Способ импрегнации пористых материалов антибактериальными препаратами для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов Российский патент 2025 года по МПК A61L27/54 A61L27/56 A61F2/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии и регенерационной медицине, и может быть использовано для придания пролонгированной антимикробной активности пористым остеозамещающим материалам с целью применения для одномоментного замещения дефекта и создания депо антимикробных препаратов в условиях инфекционного процесса в стоматологии, травматологии и ортопедии, онкологии, челюстно-лицевой хирургии, ветеринарии.

После выполнения оперативных вмешательств по поводу травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата в ряде случаев развиваются инфекционно-воспалительные осложнения, приводящие к поражению костей и развитию остеомиелита. Известно, что антибактериальные препараты, вводимые внутривенно или перорально, не достигают терапевтических концентраций в области гнойных очагов в костной ткани [1]. Основная причина - нарушенное кровоснабжение в области остеомиелитического поражения, когда выраженные рубцы мягких тканей и костный склероз в сочетании со сформированными биопленками препятствуют достижению эффективных концентраций антибактериальных препаратов. В таких условиях при системном введении невозможно создать высокие концентрации антибиотиков в очаге инфекции, не превышая допустимые дозы препаратов и создавая тем самым риск развития нежелательных эффектов и поражения различных органов и систем. В связи с указанными фактами общепринятым является сочетанное применение системной и локальной антибактериальной терапии при лечении ортопедической инфекции.

Одним из основных условий успешного лечения инфекционного поражения костей и суставов является создание локального депо антибактериальных препаратов с возможностью поддержания длительной высокой концентрации их элюции. Для этих целей используются различные материалы-носители и способы их насыщения, однако в настоящее время все они позволяют создавать либо непродолжительную активность антибактериальных препаратов, либо требуют выполнения повторных хирургических вмешательств.

Во всем мире широко применяемым способом создания депо антибиотика в костной ткани является интраоперационное применение антибиотикосодержащего костного цемента на основе полиметилметакрилата (ПММА), что позволяет заместить костный дефект, но требует повторного вмешательства для удаления костного цемента и замещения дефекта биодеградируемым материалом. Кроме того, известно, что эффективные концентрации гентамицина при применении официнальных костных цементов сохраняются только в течение первых суток [2].

Из уровня техники известен способ дополнительного внесения в состав костного цемента различных термостабильных антибиотиков, их комбинаций, а также дополнительных антимикробных компонентов [3], что позволяет существенно продлить антимикробную активность костного цемента, но при этом требует обязательного второго оперативного вмешательства для замены костного цемента на биодеградируемый материал с целью предотвращения формирования микробных биопленок на поверхности цемента и развития рецидива инфекции. Это связано с тем, что материал на основе ПММА не способен стимулировать ангиогенез, кроме того структура цемента недостаточно пористая для остеоинтеграции, но достаточная для микробной инвазии в его толщу [3]. Еще одним недостатком данного способа является нарушение прочностных характеристик костного цемента при добавлении дополнительных антимикробных препаратов.

Проведенный патентный поиск позволил выявить группу методов создания депо антимикробных препаратов с применением различных природных (коллаген, фибрин, хитозан и др.) и синтетических (полилактид, полигликолид и др.) полимеров [4]. Подавляющее большинство этих способов изучены только экспериментально и не применяются в клинической практике. Единственным зарегистрированным медицинским изделием, используемым для лечения пациентов травматолого-ортопедического профиля, является промышленно изготовленный материал Collatamp® EG («Коллатамп® ИГ»). Это стерильный биодеградируемый материал на основе коллагеновой губки, содержащей антибиотик гентамицин, который позволяет создать локальную концентрацию препарата в области оперативного вмешательства. Длительность элюции антибиотика ,как правило, не превышает нескольких дней. Однако, материал не предназначен для создания депо антибиотика в костной ткани путем замещения дефекта в связи с отсутствием необходимых прочностных характеристик. Кроме того, в настоящее время к гентамицину фиксируется высокий уровень устойчивости микробных возбудителей.

В другом способе предлагают имплантировать коллагеновые губки, в которые заворачивают антибактериальные препараты в виде порошка. Завернутый в губку антибиотик постепенно элюирует в процессе биодеградации материала-носителя [5]. Коллагеновые губки в достаточной обеспечивают элюцию антибактериальных препаратов в течение 7-14 суток, однако, максимальные концентрации антибиотиков поддерживаются только в течение первых 48 часов [3]. Основным недостатком данного способа также является невозможность перестройки коллагеновой губки в полноценную костную ткань, а также дозированной нагрузки на конечность из-за риска перелома кости на уровне дефекта и необходимость выполнения повторного хирургического вмешательства после купирования инфекции для восполнения костного дефекта.

Еще одной группой материалов, позволяющих сформировать в костной ткани депо антибиотика, являются биодеградируемые биокомпозитные материалы на основе керамики (сульфат кальция, фосфат кальция, 3-кальцийфосфат, гидроксиапатит, коралл и их комбинации). Известен только один промышленно изготавливаемый материал зарубежного производства Osteoset (кристаллический сульфат кальция), содержащий антибиотик тобрамицин и зарегистрированный для применения в комплексном лечении пациентов с остеомиелитом. К его недостаткам можно отнести длительный период серозной экссудации в раннем послеоперационном периоде, который в значительной доле случаев ведет к развитию рецидива инфекционного процесса, а также отсутствие перестройки в костную ткань [6].

Другие биокомпозитные материалы - ReproBone (на основе гидроксиаппатита и трикальцийфосфата), Биосит (оксиды кальция, кремния, фосфора, алюминия, магния, цинка, кристаллическая фаза - карбоксигидроксиапатит (даллит) не содержат антимикробные препараты или не зарегистрированы для применения в травматологии-ортопедии. Для придания им антимикробных свойств материалы перед имплантацией в костный дефект смешивают с порошком антибиотика. Однако такой способ не дает стабильного выхода препарата, может зависеть от способа перемешивания, а самостоятельное добавление антибиотика может нарушать свойства самого материала и влиять на процесс перестройки материала в костную ткань.

Из известного уровня техники наиболее эффективными способами замещения дефектов костей является применения ауто- или аллогенной костной ткани, предварительно смешанной с антимикробными препаратами.

Аналогом настоящего способа является простое интраоперационное смешивание аутологичной или аллогенной губчатой кости с антибактериальными препаратами в виде порошка, которое обеспечивает неравномерную элюцию антибиотика до 7-16 сут по данным разных авторов [7, 8].

Известен также способ замачивания лиофилизированных аллографтов в растворах различных антибиотиков. In vitro элюция антибиотиков, в концентрации превышающей МИК для стафилококков, сохранялась до 7 суток, однако, в эксперименте in vivo антимикробная активность в отношении стафилококков сохранялась только до 3-х суток [9.]. Предлагаемый способ не предусматривает возможность последующей стерилизации материала, импрегнированного антибиотиками, для длительного хранения и включает применение препаратов, активных только в отношении стафилококков, для импрегнации только костных аллографтов.

Другим аналогом является использование ионофореза при импрегнации костной ткани, что позволило достичь высоких концентраций антибиотика и получить продолжительность антимикробной активности на протяжении 2 недель [10]. Однако применение ионофореза другими авторами показало большой разброс полученных результатов, что, по их мнению, требует проведения дальнейших исследований влияния ионофореза на свойства костной ткани и высвобождение антибиотиков [11].

Еще одним аналогом предлагаемого способа является вакуумирование для импрегнации очищенного костного матрикса лекарственными средствами [12]. Однако авторы метода изучили только факт наличия в импрегнированном образце антибиотика (ванкомицина) и не исследовали длительность его элюции, а также не предлагали импрегнировать другие остеозамещающие материалы.

Из известного уровня техники поры биокомпозитных материалов могут варьировать в диапазоне от 100 до 500 мкм, что является оптимальным для остеокондукции [13, 14]. Этот факт позволяет рассматривать в качестве материала-носителя для импрегнации лекарственными препаратами любые остеозамещающие материалы с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости (200-600мкм) [14].

Выбирая материал носителя (биологический, неорганический биодеградируемый или небиодеградируемый), антимикробные препараты с различными размерами молекул и молекулярной массы, концентрацию активного вещества в растворе, наличие или отсутствие полимерных добавок и продолжительность инкубации, можно регулировать интенсивность и продолжительность элюции активного вещества и, таким образом, адаптировать его к текущим требованиям.

В виду отсутствия в предлагаемом способе воздействия высоких температур можно рассматривать любой антимикробный препарат или их комбинацию в качестве активного вещества для импрегнации. Соответственно для насыщения материала-носителя могут быть использованы ванкомицин, гентамицин, меропенем, фосфомицин и любые другие водорастворимые антибиотики. Аналогичные характеристики требуются для биологически активных веществ. При этом спектр антимикробной активности выбранных препаратов будет определять спектр активности образцов импрегнированного материала, что позволяет персонифицировать выбор в зависимости от возбудителя инфекции.

Из уровня техники известно, что природные и синтетические полимеры, включая поливинилпирролидон (ПВП), альгинат натрия, коллаген, хитозан, широко применяются в медицине, сами по себе могут быть носителями лекарственных препаратов и обеспечивать их продленный выход из лекарственных фарм. Рассматриваемый нами как пример, ПВП часто применяют в фармацевтической промышленности. В концентрации до 5-10% помогает создавать стабильные растворы с эффективной вязкостью не более 0,01 Па*с, что не препятствует проникновению активного вещества в пористую структуру материалов и обеспечивает продленное высвобождение антибиотиков. Из уровня техники известно, что концентрация ПВП более 10% увеличивает вязкость раствора [15], что может препятствовать эффективному заполнению пор.

Также известно, что при вакуумировании раствора температурой от +2°C до +8°C, для достижения процесса закипания рекомендуемое давление должно быть на уровне 7-10 гПа (0.007-0.01 bar). Состояние раствора в стадии закипания обеспечивает наилучшее проникновение раствора внутрь пористой структуры материала и его эффективную импрегнацию.

Химические реакции, такие как гидролиз, окисление или взаимодействие компонентов раствора, при низких температурах замедлены, что помогает предотвратить деструкцию антимикробных препаратов при реализации предлагаемого способа на этапах 2 и 4, стабилизировать полученные растворы и способствовать проникновению активного вещества в пористую структуру материала-носителя.

Наиболее близкий к нашему изобретению метод (прототип) описывает получение, очистку органического материала, в частности биологическую ткань человеческого, животного или растительного происхождения, такую как кости, сухожилия, мышцы, и ее последующую импрегнацию различными антибактериальными или иными препаратами с применением вакуумирования и возможной последующей лиофилизацией и стерилизацией [16]. Однако в прототипе не рассматривается возможность импрегнации биодеградируемых или небиодергадируемых небиологических материалов для остеозамещения и не подтверждается возможность длительной элюции препарата.

Задачей данного изобретения является разработка способа импрегнации, лишенного недостатков аналогов и прототипа, который позволяет придать антибактериальные свойства не только биологическим, но и неорганическим пористым материалам, в том числе биодеградируемым и небиодеградируемым материалам с пролонгированной элюцией лекарственных препаратов.

Технический результат изобретения состоит в придании пористому биологическому, неорганическому биодеградируемому или небиодеградируемому остеопластическому материалу-носителю продленной антимикробной активности за счет элюции импрегнированного препарата с возможностью дальнейшей стерилизации полученного продукта и его длительного хранения без потери антимикробной активности для последующего применения путем одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания локального депо антимикробных препаратов.

Сущность изобретения заключается в совокупности преимуществ: применение материала-носителя, которым могут быть любые медицинские изделия и материалы с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости (100-600мкм) и предназначенные для восполнения дефектов костной ткани, применение активных веществ для растворения водой сниженной температуры, вакуумирование в условиях давления 7-10 гПа (0.007-0.01 bar) на протяжении 30 минут с момента закипания, позволяющее достичь наилучшей дегазации и обеспечивающей равномерное и глубокое проникновение раствора активного вещества в поры материала, далее воздействие пониженной температуры для предупреждения деструкции молекул антибиотиков, последующей лиофилизацией, упаковкой и стерилизацией для длительного хранения.

Технический результат достигается за счет того, что способ импрегнации пористых материалов антибактериальными препаратами для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов, включает этапы:

a) приготовление раствора антибактериального препарата на основе очищенной воды сниженной температуры от +2°C до +8°C

b) вакуумирование материала-носителя лекарственного препарата, с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600мкм и предназначенного для восполнения дефектов костной ткани, в растворе антибактериального препарата в условиях постепенно снижающегося давления 7-10 гПа на протяжении 30 минут с момента закипания раствора

c) стабилизация раствора с материалом-носителем в условиях пониженной температуры от +2°C до +8°C на 24-48 часов,

d) лиофилизация материала, полученного на этапе с)

e) стерилизация материала, полученного на этапе с).

Возможно, что пористый материал представлен лиофилизированной костью в виде в виде блоков, костной крошки или чипсов.

Возмложно, что пористый материал представлен неорганическим биодеградируемым материалом с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600 мкм, предназначенным для восполнения дефектов костной ткани.

Возможно, что пористый материал представлен неорганическим небиодеградируемым материалом с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600мкм, предназначенным для восполнения дефектов костной ткани.

Возможно, что готовят раствор из комбинации антибактериальных препаратов.

Возможно, что к очищенной воде добавляют полимер в концентрации, обеспечивающей вязкость раствора не более 0,01 Па*с, затем растворяют антибактериальные препараты

Возможно, что после этапа вакуумирования раствор с материалом-носителем помещают в условия повышенного давления до 250 000 hPa (250bar) на срок до 30 минут.

Возможно, что после этапа лиофилизации импрегнированный материал на основе костной ткани стерилизуют потоком быстрых электронов.

Возможно, что после этапа лиофилизации импрегнированные неорганические биодеградируемые и небиодеградируемые материалы стерилизуют разрешенным для данных материалов способом.

В таблице 1 представлена динамика суточной элюции ванкомицина (мкг/мл) в инкубационный раствор из тестируемых образцов остеопластического материала, импрегнированного по методу прототипа и заявленным способом.

На фигуре 1 изображено: динамика изменения средней площади, занимаемой остеобластами и остеокластами при морфометрическом исследовании гистологических микропрепаратов области остеомиелитического дефекта большеберцовой кости экспериментальных животных, замещенного лиофилизированным остеопластическим материалом, импрегнированным заявленным способом на сроках 14, 45, 90 суток.

Осуществление способа.

В качестве материала-носителя могут выступать: биологический материал (лиофилизированная аллогенная кость в виде блоков, костной крошки или «чипсов»), а также любые медицинские изделия и материалы с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости (100-600мкм) и предназначенные для восполнения дефектов костной ткани, к примеру, но не ограничиваясь, неорганические остеозамещающие материалы: биодеградируемые (биокомпозитные) материалы, к примеру: на основе керамики - гидроксиаппатит, ReproBone® (смесь гидроксиапатита и трикальцийфосфата), Биосит (оксиды кальция, кремния, фосфора, алюминия, магния, цинка, кристаллическая фаза - карбоксигидроксиапатит (даллит)); небиодеградируемые - биостекло - применяемый в медицинской практике материал, состоящий из силикатов, оксидов натрия и кальция с пористостью от 100 до 500 мкм, небиодеградируемый углерод-углеродный композиционный материал «Углекон-МВ», на 99,77% состоящий из углерода. Примеры приведены для раскрытия характеристик настоящего изобретения, в связи с чем, их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Предлагаемый способ импрегнации пористых материалов антибактериальными препаратами для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов состоит из этапов: выбор материала-носителя лекарственного препарата, этап приготовления раствора антибактериального препарата, замачивание в растворе активного вещества и вакуумирование материала носителя, 4. Стабилизация при воздействии низких температур, замораживание и лиофилизация, упаковка и стерилизация.

Этап приготовления раствора антибактериального препарата. На этапе приготовления раствора антибактериального препарата в качестве растворителя используют очищенную воду (дистиллированную или деинонизированную) сниженной температуры (от +2°C до +8°C). Методом ручного встряхивания, либо с использованием магнитной мешалки к воде добавляют один из выбранных антибактериальных препаратов или их комбинацию, позволяющую расширить спектр антимикробной активности импрегнированного материала в зависимости от клинической ситуации.

В одном из вариантов для увеличения вязкости и увеличения длительности элюции антибактериальных препаратов к очищенной воде добавляют полимер в концентрации, обеспечивающей вязкость раствора не более 0,01 Па*с, к примеру, но не ограничиваясь, поливинилпирролидон (ПВП) 5-10% концентрации и только затем добавляют антибактериальные препараты.

Замачивание в растворе активного вещества и вакуумирование материала носителя. Материал-носитель заливают готовым раствором до полного покрытия и выполняют вакуумирование, которое обеспечивает наилучшее проникновение раствора внутрь пористой структуры и максимальную эффективность импрегнации. Вакуумирование выполняют в условиях постепенно снижающегося давления 7-10 гПа (0.007-0.01 bar) на протяжении 30 минут с момента закипания раствора.

В одном из вариантов после этапа вакуумирования материал в растворе помещают в условия повышенного давления до 250 000 гПа (250bar) на срок до 30 минут.

После выполнения этапа 3 раствор с материалом-носителем оставляется в условиях пониженной температуры (от +2°C до +8°C) на 24-48 часов.

Следующим этапом выполняется замораживание материала при температуре -80°C в течение 24 часов, что предотвращает разрушение структуры материала-носителя и сохраняет свойства антибактериальных препаратов. Затем выполняется лиофилизация замороженного импрегнированного материала. Температурные условия: от -40°C в начале лиофилизации (первичная сушка или сублимация) до +40°C (вторичная сушка или десорбция) в конце с постепенным повышением температуры (+20°C каждые 5-16 часов) гарантируют аккуратное удаление влаги и поддержку структурной целостности. Процесс лиофилизации занимает от 24 до 48 часов в зависимости от объема и размера материала, до достижения остаточной влажности материала менее 5%, определяемой анализатором влажности, либо с использованием аналитических весов и сушильного шкафа.

В одном из вариантов материал может быть использован для замещения остеомиелитического дефекта без выполнения этапа обработки в условиях повышенного давления и этапа.

Готовый импрегнированный материал на основе лиофизированной кости упаковывают в двух- или трехслойные полиэтиленовые пакеты, устойчивые к воздействию ионизирующего излучения, и стерилизуют потоком быстрых электронов, импрегнированные неорганические биодеградируемые и небиодеградируемые материалы стерилизуют разрешенным для данных материалов способом.

Реализованный метод импрегнации любого пористого остеопластического материала-носителя антимикробными препаратами, позволяет получить материал с продленной антимикробной активностью, возможностью стерилизации и длительного хранения с последующим использованием для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов.

Примеры выполнения способа.

Результаты оценки антимикробной активности материала, полученного заявленным способом импрегнации, приведены для раскрытия характеристик настоящего изобретения, в связи с чем, их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Для сравнения заявленного способа со способом по прототипу были подготовлены лиофилизированные образцы костной ткани в виде блоков размером 5*5*5 мм, полученные из головок бедренной кости (ГБК) (известным способом RU2722266 C1). Лиофилизированные образцы импрегнировали в растворе ванкомицина 50 мг/мл по методике, представленной в прототипе [16] и заявленным способом с применением охлажденного раствора ванкомицина аналогичной концентрации, а также ванкомицина, растворенного в 5% растворе ПВП, вакуумизацией в условиях давления 7-10 гПа в течение 30 минут от момента закипания раствора и последующей стабилизацией в условиях пониженной температуры. Каждый образец (в трех повторностях) помещали в отдельную стерильную пробирку, содержащую 3 мл буферного раствора (DPBS) и инкубировали, ежедневно меняя раствор.

В инкубационном растворе проводили определение концентрации ванкомицина методом ВЖХ на приборе SHIMADZU, колонка Shim-pac HR-ODS (Япония). Из пробирок с аллографтами 1 мл суточного инкубационного раствора переносили в эппендорф и центрифугировали 5 минут, 13 000 об./мин. Затем надосадок переносили в виалу и помещали в хроматограф. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Скорость потока 0,45 мл/мин. Продолжительность анализа 25 мин. Время удержания ванкомицина на хроматограмме составляет 8,5 минут, высота пика соответствует концентрации препарата. Первые 7 суток инкубационный буфер разводили в 1000 раз и полученные результаты умножали на коэффициент разведения. Анализ полученных хроматограмм выполняли в программе LabSolutions.

Максимальные концентрации ванкомицина были получены у образцов импрегнированных по заявленной методике с добавлением в раствор ПВП в 10% концентрации (таблица 1). Начиная с 3 суток эксперимента элюция ванкомицина была больше у образцов, импрегнированных по заявленной методике в независимости от наличия или отсутствия ПВП в растворе для импрегнации. На 14 сутки ванкомицин определялся только после инкубации образцов, импрегнированных по заявленной методике антибиотиком и ПВП, и его концентрация превышала МИК в отношении стафилококков более, чем в 10 раз

Для определения возможности импрегнации различных материалов-носителей заявленным способом были подготовлены образцы в виде блоков размером 10*10*10 мм, полученные из головок бедренной кости (ГБК) (известным способом RU2722266 C1), биокомпозитного коммерческого материала Биосит (пр-во Россия), небиодеградируемого пористого углерод-углеродного композиционного материала Углекон-МВ (пр-во Росси). Для импрегнации использовали 5% раствор ванкомицина в вакууме 7-10 гПа (0.007-0.01 bar). Готовые образцы помещали в стерильные пробирки, содержащие 3 мл буферного раствора (DPBS), который ежедневно обновляли. Длительность антимикробной активности образцов на основе ГБК, импрегнированных по заявленному способу, составила 10 суток, образцов Биосита - 9 суток, образцов Углекон-МВ - 3 суток.

Для изучения возможности импрегнации остеозамещающих материалов различными антибактериальными препаратами были выбраны антибиотики с различными характеристиками, часто используемые в клинической практике лечения остемиелитического поражения костей и суставов:

- Ванкомицин - узкий спектр антимикробной активности (только грамположительные бактерии, включая метициллин-резистентные стафилококки (MRS), характеризуется высоким молекулярным весом (около 1449 г/моль) и большим размером молекулы (около 1.5 нм), что делает его подходящим для контролируемого и медленного высвобождения из пористых структур;

- Меропенем - широкий спектр антимикробной активности (грамположительные и грамотрицательные бактерии, не активен в отношении (MRS)), имеет средний молекулярный размер (около 1.2 нм) и молекулярную массу (около 490.6 г/моль), размер молекулы позволяет его эффективно использовать для импрегнации пористых материалов.

- Фосфомицин - широкий спектр антимикробной активности (грамположительные и грамотрицательные бактерии, активен в отношении большинства (MRS)), малый размер молекулы (около 0.7 нм) и низкая молекулярная масса (около 138.1 г/моль) позволяет выполнять импрегнацию материалов с уменьшенным размером пор.

Подготовленные образцы костной ткани на основе ГБК в одинаковых условиях импрегнировали ванкомицином, меропенемом и фосфомицином. Исследование длительности антимикробной активности импрегнированных образцов выполняли культуральным методом представленном выше в отношении Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA), S. aureus ATCC 43300 (MRSA), Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 (MRSE), Klebsiella pneumoniae ATCC 33495 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Образцы лиофилизированной губчатой кости, импрегированные ванкомицином, были активны только в отношении стафилококков до 10 суток. Образцы лиофилизированной губчатой кости, импрегнированной по предложенной методике препаратом меропенем сохраняли активность в отношении K. pneumoniae и MSSA - 6 суток, MRSA и P. aeruginosa - 5 суток. Импрегнированные фосфомицином образцы демонстрировали активность в отношении MSSA и P. aeruginosa - до 6 суток, K. pneumoniae и MRSA - 6 суток.

Влияние пористости материала на длительность элюции показано на примере импрегнации образцов небиодеградируемого УУКМ с размерами пор 200 и 600 мкм антибиотиком меропенем по описанной выше методике. Импрегнированные меропенемом образцы с размерами пор 200 и 600 мкм демонстрировали активность в отношении P. aeruginosa соответственно до 4 и 2 суток, K. pneumoniae - до 5 и 2 суток.

Испытания на стерильность проводились согласно ГОСТ ISO 11737-2-2011. Костные блоки помещались в питательную среду (Тиогликолевая среда) и выдерживались в термостате с температурой инкубации (30±2)°С и периодом 14 дней. После чего оценивали наличие бактериального роста: визуально (помутнение среды) и при помощи высева по 10 мкл на плотную питательную среду (Агар Эндо, ООО «НИЦФ», Колумбийский агар с бараньей кровью, ООО «Биомедиа»,). Чашки с плотной питательной средой инкубировали при 37^оС в течение суток. По истечение суток оценивали наличие или отсутствие бактериального роста. Роста микроорганизмов на сроках 6, 12, 18 месяцев выявлено не было (при условии хранения материала при комнатной температуре и защите от воздействия прямых солнечных лучей).

Исследование совместимости образцов материала с окружающими тканями, а также их способности к резорбции, остеоинтеграции и ремоделированию, проводилось в эксперименте in vivo. содержание и использование лабораторных животных осуществлялось в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для научных и иных целей (совет Европейских сообществ директива 86/609/ESS, Страсбург 1986) и стандартами «ИСО 10993-2».

Эксперимент in vivo выполнен на 18 кроликах породы Шиншилла на модели локализованного метафизарного хронического остеомиелита (Патент 2622209 С1). На 21 сутки от внесения инфекта - суточной культуры золотистого стафилококка, содержащей 106 КОЕ/мл выполняли повторное вмешательство. Животным проводили радикальную хирургическую обработку очага инфекции, кюретаж. Сформированный дефект заполняли лиофилизированным костнопластическим материалом, импрегнированынным по заявленной методике антибиотиком ванкомицин. Всем животным выполняли рентгенологическое обследование перед выводом из эксперимента (на 14, 45, 90 сутки). Гистоморфологические исследования и морфометрию площади, занимаемой остеобластами и остеокластами, выполняли на 14, 45 и 90 сутки наблюдения, окраску препаратов проводили гематоксилином и эозином.

Результаты микробиологического исследования: рост S.aureus был получен в 3 из 6 наблюдений на 14 сутки от операции, на 45 и 90 сутки микроорганизмов не выявлено. Результаты гистологического исследования демонстрировали на 14 сутки сохранение в некоторых наблюдениях мелких нейтрофильных инфильтратов, преобладание процессов резорбции материала над остеогенезом, на 45 сутки визуализировались в равных пропорциях пригнаци резорбции имплантата т формирования молодых костных балок, а к 90 суткам преобладали процессы регенерации и остеогенеза. Указанные процессы подтверждаются динамикой площади, занимаемой остеокластами, которая нарастала до 45 суток, а потом существенно снизилась, и поступательным ростом площади, занимаемой остеобластами (фиг.1). Полученные результаты подтверждают высокую антимикробную эффективность материала, импрегнированного по заявляемой методике, для лечения инфекционного поражения костной ткани, а также возможность его перестройки в костную ткань.

Выполненный заявителями поиск существующих способов, включал анализ патентов, источников научной литературы, содержащих информацию о существующих способах, аналогичных заявленному. Способы, описанные выше в качестве примеров патентов других авторов, содержат отдельные технические решения, наиболее близкий «аналог-прототип» предполагает использование вакуумирования для импрегнации только органического пористого материала, в частности биологической ткани человеческого, животного или растительного происхождения, не подтверждается возможность длительной элюции препарата из получаемого материала. Преимущества нашего изобретения заключаются в возможности импрегнировать заявленным способом медицинские изделия и материалы с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости (100-600мкм) и предназначенные для восполнения дефектов костной ткани, путем применения для растворения активных веществ воды сниженной температуры, в том числе с применением полимеров, вакуумирования в условиях давления 7-10 гПа (0.007-0.01 bar) на протяжении 30 минут с момента закипания, позволяющее достичь наилучшей дегазации и обеспечивающей равномерное и глубокое проникновение раствора активного вещества в поры материала, последующего воздействия пониженной температуры для предупреждения деструкции молекул антибиотиков и возможной последующей лиофилизацией, упаковкой и стерилизацией для длительного хранения. Следовательно, заявляемый способ соответствует критерию «новизна».

Таким образом, как видно из приведенных выше результатов исследований, заявленный способ импрегнации позволил придать пористым остеопластическим материалам вне зависимости от их природы (биологическому, неорганическим биодеградируемому и небиодеградируемому) продленную антимикробную активность за счет элюции импрегнированного препарата от нескольких суток до нескольких недель, с возможностью дальнейшей стерилизации и длительного хранения материала без потери антимикробной активности, при импрегнации предлагаемым способом биологического материала на основе лиофилизированной костной ткани подтверждена возможность восстановления структуры кости и эффективность в отношении купирования инфекции. Эти достоинства позволяют использовать заявленный способ для придания любому пористому остеопластическому материалу антимикробной активности для последующего применения путем одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов.

Способ импрегнации пористых материалов антибактериальными препаратами для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов

Таблица 1

сутки Концентрация ванкомицина, мкг/мл Импреграция по методу прототипа Заявленный способ Раствор ванкомицина Раствор ванкомицина Раствор ванкомицина + ПВП 1 65258 44679 82755,00 2 17894 17516 99578,00 3 4648,00 5791,00 92877,00 4 3780,00 5260,00 45621,00 5 1957,00 3649,00 9658,00 6 933,00 2846,00 5710,00 7 784,00 1120,00 3903,00 8 417,00 490,00 1244,00 9 236,10 166,90 987,00 10 45,00 69,00 259,00 11 54,10 14 27,90

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для придания пролонгированной антимикробной активности пористым остеозамещающим материалам с целью применения для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов в условиях инфекционного процесса в стоматологии, травматологии и ортопедии, онкологии, челюстно-лицевой хирургии, ветеринарии. Предлагаемый способ импрегнации пористых материалов антибактериальными препаратами характеризуется тем, что включает следующие этапы: a) приготовление раствора антибактериального препарата на основе очищенной воды сниженной температуры от +2 до +8°C; b) вакуумирование материала-носителя лекарственного препарата с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600 мкм, и предназначенного для восполнения дефектов костной ткани, в растворе антибактериального препарата в условиях постепенно снижающегося давления 7-10 гПа на протяжении 30 минут с момента закипания раствора; c) стабилизация раствора с материалом-носителем в условиях пониженной температуры от +2 до +8°C на 24-48 часов; d) лиофилизация материала, полученного на этапе с); e) стерилизация материала, полученного на этапе с). Технический результат: придание пористому биологическому, неорганическому биодеградируемому или небиодеградируемому остеопластическому материалу-носителю продленной антимикробной активности. 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Способ импрегнации пористых материалов антибактериальными препаратами для одномоментного замещения остеомиелитических дефектов и создания депо антимикробных препаратов, характеризующийся тем, что включает этапы:

a) приготовление раствора антибактериального препарата на основе очищенной воды сниженной температуры от +2 до +8°C,

b) вакуумирование материала-носителя лекарственного препарата с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600 мкм, и предназначенного для восполнения дефектов костной ткани, в растворе антибактериального препарата в условиях постепенно снижающегося давления 7-10 гПа на протяжении 30 минут с момента закипания раствора,

c) стабилизация раствора с материалом-носителем в условиях пониженной температуры от +2 до +8°C на 24-48 часов,

d) лиофилизация материала, полученного на этапе с),

e) стерилизация материала, полученного на этапе с).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пористый материал представлен лиофилизированной костью в виде блоков, костной крошки или чипсов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что пористый материал представлен неорганическим биодеградируемым материалом с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600 мкм, предназначенным для восполнения дефектов костной ткани.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пористый материал представлен неорганическим небиодеградируемым материалом с размерами пор, сопоставимыми с пористостью губчатой кости 100-600 мкм, предназначенным для восполнения дефектов костной ткани.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что готовится раствор комбинации антибактериальных препаратов.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что к очищенной воде добавляют полимер в концентрации, обеспечивающей вязкость раствора не более 0,01 Па⋅с, затем растворяют антибактериальные препараты.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что после этапа вакуумирования раствор с материалом-носителем помещают в условия повышенного давления до 250000 гПа на срок до 30 минут.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что после этапа лиофилизации импрегнированный материал на основе костной ткани стерилизуют потоком быстрых электронов.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что после этапа лиофилизации импрегнированные неорганические биодеградируемые и небиодеградируемые материалы стерилизуют разрешенным для данных материалов способом.