Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, а именно для повышения всхожести семян в растениеводстве.
Все организмы в природе находятся в условиях постоянного взаимодействия между собой. Семена, попадая в почву, подвергаются воздействию микроорганизмов, многие из которых способны выступать в качестве защитника от возбудителей болезней растений, а также стимулировать ростовые свойства растений. Однако не малую роль играют и внешние факторы химической природы, в частности наличие или отсутствие важных микро- и макроэлементов.
В патенте RU 2689530 С2 описан штамм бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis, проявляющий противомикробную и/или противогрибковую активность и активность, стимулирующую рост растений. Указанный штамм имеет депонирован в коллекции типов микробных культур (MTCС) под номером 5674 в IMTECH, Chandigarh, India. В патенте также предложен экстракт, обладающий противомикробной и/или противогрибковой активностью и полученный с применением указанного штамма, а также композиция, включающая штамм бактерии Bacillus subtilis ssp. shriramensis и один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из противомикробного агента, противогрибкового агента, стимулирующего рост растения агента и их комбинаций, где композиция обладает противомикробной и/или противогрибковой активностью и активностью, стимулирующей рост растений, при концентрации штамма от 5×105 до 5×107 КОЕ/мл и при концентрации от 4 до 20 мкг/мкл экстракта. Где в качестве носителя использованы КМЦ, карбендазим либо почва, содержащая смесь перлита сфагнового мха и вермикулита. Группа изобретений может быть использована для обработки против различных патогенных грибков и/или бактерий и стимуляции роста растений. Преимущества предложенного изобретения прослеживается в широком ассортименте возможных эффектов, например противогрибковых, противобактериальных, амилолитических и стимулирующих рост растений.
Однако есть несколько ограничений: новизна штамма и наличие его только в зарубежной коллекции ограничивает его доступность для промышленного применения в России; предложенные композиции содержат более трех компонентов, что увеличивает количество стадий производства.
Задача изобретения заключается в разработке способа получения композиции на основе отечественного штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и (СаН2РО4)2⋅Н2О.
Технический результат - способ позволяет получить композицию, в которой использование однозамещённого фосфорнокислого кальция Са(Н2РО4)2⋅Н2О в качестве компонента композиции позволяет придать ей свойства фосфорного удобрения, т.к. в процессе своей жизнедеятельности, штамм Bacillus subtillis ВКМ В-3728D способен растворять нерастворимый Са(Н2РО4)2⋅Н2О, что обеспечивает достижение всхожести семян при сниженном содержании штамма в композиции. Кроме того, неожиданно выяснилось, что Ca(H2PO4)2⋅H2O, обладающий способностью выступать в качестве носителя микробных клеток и их метаболитов, защищает Bacillus subtilis ВКМ В-3728D от потери жизнеспособности при лиофилизации и увеличивает срок хранения штамма, т.к. численность колониеобразующих единиц штамма в композиции через 12 месяцев выдержки при стандартных условиях выше, чем в чистой культуре.
Таким образом, композиция, полученная по предложенному способу, может быть использована для использования в растениеводстве.
Бактерии Bacillus subtillis широко распространены в качестве компонентов биопрепаратов - средств защиты растений, пробиотиков, или кормовых добавок, и в качестве продуцентов ферментов. Кроме того, они являются типичными почвенными представителями микрофлоры.
Штамм Bacillus subtilis КЕ1, предлагаемый для использования в заявленной композиции, зарегистрирован во всероссийской коллекции микроорганизмов 07.06.2023 г. под номером ВКМ В-3728D, выделен из почвы Белгородской области методом серийных разведений на питательный агар следующего состава: пептон - 30 г; агар - 1,5 г, вода водопроводная - 1000 мл.
Культуральные и морфологические свойства штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D
Палочковидные грамположительные подвижные спорообразующие бактерии
Физиолого-биохимические свойства штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D
Штамм является факультативным аэробом и обладает протеолитической, целлюлолитической, липолитической, амилолитической, каталазной активностью. Способен выделять аммиак. Тест на наличие нитратредуктазы был положительным, что свидетельствует о способности культуры к азотфиксации.
Штамм использует D-глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, сорбит, тирозин, фенилаланин, дегидроксифенилаланин, изолейцин и лизин. Из углеводов сахарозу, лактозу, D-фруктозу и D-глюкозу, а из солей органических кислот - цитрат и ацетат натрия.
Способ получения композиции на основе Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O включает в себя культивирование суточной культуры клеток штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D до концентрации не менее 1⋅109 КОЕ/мл, при 30°С, рН 7 и перемешивании 150 об/мин в питательной среде следующего состава: пептон - 30 г и вода- 1000 мл, затем вносят стерильный порошок Ca(H2PO4)2⋅H2O из расчета 40 г на 1 л жидкой культуры с концентрацией Bacillus subtilis ВКМ В-3728D не менее 1⋅109 КОЕ/г, продолжая перемешивание при 30°С в течение 10 минут, полученную смесь Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O замораживают при минус 40°С в течение 12 часов, после чего лиофильно высушивают в вакууме течение 17 часов до порошкообразного состояния, причем Ca(H2PO4)2⋅H2O стерилизуют путем автоклавирования при температуре 115°С в течение 30 минут.
Изобретение характеризует следующее графическое изображение.
Фиг. 1. Изменение оптической плотности, где линия 1 - оптическая плотность культуральной жидкости в ходе культивирования, а линия 2 - оптическая плотность раствора, содержащего свободный фосфат.
Способ получения композиции на основе Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O
Получают суточную культуру клеток штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и осуществляют культивирование суточной культуры, для чего суточную культуру суспендируют и вносят в питательную среду следующего состава: пептон - 30 г и вода- 1000 мл. После чего культивируют до концентрации клеток штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D не менее 1·109 КОЕ/мл, при следующих условиях: 30°С, рН среды 7, перемешивание при 150 об/мин.
Стерилизуют Ca(H2PO4)2⋅H2O путем автоклавирования при температуре 115°С в течение 30 минут.
По окончании культивирования вносят стерильный порошок Ca(H2PO4)2·H2O из расчета 40 г на 1 л. жидкой культуры с концентрацией Bacillus subtilis ВКМ В-3728D не менее 1·109 КОЕ/г, продолжая перемешивание при 30°С в течение 10 минут.
Полученную смесь Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O разливают по ёмкостям и замораживают при минус 40°С в течение 12 часов, после чего лиофильно высушивают в вакууме течение 17 часов до порошкообразного состояния.
В результате получают композицию, содержащую Bacillus subtilis ВКМ В-3728D в количестве не менее 1⋅109 КОЕ/г и Ca(H2PO4)2⋅H2O.
Определение всхожести семян среднерослого сорта пшеницы озимой
Всхожесть семян среднерослого сорта пшеницы озимой определяют следующим образом:
В каждой чашке размещают по 50 семян, предварительно обработанных в течение 60 минут:
- дистиллированной водой - контрольная серия 1;
- раствором 4% Ca(H2PO4)2⋅H2O - контрольная серия 2;
- растворами, содержащими 1·109 КОЕ/г Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, в разбавлениях 1⋅10-2, 1⋅10-3, 1⋅10-4, 1⋅10-5, 1⋅10-6, 1⋅10-7, 1⋅10-8, 1⋅10-9, 1⋅10-10 и 1⋅10-11 - контрольная серия 3;
- растворами экспериментальной композиции, содержащей 1⋅109 КОЕ/г Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O, в разбавлениях 1⋅10-2, 1⋅10-3, 1⋅10-4, 1⋅10-5, 1⋅10-6, 1⋅10-7, 1⋅10-8, 1⋅10-9, 1⋅10-10 и 1⋅10-11 - опытная серия.
Повторность опыта - 3-кратная.
Затем семена проращивают в стерильных чашках Петри на фильтровальной бумаге в термостате при температуре 20°С, в соответствии с требованиями ГОСТ 12038-84. Учет прорастания семян осуществляют на 7-е сутки.
К числу всхожих семян относят те, которые дают росток и нормально развитый корешок. При этом, всхожесть рассчитывают с использованием формулы:
Всхожесть = 
(1)
Главный корешок по длине должен быть не меньше семени, а росток - не меньше половины семени.
В полученных разбавлениях оценивают численность Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, с учетом колониеобразующих единиц в мл суспензии, или КОЕ/мл. Для этого исследуемую композицию и тест-культуру Bacillus subtilis ВКМ В-3728D высевают на чашку Петри с агаризированной питательной средой, содержащей 3% пептона, методом серийных разведений сплошным посевом, из серийных разведений отбирают аликвоту в количестве 0,1мл на чашку.
Посевы инкубируют в течение 24 часов. Через сутки выросшие колонии подсчитывают и общее количество колониеобразующих единиц рассчитывают по формуле:
(2)
где: N - численность колониеобразующих единиц. a -среднее арифметическое количества колоний в чашках; 10n - разведение; V - объем аликвоты, мл.
Пример 1
1. Подготавливают суточную культуру грамположительной бактерии Bacillus subtilis ВКМ В-3728D на плотной питательной среде, содержащей, из расчета г/л, пептон - 30,0 г, агар-агар микробиологический - 20,0 г, воду - 1 л.
2. Подготовленную культуру по п.1 отбирают микробиологической петлей и смешивают со стерильной водой в количестве 4 мл с получением оптической плотности 0,9 ОЕ при длине волны 600 нм. После чего, полученную смесь вносят в 100 мл жидкой питательной среды, содержащей 3 г пептона, и культивируют в течение 3 суток при температуре 30°C и перемешивании 150 об/мин.
3. После окончания культивирования, согласно п. 2, подготавливают однозамещённый фосфорнокислый кальций Ca(H2PO4)2⋅H2O путем стерилизации автоклавированием при температуре 115°С в течение 30 минут.
4. Получают заявленную композицию путем добавления к 100 мл культуральной жидкости Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, концентрация клеток которого не менее 1⋅109 КОЕ/мл, 40 г остывшего стерильного Ca(H2PO4)2⋅H2O.
5. Смесь перемешивают при 150 об/мин в течение 10 минут при 30°С.
6. Полученную смесь разливают в емкости для лиофилизации по 20 мл в каждую емкость.
7. Замораживают полученную смесь при минус 40°С в течение 12 часов.
8. Лиофилизируют смесь в течение 17 часов в вакууме.
В результате получают сыпучий порошок композиции, содержащей 1⋅109 КОЕ/г Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O.
Все процедуры по п.1, 2, 6, 7 и 8 повторяют для чистой культуры штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, без внесения Ca(H2PO4)2⋅H2O. В результате получают сухой порошок чистой культуры Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, с концентрацией клеток не менее 1⋅109 КОЕ/г. Этот вариант используют для сравнения всхожести семян пшеницы озимой среднерослой после обработки.
Пример 2
1. Готовят контрольные образцы 1 следующим образом: 50 семян озимой пшеницы среднерослой выдерживают в стерильной дистиллированной воде в течение 60 мин, вынимают и размещают на фильтровальной бумаге, в стерильной чашке Петри.
2. Готовят контрольные образцы 2 следующим образом: 50 семян озимой пшеницы среднерослой выдерживают в 4% растворе Ca(H2PO4)2⋅H2O течение 60 мин, вынимают и размещают на фильтровальной бумаге, в стерильной чашке Петри.
3. Готовят контрольные образцы 3 с чистой культурой Bacillus subtilis ВКМ В-3728D следующим образом: по 50 семян озимой пшеницы среднерослой выдерживают в суспензии чистой культуры Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, в следующих разбавлениях: 1⋅10-2, 1⋅10-3, 1⋅10-4, 1⋅10-5, 1⋅10-6, 1⋅10-7, 1⋅10-8, 1⋅10-9, 1⋅10-10 и 1⋅10-11.
3. Готовят опытные образцы с композицией Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O, следующим образом: по 50 семян озимой пшеницы среднерослой выдерживают в суспензии композиции в следующих разбавлениях: 11⋅10-2, 1⋅10-3, 1⋅10-4, 1⋅10-5, 1⋅10-6, 1⋅10-7, 1⋅10-8, 1⋅10-9, 1⋅10-10 и 1⋅10-11.
4. Все образцы, подготовленные в трехкратной повторности, выдерживают при 20°С в течение 7 суток. По окончании выдержки во всех образцах считают количество всхожих семян, к числу которых относят те, которые дают росток и нормально развитый корешок, т.е. главный корешок по длине должен быть не меньше семени, а росток - не меньше половины семени.
5. С использованием формулы 1 рассчитывают всхожесть образцов в каждой серии, результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Всхожесть семян озимой пшеницы среднерослой
Из таблицы 1 видно, что оптимальным вариантом разведения полученной композиции является 1⋅10-6, так как всхожесть превышает контрольный вариант, в котором не было обработки, на 23%, а вариант с обработкой только Ca(H2PO4)2⋅H2O без бактерии, на 19%, тогда как для варианта с чистой культурой и контролем, различие составило 22%.
Пример 3. Оценка численности Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, с учетом колониеобразующих единиц в мл суспензии (КОЕ/мл)
1. По 0,1 г полученных по примеру 1 порошков композиции Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O и чистого штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D смешивают с 10 мл стерильного раствора 0,9% NaCl. Перемешивают.
2. Соблюдая асептические условия, 1 мл полученных взвесей по п. 1 переносят в пробирку с 9 мл 0,9% NaCl. Перемешивают.
3. Отбирают 1 мл с пробирки, полученной по пункту 2, и переносят в новую пробирку с 9 мл 0,9% NaCl. Перемешивают и повторяют процедуру до 10 пробирки.
4. Из каждой пробирки отбирают 100 мкл и пассируют на плотной питательной среде с использованием шпателя Дригальского. Процедуру проводят в трех повторах.
5. Посевы инкубируют при 30°С в течение 48 часов.
6. Подсчитывают выросшие колонии и затем рассчитывают численность колониеобразующих единиц по формуле 1.
7. Полученные порошки заявленной композиции и чистого штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D выдерживают при 25°С в термостате в течение 12 месяцев и повторяют процедуры по пунктам 1-5, после чего подсчитывают выросшие колонии и рассчитывают численность колониеобразующих единиц по формуле 1.
8. Сравнение полученных результатов по определению численности колониеобразующих единиц Bacillus subtilis ВКМ В-3728D с учетом колониеобразующих единиц в мл суспензии по п. 6 и 7 приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Численность Bacillus subtilis ВКМ В-3728D (КОЕ/мл)
Таким образом, численность колониеобразующих единиц композиции Bacillus subtilis ВКМ В-3728D с Са(Н2РО4)2⋅Н2О через 12 месяцев выдержки при стандартных условиях выше, чем в чистой культуре.
Пример 4. Оценка влияния Bacillus subtilis ВКМ В-3728D на растворимость Са(Н2РО4)2⋅Н2О, что обеспечивает достижение всхожести семян при сниженном содержании штамма в композиции
1. Полученный порошок композиции Bacillus subtilis ВКМ В-3728D с Са(Н2РО4)2⋅Н2О по примеру 1 в количестве 0,1 г вносят в 200 мл жидкой питательной среды, содержащей (масс%) пептона - 2,0, сахарозы - 4,0, а остальное - вода.
2. Посевы инкубируют при 30°С с перемешиванием при 150 об/мин. Каждые 4 часа оценивают оптическую плотность в 1 мл культуры, с использованием спектрофотометра при длине волны 600 нм.
3. Каждые 4 часа оценивают содержание свободных фосфатов в культуральной жидкости. Для этого, отбирают по 1 мл культуры в 4 повторах и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 10 минут.
4. Свободный фосфат в надосадочной жидкости, полученной по пункту 3, определяют с использованием метода Кирсанова. Для этого 6 г молибденовокислого аммония растворяют в 200 мл дистиллированной воды при постоянном нагревании. После того, как раствор остынет, вносят 1 г аскорбиновой кислоты и дают настояться в течение 30 минут. Полученный раствор в объеме 1 мл приливают к такому же количеству исследуемого образца, выдерживают в течение 15 минут и измеряют оптическую плотность при длине волны λ = 710 нм. В качестве холостой пробы используют смесь молибденовокислого аммония с аскорбиновой кислотой без фосфатов. О высвобождении свободного фосфата судят по изменению оптической плотности.
5. Наблюдают изменения оптической плотности культуры и растворов свободного фосфата.
6. На фиг. 1 видно, что повышение содержания свободного фосфата, начиная с 8 часа культивирования, что подтверждает то, что по мере роста культуры Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, нерастворимый Ca(H2PO4)2⋅H2O растворяется, а фосфат высвобождается.
Таким образом, заявленный способ получения позволяет получить композицию на основе штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O, обладающую свойствами фосфорного удобрения, что обеспечивает достижение всхожести семян при сниженном содержании штамма в композиции. А также увеличение срока хранения клеток штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D, т.к. численность колониеобразующих единиц штамма в композиции через 12 месяцев выдержки при стандартных условиях выше, чем в чистой культуре.
Таким образом, поставленная задача решена, и технический результат достигнут - заявленная композиция может быть использована в растениеводстве.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Штамм бактерий Acinetobacter johnsonii A1 для повышения урожайности зерновых культур | 2021 |
|
RU2760335C1 |
| Композиция с противогрибковой активностью | 2023 |
|
RU2827161C1 |
| Штамм Streptomyces sp. YVZ020 ВКМ Ас-3001D - продуцент метаболитов, обладающих фитостимулирующим и фитозащитным действием против возбудителя бактериоза Clavibacter michiganensis | 2024 |
|
RU2840021C1 |
| КОМБИНИРОВАННЫЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS (ВАРИАНТЫ) ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ, СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА (ВАРИАНТЫ) И ШТАММ BACILLUS SUBTILIS (NATTO), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ К ПРЕПАРАТУ | 2017 |
|
RU2675934C2 |
| СМЕСЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ОБЛАДАЮЩАЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКОЙ И ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2021 |
|
RU2752903C1 |
| Консорциум штаммов бактерий для очистки сточных вод от масложировых загрязнений | 2018 |
|
RU2691317C1 |
| БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ, ПОЧВЫ И ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ОТ УСТОЙЧИВЫХ К РАЗЛОЖЕНИЮ ПЕСТИЦИДОВ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2011 |
|
RU2484131C2 |
| ПРЕПАРАТ ДЛЯ БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЕПРОДУКТОВ "БИОИОНИТ" И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2013 |
|
RU2571219C2 |
| КОРМОВАЯ ДОБАВКА ПРОБИОТИЧЕСКАЯ | 2024 |
|
RU2833079C1 |
| Способ получения гранулированного биоорганоминерального удобрения на основе компоста | 2022 |
|
RU2784914C1 |
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения композиции на основе Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O, включающий культивирование суточной культуры клеток штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D в питательной среде следующего состава: пептон - 30 г и вода - 1000 мл, при 30°С, рН 7, и перемешивание 150 об/мин до концентрации не менее 1⋅109 КОЕ/мл, затем вносят стерильный порошок Ca(H2PO4)2⋅H2O из расчета 40 г на 1 л жидкой культуры с концентрацией Bacillus subtilis ВКМ В-3728D не менее 1⋅109 КОЕ/г, продолжая перемешивание 10 мин при 30°С, затем полученную смесь Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O замораживают при минус 40°С в течение 12 ч, после чего лиофильно высушивают в вакууме в течение 17 ч до порошкообразного состояния, причем Ca(H2PO4)2⋅H2O стерилизуют путем автоклавирования при 115°С в течение 30 мин. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для повышения всхожести семян в растениеводстве. 1 ил., 2 табл., 4 пр.
Способ получения композиции на основе Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O для повышения всхожести семян в растениеводстве, включающий культивирование суточной культуры клеток штамма Bacillus subtilis ВКМ В-3728D в питательной среде следующего состава: пептон - 30 г и вода - 1000 мл, при 30°С, рН 7, и перемешивание 150 об/мин до концентрации не менее 1⋅109 КОЕ/мл, затем вносят стерильный порошок Ca(H2PO4)2⋅H2O из расчета 40 г на 1 л жидкой культуры с концентрацией Bacillus subtilis ВКМ В-3728D не менее 1⋅109 КОЕ/г, продолжая перемешивание при 30°С в течение 10 мин, затем полученную смесь Bacillus subtilis ВКМ В-3728D и Ca(H2PO4)2⋅H2O замораживают при минус 40°С в течение 12 ч, после чего лиофильно высушивают в вакууме в течение 17 ч до порошкообразного состояния, причем Ca(H2PO4)2⋅H2O стерилизуют путем автоклавирования при температуре 115°С в течение 30 мин.
| НОВАЯ БАКТЕРИЯ РОДА BACILLUS И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2689530C2 |
| Способ получения гранулированного биоорганоминерального удобрения на основе компоста | 2022 |
|
RU2784914C1 |
| СРЕДСТВО ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ВСХОЖЕСТИ СЕМЯН ЗЛАКОВЫХ РАСТЕНИЙ В ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ | 2007 |
|
RU2354690C2 |
| Пусенкова Л.И | |||
| и др | |||
| Прибор для получения стереоскопических впечатлений от двух изображений различного масштаба | 1917 |
|
SU26A1 |
