Препарат бактериальный протеолитический для производства ферментированного нутового напитка Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A23L11/50 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно представляет собой новый бактериальный препарат на основе штаммов молочнокислых микроорганизмов с протеолитической активностью для использования в производстве ферментированного нутового напитка.

Известен способ производства пробиотических пептидов посредством ферментации нута, раскрытый в патенте CN 102613381 А, опубл. 01.08.2012, МПК A23J 1/14, A23J 3/14, который включает стадии погружения, измельчения, стерилизации, инокуляции, ферментации, стерилизации, вторичной инокуляции, вторичной ферментации, экстракции, разделения, очистки и сушки. В эксперименте по ферментации нута использовали Lactobacillus, Bacillus subtilis, Saccharomyces и Bacillus natto. Данный способ имеет низкую стоимость и высокую производительность.

Также из уровня техники известен способ получения препарата бактериального протеолитического для производства ферментированных мясных изделий, раскрытый в документе RU 2753890 С1, опубл. 24.08.2021, Бюл. №24, МПК C12N 1/20 (2006.01), в котором препарат представляет собой смесь штаммов молочнокислых бактерий с высоким потенциалом к протеолизу мясного сырья: Pediococcus acidilactici ВКПМ В-8902 (38), Lactobacillus curvatus ВКПМ В-8889 (1), Staphylococcus carnosus ВКПМ В-8953 (108), выделенных из сырых ферментированных колбас, взятых в равном процентном соотношении. Препарат, полученный указанным способом, способствует преобразованию компонентов мясного сырья в соединения, обуславливающие свойства продукта, цветообразованию, образованию биологически активных пептидов и повышению его пищевой и биологической ценности.

По мнению авторов, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является пробиотическая композиция на растительном сырье и способ ее получения, раскрытые в документе RU 2790676 С1, опубл. 28.02.2023, Бюл. №7, A23L 33/135 (2016.01), A23L 33/16 (2016.01), A23L 2/38 (2006.01), A23L 7/104 (2016.01), A23L 11/50 (2021.01), A23L 19/00 (2016.01). Мезофильная и/или термофильная закваска представлена по меньшей мере одним из штаммов, пригодных для использования в пищевой промышленности, из числа видов лакто/бифидо/пропионовокислых бактерий следующих родов: Aerococcus, Bifidobacterium, Carnobacterium, Enter ococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Sporolactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella, как по отдельности, так и в любом сочетании друг с другом. Растительное сырье, представляющее собой злаки, бобовые, овощи, фрукты, зеленую массу съедобных растений, включая дикоросы, и их субпродукты обогащают композицией микроэлементов, переводят в жидкую форму гидролизата, пастеризуют, вводят закваску, содержащую штаммы пищевых микроорганизмов. Это способствует образованию биологически активных веществ, в том числе пептидов.

Целью данного изобретения является разработка нового бактериального препарата, способствующего образованию биологически активных пептидов при ферментации водного экстракта бобов нута за счет интенсификации протеолиза белков нута, тем самым повышающего биологическую ценность нутового напитка.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в получении ферментированного напитка на основе бобов нута с повышенной биологической ценность за счет интенсификации протеолиза белков нута и образования биологически активных пептидов.

Технический результат изобретения заключается в повышении биологической ценности ферментированного напитка на основе бобов нута за счет образования в них биологически активных компонентов, в том числе биологически активных пептидов.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается благодаря бактериальному препарату для производства ферментированного нутового напитка, содержащему живые культуры протеолитических молочнокислых палочек, причем препарат характеризуется наличием штаммов молочнокислых палочек Limosilactobacillus fermentum SB-2 (ВКПМ В-14054) и Latilactobacillus sakei SD-8 (ВКПМ В-14053) в равном соотношении.

Штаммы Limosilactobacillus fermentum SB-2 и Latilactobacillus sakei SD-8 выделены из сыровяленой медвежатины и сыровяленой лосятины, соответственно, и идентифицированы по совокупности фенотипических, физиолого-биохимических и протеомных методов (MALDI-TOF) в ФГБОУ ВО «РОСБИОТЕХ». Штаммы депонированы в Национальный биоресурсный центр ВКПМ НИЦ «Курчатовский институт» под номерами ВКПМ В-14054 (Limosilactobacillus fermentum SB-2) и ВКПМ В-14053 (Latilactobacillus sakei SD-8), форма депонирования - национальное патентное депонирование.

Препарат бактериальный представляет собой светло-кремовый однородный сухой порошок. При микроскопировании препарат представляет смесь грамположительных коротких палочек с закругленными концами.

Пояснение изобретения сопровождается результатами протеомного исследования, направленного на определение влияния бактериального препарата на основе штаммов Limosilactobacillus fermentum SB-2 и Latilactobacillus sakei SD-8 на белковый профиль напитка, полученного на основе бобов нута.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг. 1 - одномерная электрофорегамма белкового профиля нута, ферментированного молочнокислыми микроорганизмами 36 ч. Ст., кДа - стандартный маркер Page Ruler; K - контроль, 1 - Limosilactobacillus fermentum SB-2; 2 - Latilactobacillus sakei SD-8;

Фиг. 2 - двумерный электрофорез белков экстракта нута ферментированного 36 ч: а - Limosilactobacillus fermentum SB-2; 6 - Latilactobacillus sakei SD-8;

Фиг. 3. Масс-спектры пептидов нута до ферментации, 0 ч;

Фиг. 4. Масс-спектры коротких пептидов нута, ферментированного Limosilactobacillus fermentum SB-2 (слева) и Latilactobacillus sakei SD-8 (справа), a - 24, 6 - 36 ч;

Фиг. 5. Двумерный электрофорез белков нута, ферментированного бактериальным препаратом, а - 0 ч, 6 - 36 ч.

Культурально-морфологические, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические особенности штамма Limosilactobacillus fermentum SB-2. Грамположительные короткие палочки с закругленными концами, находящиеся преимущественно в группах, гетероферментативные, способны ферментировать глюкозу, галактозу, лактозу и другие углеводы. Активность кислотообразования - 105°Т. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Штамм растет на MRS-arape + 2-4% NaCl, наблюдается слабый рост на MRS-агаре + 6,5-8% NaCl. Средняя устойчивость к 0,4% раствору фенола, 20% желчи. Оптимальная температура роста 37°С. При определении протеолитической активности, определенной методом ТНБС (2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота), выраженной в эквиваленте L-лейцина, накопление аминнного азота составило 17,35 L-лейцина, мМ. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) у штамма обнаружены гены prtM (685 п.н.) и prtB (597 п.н.), отвечающие за протеолитическую активность.

Культурально-морфологические, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические особенности штамма Latilactobacillus sakei SD-8. Грамположительные палочки с закругленными концами, расположенные по одиночке, цепочками или группами, гомоферментативные, способны ферментировать целлобиозу, фруктозу сахарозу, галактозу, мелибиозу, лактозу, глюкозу, маннозу. Активность кислотообразования - 110°Т. Штамм растет на MRS-arape +2 -4% NaCl, наблюдается слабый рост на MRS-arape + 6,5-8% NaCl. Устойчив к 0,4% раствору фенола, 20% желчи. Оптимальная температура роста 37°С. При определении протеолитической активности, определенной методом ТНБС (2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота), выраженной в эквиваленте L-лейцина, накопление аминнного азота составило 16,13 L-лейцина, мМ. При проведении ПЦР у штамма обнаружены гены prtB (597 п.н.) и prtR (1052 п.н.), отвечающие за протеолитическую активность.

Микроорганизмы, входящие в состав бактериального препарата, подавляют развитие санитарно-показательной микрофлоры за счет синтеза молочной кислоты, что увеличивает сроки годности готового продукта.

Перечисленные выше свойства микроорганизмов, входящих в состав бактериального препарата, позволяют использовать бактериальный препарат в производстве ферментированных продуктов на основе бобов нута для повышения его биологической ценности за счет интенсификации протеолиза белков нута и образования биологически активных пептидов.

Влияние микроорганизмов на белковый профиль нутового молока исследовали с помощью одномерного электрофореза. Результаты исследований представлены на фиг. 1. Были получены полосы с молекулярной массой примерно от 97 до 10 кДа. Полоса 97 кДа была отнесена к липоксигеназе (LOX) (фрагмент 1). Кроме того, предполагаемые молекулярные массы ~49, ~35, ~33, ~19 и ~15 кДа были идентифицированы как субъединицы вицилина нута (7S) (фрагмент 3 и 4), а линии фракции легумина показали сильную полосу с молекулярной массой -60 кДа (фрагмент 2). Также количественные изменения произошли в ферментном комплексе нута, а именно в нутовой липоксигеназе.

На фиг. 2. представлены результаты компьютерной денситометрии образцов двумерного электрофореза (ДЭ), которые позволили оценить эффект действия каждого штамма на количество суммарного белка по сравнению с контролем. Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что в процессе ферментации происходит расщепление белка.

Протеомное исследование влияния бактериального препарата на продукцию коротких пептидов (m/z до 6000 Да) из белков нута показало отчетливые различия в белковом спектре. В 0 ч инкубации очень мало коротких пептидов (фиг. 3), но ферментация в течение 24 ч и 36 ч приводила к образованию большого количества коротких пептидов. На фиг. 4 представлены масс-спектры коротких пептидов, полученных в результате воздействия этих двух штаммов на белки нута через 24 и 36 ч ферментации.

По результатам идентифицированы пептидные последовательности, обладающие потенциальной биологической активностью, определенной по биоинформатическим базам, которые представлены в таблице 2.

Двумерный электрофорез показал аддитивный эффект совместного применения бактерий Limosilactobacillus fermentum SB-2 и Latilactobacillus sakei SD-8, при этом большая часть белков нута подверглась деградации. Картина электрофореза штаммов показала, что молекулярная масса пептидов, полученных после ферментации, составила менее 20 кДа. Данные представлены на фиг. 5.

Ниже приведены примеры производства сухого бактериального препарата (пример 1) и его применение при производстве ферментированного нутового напитка (пример 2).

Пример 1. Для выработки сухого бактериального препарата проводят раздельное культивирование штаммов Limosilactobacillus fermentum SB-2 и Latilactobacillus sakei SD-8 на питательной среде MRS в течение 12-16 ч при температуре 37°С, а затем - совместное культивирование штаммов 50% Limosilactobacillus fermentum SB-2 и 50% Latilactobacillus sakei SD-8 в ферментере при 37°С 36 ч, смешивают бактериальные клетки с протекторной средой (обезжиренное молоко, сахароза, лимоннокислый натрий, поваренная соль, желатоза, никотиновая кислота, дистиллированная вода), замораживают при температуре минус 30-40°С в течение 4-5 ч, высушивают в лиофильной установке и упаковывают.

Бактериальный препарат содержит не менее 10⁹ КОЕ/г. Кислотность готового бакпрепарата не менее 70°Т. Бактериальный препарат используется при производстве ферментированного нутового напитка.

Пример 2. Для получения ферментированного нутового напитка нут заливают кипяченой водой температурой 30°С в соотношении 1:2 (нут: вода) и замачивают на 12 ч. Затем измельчают замоченные семена нута и смешивают их с водой в соотношении 1:3 в смесителе в течение 5 минут. Центрифугируют полученную суспензию в течение 15 минут при 4000 об/мин и пропускают через фильтр с размером пор 0,5-1 мм. Пастеризуют нутовый напиток при температуре 65°С в течение 15 минут. Затем вносят бактериальных препарат и 1% глюкозы в виде 20% раствора для стимуляции роста микроорганизмов. Ферментацию проводят при 37°С в течение 36 ч. Готовый продукт имеет приятный вкус с бобовым послевкусием и легкими цветочными нотками, кислотность продукта 85°Т. Использование разработанного бактериального препарата позволяет получать продукцию высокого качества с повышенной биологической ценностью за счет интенсификации протеолиза белков нута и образования биологически активных пептидов.

Таким образом, показана возможность направленной трансформации белков нута бактериальным препаратом на основе протеолитических молочнокислых микроорганизмов Limosilactobacillus fermentum SB-2 и Latilactobacillus sakei SD-8 для получения нутового напитка, обогащенного биологически активными пептидами.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыт бактериальный препарат для производства ферментированного напитка из нута, содержащий живую культуру протеолитических молочнокислых палочек, характеризующийся наличием штаммов молочнокислых палочек Limosilactobacillus fermentum SB-2 ВКПМ В-14054 и Latilactobacillus sakei SD-8 ВКПМ В-14053 в равном процентном соотношении. Изобретение позволяет повысить биологическую ценность ферментированного напитка на основе бобов нута за счет образования в них биологически активных компонентов, в том числе биологически активных пептидов. 5 ил., 2 табл., 2 пр.

Бактериальный препарат для производства ферментированного напитка из нута, содержащий живую культуру протеолитических молочнокислых палочек, характеризующийся наличием штаммов молочнокислых палочек Limosilactobacillus fermentum SB-2 ВКПМ В-14054 и Latilactobacillus sakei SD-8 ВКПМ В-14053 в равном процентном соотношении.