содержать другие вещества и компоненты - буферные соли, кислоты, щелочи, различные терапевтические, диагностические наночастицы и молекулы. Такими частицами могут быть золотые наночастицы, наночастицы магнетита, полимерные частицы и пр. А молекулы могут быть как макромолекулярные, так и низкомолекулярными - растворители (диметилсульфоксид, диметилформамид, ацетон, этанол и т.п.), флуорофоры (родамин, флуоресцеин), фотосенсибилизаторы, цитостатики и цитотоксические вещества - доксорубицин, паклитаксел и т.п.

Помимо того, что упомянутые наночастицы или молекулы добавляют для их инкапсуляции и загрузки в белковые наночастицы (о чем будет сказано подробнее ниже), в одном воплощении, данные частицы и молекулы добавляют для обеспечения растворимости, стабильности других компонент реакционной смеси. Например, для создания высокой концентрации красителя орсеина в реакционной смеси, орсеин предварительно растворяют в ДМСО и этот раствор уже добавляют в реакционную смесь.

Кроме того, в одном воплощении метода также используют ПАВы и другие стабилизаторы эмульсий и т.п., добавляя их в реакционную смесь. Так, например, можно добиться получения стабильных частиц в тех комбинациях рН и ионной силы, где при обработке излучением образуется белковые макроагрегаты. С одной стороны, как было отмечено выше, это имеет существенные недостатки перед системами, свободными от использования ПАВ. С другой стороны, этот метод позволяет получать частицы в тех рН, где могут быть намного более растворимы или стабильные лекарственные молекулы терапевтической нагрузки.

Нагрузка

Описанными способами можно эффективно загружать различные агенты. Во-первых, это могут быть наночастицы такие как золотые наночастицы, магнитные наночастицы, другие кристаллические частицы, полимерные наночастицы и микрочастицы, квантовые точки, наноалмазы, нанофосфоры, нанорубины. Кроме того, это могут быть различные молекулы, малые молекулы (родамин, флуоресцеин и т.п.), фотосенсибилизаторы, цитостатики и цитотоксические вещества (доксорубицин, паклитаксел, даунорубицин, и другие).

Способ загрузки

Кроме того, в одном воплощении метода можно получать белковые наночастицы, нагруженные различными терапевтическими агентами. В одном воплощении метода раствор или суспензию терапевтического агента добавляют в реакционную смесь до облучения. При этом достигается крайне высокая эффективность загрузки терапевтического агента в белковую матрицу наночастицы. Важно, что терапевтическоий агент может быть растворен либо ресуспендирован в дополнительных растворителях таких как этанол, ацетон, диметилсульфоксид, диметилформамид. Добавление подобного рода растворителей либо не мешает генерации наночастиц, либо требует малого изменения других параметров реакционной смеси таких как рН, ионная сила и режимов облучение микроволновым излучением. Это дает возможность использовать как сильно гидрофобные терапевтические агенты, так и гидрофильные, и амфифильные. В случае использования наночастиц в качестве терапевтического агента и/или нагрузки создаваемых частиц, они также могут быть ресуспендированы в любом подходящем растворителе. Изобретение позволяет существенно улучшить параметры нагрузки белковых наночастиц за счет использование водного раствора как основной среды, в которой происходит синтез. В отличие от коацерватного синтеза белковых наночастиц, водная среда вокруг получаемых наночастиц препятствуют выходу гидрофобных терапевтических агентов из объема наночастиц. Отметим, что в коацерватном методе синтеза белковых наночастиц высокое содержание более гидрофобных растворителей (этанол, ацетон), наоборот, способствует плохому включению гидрофобного терапевтического агента в матрицу получаемых наночастиц, так как сродство такого агента к раствору получается больше, чем к белковой матрице. Наоборот, генерация белковых наночастиц в рамках предлагаемого изобретения лишена такого недостатка. А именно гидрофобный терапевтический агент предпочитает активнее включаться в белковую матрицу наночастицы, чем оставаться в растворе.

Кроме того, в одном воплощении метода терапевтический агент может быть включен (инкапсулирован) в уже полученные наночастицы путем сорбции, основанной на электростатическом, гидрофобно-гидрофильном, координационным или ином взаимодействии.

Кроме того, в одном воплощении метода терапевтический агент может быть присоединен к сформированным белковом наночастицам за счет ковалентной или не ковалентной конъюгации. В таком случае для высвобождения данного терапевтического агента требуется использование известных в литературе приемов обратимой конъюгации. То есть могут быть использованы различные лабильные связи, которые тем или иным способом разрушаются для высвобождения терапевтического агента.

Количество нагрузки

Фармакологически активный агент(ы) могут присутствовать в широком диапазоне концентраций в композиции изобретения, как определено конечными применениями композицией изобретения. Например, фармакологически активный функциональный агент (агенты) может присутствовать в составе изобретения в диапазоне: от примерно 0.0001% до примерно 95% массы в единице объема, по результатам измерения в смеси перед выпариванием и лиофилизацией. В одном варианте осуществления, когда фармакологически активным агентом является паклитаксел, концентрация фармакологически активного агента в органическом растворителе (растворителях) (т.е. перед добавлением любых других необязательных компонентов смеси) может находиться в диапазоне от примерно 0,001 мг/мл до примерно 1000 мг/мл.

Можно включить каждое из активных веществ, перечисленных в приведенном выше списке активных агентов в матрицу частиц белковой системы-носителя. Однако, из-за различных физико-химических свойств активных ингредиентов (например, растворимость, изотермы адсорбции, связывание с белками плазмы, значения pK) для конкретного лекарственного средства может потребоваться оптимизировать процесс изготовления лекарственно-содержащих наночастиц.

Кроме того, в одном воплощении изобретения, используют функциональное агент, являющийся ионом, заряженным веществом, заряженной молекулой или молекулами (и т.п.) в совокупности с хелатирующим агентом (хелатором). Например, в одном воплощении изобретения для эффективного включения ионов железа может быть использован хелатор дефероксамин (Deferoxamine), для включения в до наночастицы ионов гадолиния используют DTPA или другой хелатор.

Соответственно, при добавлении нуклеиновых кислот и полиэтиленимина в вышеописанные реакции, происходит формирование сложномолекулярных конструкций на основе белков.

Далее настоящее изобретение будет подробно описано в сочетании со следующими примерами, чтобы специалисты в данной области могли лучше понять настоящее изобретение, при этом, настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами.

Осуществление изобретения

Пример 1. Синтез наночастиц, состоящих из бычьего сывороточного альбумина (БСА), мРНК флуоресцентного белка GFP и полиэтиленимина (ПЭИ). Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 10 г/л.,

2) 350 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 10 мкг/мл мРНК флуоресцентного белка GFP

инкубируют 3 минуты,

затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 95 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед),

затем, добавляют к смеси 10 мкл 1% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 1-12 часов, затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 2. Синтез наночастиц, состоящих из бычьего сывороточного альбумина (БСА), мРНК флуоресцентного белка RFP и полиэтиленимина (ПЭИ). Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 3 г/л.,

2) 350 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 50 мкг/мл мРНК флуоресцентного белка RFP,

инкубируют 5 минут,

затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 95 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед),

затем, добавляют к смеси 10 мкл 10% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 1-12 часов,

затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 3. Синтез наночастиц, состоящих из бычьего сывороточного альбумина (БСА), мРНК Firefly люциферазы и полиэтиленимина (ПЭИ). Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 1 г/л.,

2) 350 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 0.1 мкг/мл мРНК Firefly люциферазы,

затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 95 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед),

затем, добавляют к смеси 10 мкл 0.1% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 1-12 часов,

затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 4. Синтез наночастиц, состоящих из бычьего сывороточного альбумина (БСА), плазмидную ДНК, кодирующую GFP или RPF и полиэтиленимина (ПЭИ). Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 3 г/л.,

2) 350 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 10 мкг/мл плазмидную ДНК, кодирующую GFP или RPF,

инкубируют 30 минут,

затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 95 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед), затем, добавляют к смеси 10 мкл 0.1% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 1-12 часов,

затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 5. Синтез наночастиц, состоящих из бычьего сывороточного альбумина (БСА), плазмидную ДНК, кодирующую люциферазу Nanoluc и полиэтиленимина (ПЭИ). Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 10 г/л.,

2) 350 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 0.1 мкг/мл плазмидную ДНК, кодирующую люциферазу Nanoluc,

инкубируют 60 минут,

затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 95 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед),

затем, добавляют к смеси 10 мкл 10% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 1-12 часов,

затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 6. Синтез наночастиц, состоящих из гамма-иммуноглобулина, полиэтиленимина (ПЭИ), мРНК или плазмидной ДНК. Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора человеческого гамма-иммуноглобулинав концентрации 10 г/л.,

2) 350 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 0.1-100 мкг/мл (мРНК флуоресцентного белка GFP, мРНК флуоресцентного белка RFP, мРНК Firefly люциферазы или плазмидную ДНК, кодирующие GFP, RPF или люциферазу Firefly), затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 45-90 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед),

затем, добавляют к смеси 10 мкл 0.1% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 12 часов,

затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 7. Синтез наночастиц, состоящих из бычьего сывороточного альбумина (БСА), мРНК Firefly люциферазы и полиэтиленимина (ПЭИ) без кросс-сшивки. Последовательно смешивают:

1) 100 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 0.5-10 г/л.,

2) 100 мкл раствора молекул нуклеиновых кислот в концентрации 0.1-100 мкг/мл мРНК Firefly люциферазы, затем быстро добавляют 50 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 95 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед), затем добавляют 250 мкл 2-кратного буфера для трансфекции.

Пример 8. Синтез наночастиц, состоящих из гамма-иммуноглобулина, полиэтиленимина (ПЭИ), антисенс-ДНК-олигонуклеотидов. Последовательно смешивают:

1) 350 мкл раствора человеческого гамма-иммуноглобулинав концентрации 10 г/л.,

2) 350 мкл раствора антисенс олигонуклеотида 3'-TACGTTTGCCTTCTG-5' или 3'-TAGGTTTACCTTCTG-5' для подавления экспрессии Firefly люциферазы в концентрации 0.5 ммоль/л,

затем быстро добавляют 300 мкл раствора полиэтиленимина в концентрации 0.05-3 г/л, и быстро нагревают полученную смесь до 45-90 градусов, и инкубируют 3 минуты и остужают смесь (помещая пробирку в лед),

затем, добавляют к смеси 10 мкл 0.1% формальдегида, формалина или диглицидилового эфира полиэтиленгликоля, инкубируют 12 часов,

затем трижды отмывают полученный трансфекционный агент центрифугированием и переводят в финальный буфер для трансфекции.

Пример 9. Трансфекция клеток SKBR3 синтезированным трансфецирующим агентом.

За день до проведения процедуры трансфекции (не менее 12 часов, но не более 24) подготовить клеточные культуры (НЕК293, SKBR3 или др.). Клетки рассеять планшете с необходимым количеством лунок, при этом, количество клеток должно быть подобрано таким образом, чтобы на момент трансфекции конфлюентность составляла 50-80%, (избегать формирования монослоя, это может негативно отразиться на эффективности трансфекции). Непосредственно перед проведением трансфекции подготовить трансфецирующий агент из Примеров 1-8, ресуспендированный в 50-100 мкл PBS и использовать для трансфекции. Для проведения трансфекции можно прилить полученную суспензию частиц непосредственно в культурную среду либо ресуспендировать в 500 мкл культуральной среды (тип среды зависит от культуры клеток) и прилить к клеткам, предварительно удалив старую культуральную среду. Через 10 мин - 12 часов, отмыть свободные частицы агента. Регистрировать результат трансфекции с помощью планшетного спектрофлуориметра, микроскопа или ПЦР.

Пример 10. Трансфекция клеток СНО синтезированным трансфецирующим агентом.

За день до проведения процедуры трансфекции (не менее 12 часов, но не более 24) подготовить клеточные культуры СНО. Клетки рассеять планшете с необходимым количеством лунок, при этом, количество клеток должно быть подобрано таким образом, чтобы на момент трансфекции конфлюентность составляла 50-80%, (избегать формирования монослоя, это может негативно отразиться на эффективности трансфекции). Непосредственно перед проведением трансфекции подготовить трансфецирующий агент из Примеров 1-8, ресуспендированный в 50-100 мкл PBS и использовать для трансфекции. Для проведения трансфекции можно прилить полученную суспензию частиц непосредственно в культурную среду либо ресуспендировать в 500 мкл культуральной среды (тип среды зависит от культуры клеток) и прилить к клеткам, предварительно удалив старую культуральную среду. Через 10 мин - 12 часов, отмыть свободные частицы агента. Регистрировать результат трансфекции с помощью планшетного спектрофлуориметра, микроскопа или ПЦР.

Пример 11. Системная доставка нуклеиновых кислот трансфецирующим агентом.

Вводили внутривенно трансфецирующий агент из Примеров 1-8 в мышь в дозе 100-3000 мг/мышь. Регистрировали результат трасфекции с помощью оптической (флуоресцентной/люминесцентной томографии, ПЦР, планшетного спектрофулориметра) in vivo или ex vivo спустя 24 часа - 7 дней. Максимальная эффективность трансфекции достигается в легких.

Пример 12. Местная доставка нуклеиновых кислот трансфецирующим агентом.

Вводили подкожно или внутримышечно трансфецирующий агент из Примеров 1-8 в мышь в дозе 100 мкг.Регистрировали результат трасфекции с помощью оптической (флуоресцентной/люминесцентной томографии, ПЦР, планшетного спектрофулориметра) in vivo или ex vivo спустя 24 часа - 7 дней.

Пример 13. Внутриопухолевая доставка нуклеиновых кислот трансфецирующим агентом.

Вводили внутриопухолево трансфецирующий агент из Примеров 1-8 в мышь в дозе 100 мкг. Регистрировали результат трасфекции с помощью оптической (флуоресцентной/люминесцентной томографии, ПЦР, планшетного спектрофулориметра) in vivo или ex vivo спустя 24 часа - 7 дней.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение раскрывает способ создания агентов для трансфекции и генотерапевтических препаратов. Наночастицы согласно настоящему изобретению состоят из белковых молекул (иммуноглобулин или трансферрин) и полиэтиленимина (ПЭИ); и включают нуклеиновые кислоты (НК) в качестве полезной нагрузки. Способ получения согласно настоящему изобретению включает стадии нагрева раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, полиэтиленимин и белок, и последующего кратковременного нагрева полученной смеси до температуры в диапазоне от 45 до 99°С. Изобретение также может быть применимо в различных областях медицины при получении наноформ лекарственных препаратов. 28 з.п. ф-лы, 3 ил., 13 пр.

1. Способ синтеза трансфецирующего наноагента, состоящего из белковых молекул, нуклеиновых кислот (НК) и полиэтиленимина (ПЭИ), характеризующийся тем, что он включает стадии:

1) приготовления раствора, содержащего НК, ПЭИ и белок, и

2) последующего нагрева полученного раствора до температуры в диапазоне от 45 до 99°C;

отличающийся тем, что упомянутый белок является иммуноглобулином или трансферрином.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно включает шаг инкубации белковых молекул, НК и ПЭИ при температуре от 4 до 40°C, причем упомянутая стадия инкубации предшествует упомянутому нагреву.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что он дополнительно включает шаг инкубации раствора белковых молекул и ПЭИ при температуре от 4 до 40°C и дополнительный шаг добавления к полученному раствору упомянутой НК.

4. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят при температуре от 40 до 45°C.

5. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят при температуре от 45 до 55°C.

6. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят при температуре от 55 до 75°C.

7. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят при температуре от 75 до 95°C.

8. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 30 с до 2 мин.

9. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 2 с до 4 мин.

10. Способ по п. 1, в котором упомянутое нагревание проводят в течение от 4 с до 6 мин.

11. Способ по п. 1, в котором после упомянутого нагрева полученную смесь остужают до комнатной температуры с помощью метода активного охлаждения.

12. Способ по п. 1, в котором после упомянутого нагрева раствора дополнительно проводят его инкубацию с раствором кросс-линкера.

13. Способ по п. 1, в котором после упомянутого нагрева раствора дополнительно проводят его инкубацию с раствором формальдегида при конечной концентрации формальдегида не более 0,1% в течение ночи при комнатной температуре.

14. Способ по п. 1, в котором для облегчения обнаружения частиц in vitro и in vivo в полученную смесь добавляют водный раствор эфира флуорофора.

15. Способ по п. 1, в котором НК является матричной РНК.

16. Способ по п. 1, в котором НК является плазмидной ДНК.

17. Способ по п. 1, в котором НК является линейной двуцепочечной ДНК.

18. Способ по п. 1, в котором НК является линейной одноцепочечной ДНК.

19. Способ по п. 1, в котором ПЭИ является линейным.

20. Способ по п. 1, в котором ПЭИ является разветвленным.

21. Способ по п. 1, в котором упомянутый белок является смесью нескольких белков.

22. Способ по п. 1, в котором молекулы упомянутого белка ковалентно сшиты с упомянутыми молекулами ПЭИ.

23. Способ по п. 1, в котором в упомянутый раствор добавляют электролит для увеличения ионной силы раствора.

24. Способ по п. 23, в котором упомянутый электролит является хлоридом натрия.

25. Способ по п. 1, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pI от 3 до 7.

26. Способ по п. 1, в котором упомянутый белок имеет изоэлектрическую точку в диапазоне значений pI от 7 до 11.

27. Способ по п. 1, в котором после шага нагревания обрабатывают реакционную смесь ультразвуком.

28. Способ по п. 1, в котором упомянутый гамма-иммуноглобулин является антителом против молекулярной или клеточной мишени.

29. Способ по п. 1, в котором упомянутый гамма-иммуноглобулин является противоопухолевым антителом.