Способ остановки ферментативной реакции Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для аналитических и препаративных целей.

При проведении некоторых экспериментов, например для определения содержания макроэргических соединений (АТФ, фосфокреатина, ГТФ, ЦТФ, УТФ), продуктов их гидролиза (АДФ, АМФ, неорганического фосфата, креатина и др.), нейромедиаторов (ГАМК, серотонина, норадреналина) и др. после разрушения клеток необходимо быстрое (порядка 10 мс) необратимое осаждение белков, главным образом, ферментов. Это препятствует быстрому гидролизу соединений и является необходимой основой для их аналитического определения или препаративного выделения [1].

Классическим способом быстрой остановки ферментативной реакции - помещение в жидкий азот или другой энертный газ, имеющий крайне низкую температуру [1, 2]. Такой способ остановки ферментативных реакций является классическим при изучении метаболизма в тканях и органах с быстрым метаболизмом - сердце, мозге, селезенке, почках, культурах клеток. Замораживание тканей или органов при температуре жидкого азота или углекислоты, равно как и другого инертного носителя с низкой температурой, оправдано, поскольку остановка ферментативных реакций при этой температуре практически мгновенно останавливает распад АТФ, ГТФ, фосфокреатина, других веществ. Однако, получение жидкого азота, замораживании е при температуре жидкого гелия, твердой углекислоты или другого инертного носителя с низкой температурой требует расходования большого количества электроэнергии, времени, его использование затруднено невозможностью длительного хранения (например, в сосудах Дьюара и т.д.). Если для остановки ферментативных реакций внутри клеток экспериментальных животных используют охлаждение при температуре жидкого азота, последующая экстракция веществ из ткани в классическом варианте требует использования трихлорацетата или перхлората. Как трихлорацетат, так и перхлорат осаждают белки, вызывают помутнение растворов до экстинкции выше 4 единиц (обозначается на приборах знаком ∞). В последующем для изучения экстрагированных веществ требуется нейтрализация растворов - как правило растворами КОН. Нейтрализация трихлорацетатного или перхлоратного экстракта тоже является строго необходимой - во-первых, для изучения содержания веществ, которые гидролизуются при кислых значениях рН (АТФ, фосфокреатин, нуклеотидтрифосфаты и др), во вторых, для отделения осадка с ненужными, уже денатурированными белками, поскольку калиевая соль перхлората образует в воде осадок и легко отделяется центрифугированием вместе с осажденными ферментами и белками. Однако, замораживание при температуре жидкого азота можно использовать для остановки ферментативных реакций в ткани, органе, фрагменте органа, культуре тканей. Этот способ неприменим для остановки ферментативных реакций в растворах.

Для остановки ферментативной реакции в растворах, суспензиях, гомогенатах тканей используют вещества, денатурирующие (вызывающие необратимое осаждение) белки (ферменты). Наиболее распространены среди таких реагентов следующие - вольфрамовая кислота, сульфат цинка (сульфат кадмия), трихлоруксусная кислота, хлорная кислота, этанол [1, 2, 3, 4]. Однако, в этих случаях, происходящее необратимое денатурирование фермента (белка) вызывает изменение прозрачности раствора вплоть до потери его светопроницаемости, что требует последующего центрифугирования и отделения осадка белков от супернатанта, не содержащего абсолютно никаких крупнодисперсных денатурированных белков (в том числе и ферментов). Для ингибирования ферментов и/или остановки ферментативных реакций используют большое количество веществ, однако, среди них отсутствуют предлагаемые к использованию класс веществ - протеазы [7].

Технический результат - способ остановки ферментативных реакций, не вызывающий появление осажденных белков, не требующий последующего центрифугирования или другого метода их сепарирования и не приводящий к изменению прозрачности растворов.

Технический результат изобретения достигают добавлением в среду ферментативной реакции протеолитических ферментов или их смеси, например химотрипсина, трипсина и других протеаз или фармацевтических препаратов, содержащих протеолитические ферменты - Панкреатина (должно быть не менее 640 единиц протеаз на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию, Креона (должно быть не менее 640 Единиц протеаз на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию). Верхняя граница применения протеаз значения не имеет. Для приготовления раствора, содержащего протеазы, используют Панзинорм форте (с минимальной активностью протез 900 ед., амилазы 12000 единиц, липазы 20000 единиц), препарат Креон в капсулах с выделением смеси ферментов из капсул (150 мг панкреатина в 1 капсуле, которая содержит липазы с активностью не менее 1000 единиц, амилазы - 8000 единиц, протеаз 600 единиц или препарат Креон, содержащий 300 мг панкреатина и имеющий активность - липазы 25000 единиц, амилазы - 18000 единиц, протеаз - 1000 единиц). Приготавливают из этих препаратов концентрированный раствор протеаз так, чтобы конечная активность протеаз составляла не менее 640 Ед на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию. Поскольку для остановки ферментативной реакции требуется активность протеаз- ферментов гидролизующих белки, в том числе - ферменты, активность липазы и амилазы значения не имеет. Объем раствора, содержащего протеазы составляет 0,1 мл на 5 мл среды для остановки ферментативной реакции.

Пример 1.

Исследовалась активность совместно смесь глюкозооксидазы и пероксидазы с субстратом - глюкозой, которая окисляется кислородом воздуха при каталитическом действиии фермента глюкозооксидазы с образованием пероксида водорода и глюконата. Образовывавшейся пероксид водорода определяют по реакции окислительного азосочетания с замещенным фенолом и 4-аминопиридином, которая катализируется ферментом пероксидазой (реакция Триндера) [8].

Для изучения влияния трихлорацетата на активность глюкозооксидазы (4,18+0,1 мккат) и пероксидазы (36,18+0,1 мккат), добавляли 4 - аминопиридин (0,5 ммол/л), фенол 5 ммоль/л, фосфатный буфер 0,25 М (рН=7,5). Конечный объем раствора до добавления раствора глюкозы - 4,9 мл. Объем раствора глюкозы (5 ммоль/л), которым инициировали реакции - 0,1 мл.

Глюкоза + О₂ глюкозооксидаза --> глюконолактон + Н₂О₂

Н₂О₂ + фенол + 4-аминопиридин пероксидаза -> хинонимин + 4Н₂О

хинонимин (480-530 нм поглощения света, максимум оптической абсорбции 510 нМ)

Смесь глюкозооксидазы и пероксидазы останавливала свою активность практически мгновенно от добавления трихлорацетата (таблица 1).

Для изучения влияния трихлорацетата на активность пероксидазы (36,18+0,1 мккат) в кювету пероксидазу (36,18+0,1 мккат), 4-аминопиридин 0,5 ммоль/л, фенол 5 ммоль/л, фосфатный буфер 0,25 М (рН=7,5). Конечный объем раствора до добавления раствора пероксида водорода 4,9 мл. Объем раствора пероксида водорода (5 ммоль/л) - 0,1 мл.

Реакцию инициировали добавлением пероксида водорода в реакции окислительного азосочетания с замещенным фенолом и 4-аминопиридином, которая катализируется ферментом пероксидазой (реакция Триндера) [8].

Н₂О₂ + фенол + 4-аминопиридин пероксидаза -> хинонимин (максимум оптической абсорбции 510 нМ) + 4Н₂О.

Время реакции, момент остановки ферментативных реакций оценивали с помощью электронного секундомера с разрешением в 1 мс. В работе использовали спектрофотометр СФ-2000 и пакет прикладных программ (Ломо, Российская Федерация), компьютер IBM - совместимый. Спектр растворов исследовали как в видимом диапазоне волн света, так и в ультрафиолетовом (290-990 нм). Кинетику работы ферментов оценивали в соответствии с рекомендациями [4, 5, 6].

Пероксидаза останавливала свою активность практически мгновенно (табл. 2).

Таким образом, действие трихлорацетата на смесь глюкозооксидазы и пероксидазы не отличалось (таблица 1) по своей чувствительности от пероксидазы (таблица 2).

Как показали эксперименты, как смесь глюкозооксидазы и пероксидазы (таблица 1), так и пероксидаза (таблица 2) мгновенно прекращали свою активность при добавлении 5% трихлорацетата 0,1 мл. Время реакции, момент остановки ферментативных реакций оценивали с помощью электронного секундомера с разрешением в 1 мс.

Время, необходимое для остановки ферментативных реакций, было менее 0,05 секунды (таблица 1, таблица 2).

Раствор, содержавший ферменты, субстраты, реагенты становился непрозрачным с белым хлопьевидным осадком после добавления 5% трихлорцетата (конечная экстинкция растворов при добавлении трихлорацетата более 4 единиц, обозначается значком ∞) и требовал центрифугирования со скоростью не менее 1300 оборотов в минуту для осаждения осадка и спектрофотометрического определения веществ в супернатанте (таблица 3, таблица 4 - для длины волны 510 нм, таблица 5, таблица 6 - для длины волны 340 нм).

После центрифугирования растворы также не оставались безупречно прозрачными - сохранялось поглощение света в видимом диапазоне (480-530 нм) и ультрафиолетовом свете (340 нм), что является крайне нежелательным при последующем биохимическом анализе растворов [1].

Пример 2.

Исследовалась активность совместно смесь глюкозооксидазы и пероксидазы с субстратом - глюкозой, которая окисляется кислородом воздуха при каталитическом действиии фермента глюкозооксидазы с образованием пероксида водорода и глюконата. Образовывавшейся пероксид водорода определяют по реакции окислительного азосочетания с замещенным фенолом и 4-аминопиридином, которая катализируется ферментом пероксидазой (реакция Триндера) [8].

Для изучения влияния Панкреатина на активность глюкозооксидазы (4,18+0,1 мккат) и пероксидазы (36,18+0,1 мккат), добавляли 4-аминопиридин (0,5 ммол/л), фенол 5 ммоль/л, фосфатный буфер 0,25 М (рН=7,5). Конечный объем раствора до добавления раствора глюкозы- 4,9 мл. Объем раствора глюкозы (5 ммоль/л), которым инициировали реакции - 0,1 мл.

Глюкоза + О₂ глюкозооксидаза --> глюконолактон + Н₂О₂

Н₂О₂ + фенол + 4-аминопиридин пероксидаза -> хинонимин + 4Н₂О

хинонимин (480-530 нм поглощения света, максимум оптической абсорбции 510 нМ).

Необходимо добавление в среду ферментативной реакции протеолитических ферментов или их смеси, например химотрипсина, трипсина и других протеаз или фармацевтических препаратов, содержащих протеолитические ферменты - Панкреатина (должно быть не менее 640 единиц протеаз на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию, Креона (должно быть не менее 640 Единиц протеаз на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию). Верхняя граница применения протеаз значения не имеет. Для приготовления раствора, содержащего протеазы, используют Панзинорм форте (с минимальной активностью протез 900 ед., амилазы 12000 единиц, липазы 20000 единиц), препарат Креон в капсулах с выделением смеси ферментов из капсул (150 мг панкреатина в 1 капсуле, которая содержит липазы с активностью не менее 1000 единиц, амилазы - 8000 единиц, протеаз 600 единиц или препарат Креон, содержащий 300 мг панкреатина и имеющий активность - липазы 25000 единиц, амилазы - 18000 единиц, протеаз - 1000 единиц). Приготавливают из этих препаратов концентрированный раствор протеаз так, чтобы конечная активность протеаз составляла не менее 640 Ед на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить реакцию. Поскольку для остановки ферментативной реакции требуется активность протеаз - ферментов гидролизующих белки, в том числе - ферменты, активность липазы и амилазы принципиального значения не имеет. Объем раствора, содержащего протеазы составляет 0,1 мл на 5 мл среды для остановки ферментативной реакции. Время реакции, момент остановки ферментативных реакций оценивали с помощью электронного секундомера с разрешением в 1 мс. В работе использовали спектрофотометр СФ-2000 и пакет прикладных программ (Ломо, Российская Федерация), компьютер IBM - совместимый. Спектр растворов исследовали как в видимом диапазоне волн света, так и в ультрафиолетовом (290-990 нм). Кинетику работы ферментов оценивали в соответствии с рекомендациями "Methods in enzymology", volume 536 [4, 5, 6].

Смесь глюкозооксидазы и пероксидазы останавливала свою активность практически мгновенно от добавления Креона или Панкреатина (таблица 7). Для этого использовали препарат Креон или Панзинорм форте 640 Ед протеазной активности на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию что входит в диапазон рекомендуемой активности.

Для изучения влияния Панкреатина на активность пероксидазы (36,18+0,1 мккат) в кювету пероксидазу (36,18+0,1 мккат), 4-аминопиридин 0,5 ммоль/л, фенол 5 ммоль/л, фосфатный буфер 0,25 М (рН=7,5). Конечный объем раствора до добавления раствора пероксида водорода 4,9 мл. Объем раствора пероксида водорода (5 ммоль/л) - 0,1 мл.

Реакцию инициировали добавлением пероксида водорода в реакции окислительного азосочетания с замещенным фенолом и 4-аминопиридином, которая катализируется ферментом пероксидазой (реакция Триндера) [8].

Н₂О₂ + фенол + 4-аминопиридин пероксидаза -> хинонимин (максимум оптической абсорбции 510 нМ) + 4Н₂О.

Пероксидаза останавливала свою активность практически мгновенно (таблица 8). Для этого использовали препарат Креон или Панзинорм форте 640 Ед протеазной активности на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить реакцию, что входит в диапазон рекомендуемой активности.

Глюкозооксидаза и пероксидаза не отличались по своей чувствительности к действию протеолитических ферментов в рекомендуемом выше диапазоне их активности. Как показали эксперименты, как глюкозооксидаза с пероксидазой мгновенно (за 5 10 мс) прекращали свое действие при добавлении протеолитических ферментов в рекомендуемом диапазоне концентраций (таблица 7 для сопряженных глюкозооксидазы и пероксидазы, таблица 8 для пероксидазы).

Панзинорм форте или Креона должно быть не менее 640 единиц протеаз на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить реакцию.

Время, необходимое для остановки ферментативных реакций, было 0,05- 0,1 секунды. Время реакции, момент остановки ферментативных реакций оценивали с помощью электронного секундомера с разрешением в 1 мс.

Соотношение объемов растворов было следующим. Объем раствора, содержащего ферменты, субстраты и красителем составляло 5 мл.

Объем добавленного раствора Креона или Панзинорм форте составляло 0,1 мл.

Таким образом, разбавление исходного ферментативного раствора составляло 2% от объема. Это значение также ниже разбавления исследуемых растворов трихлорацетатом- до 5-10% от их первоначального объема.

Раствор, содержавший ферменты, субстраты, реагенты оставался прозрачным во время всего эксперимента - от момента добавления Креона или Панзинорм форте до 40 минут их совместной инкубации. Поскольку для определения активности ферментов использовался метод с образованием хинонимина, измеряли оптическую плотность растворов при 510 нм (480-530 нм). Использование как Креона, так и Панзинорм форте (Пример 2, таблица 7, таблица 8) для остановки ферментативных реакций по скорости их остановки было сравнимо с использованием традиционного метода- добавления трихлорацетата (Пример 1, таблица 1 и таблица 2).

Традиционный способ остановки ферментативной реакции - добавления трихлорацетата (таблица 3, таблица 4 - для длины волны 510 нм, таблица 5, таблица 6 для длины волны 340 нм), растворы требовали центрифугирования и после центрифугирования имели остаточную оптическую плотность, что вносит погрешность в последующие измерения концентрации веществ.

Предлагаемые для остановки ферментативной реакции растворы Креона или Панзинорм форте с активностью протеаз не менее 640 единиц на 1 литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию, не вызывает появление осажденных белков, не требует последующего центрифугирования и не приводит к изменению прозрачности растворов- по изменению экстинкции растворов (Пример 2, таблица 9 и таблица 10 для длины волны 510 нм). Поскольку при исследовании ферментативных реакций используется спектр поглощения НАДН (максимум поглощения при 340 нм), то было испытано влияние добавленных протеаз в виде препаратов Панзинорм форте и Креон на поглощение света раствором при 340 нм. Результаты свидетельствуют, что Панзинорм форте и Креон в рекомендуемом диапазоне активности не влияет на прозрачность растворов при 340 нм (Пример 2, таблица 11 и таблица 12 для длины волны 340 нм), что делает этот метод более предпочтительным при изучении веществ, поглощающих свет при 340 нм.

Сравнение прототипа- общепринятого способа остановки ферментативных реакций путем добавления трихлорацетата и предлагаемого способа приведено в таблице 13.

Список использованных документов.

1. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, Москва, издательство Мир, 1991, С. 472.

2. Таранов А.Г. /Диагностические тест-системы: радиоимунный и иммуноферментный методы диагностики. 2002. «Издатель Мокеев». 288 С.

3. Laura Kuntz. / TCA precipitation. Methods in enzymology. Volume Eds. Abelson J.A., Simon M.I., Pyle A.M., founding ed. Colo wick S., Kaplan N. 2014. Academic Press, Elsevier. (Methods in enzymology, Volume 541). P. 3-10.

4. Lorsch Jon. / Laboratory methods in enzymology. Part D. (Methods in enzymology. Volume 536) Academic Press, Elsevier. 2014. (Volume Eds. Abelson J.A., Simon M.I., Pyle A.M., Verdine G.), founding ed. Colowick S., Kaplan N. Academic Press. Elsevier. P. 3-180.

5. Purich Daniel L. / Enzyme kinetics: catalysis and control. A reference of theory and best-practice methods. Academic Press. 2010. P. 1-915.

6. Purich Daniel L., Allison R. / The enzyme reference - comparative guide to nomenclature, reactions and methods. 2002. Academic Press. P. 1-940.

7. Purich Daniel L. / The Inhibitor Index. Desk reference on enzymes inhibitors, receptor antagonists, drugs, toxins, poisons and therapeutic leads. CRC press. 2017. P. 1-1361.

8. Barham D., Trinder P. / An improved colour reagent for determination of blood glucose by oxidase system. Analyst. 1972. 97: 142-145.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ остановки глюкозооксидазной и пероксидазной ферментативной реакции, включающий добавление в среду ферментативной реакции протеолитических ферментов, причем в качестве ферментов используют препараты: Панкреатин или Креон с концентрацией не менее 640 единиц протеаз этих препаратов на литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию; Панзинорм форте с минимальной активностью протеаз 900 единиц, амилазы 12000 единиц, липазы 20000 единиц, Креон в капсулах с выделением смеси ферментов из капсул в объеме 150 мг панкреатина в капсуле, которая содержит липазы с активностью не менее 1000 единиц, амилазы - 8000 единиц, протеаз 600 единиц или Креон, содержащий 300 мг панкреатина и имеющий активность липаз 25000 единиц, амилаз 18000 единиц, протеаз 1000 единиц; из препарата приготавливают концентрированный раствор протеаз так, чтобы конечная активность протеаз составляла не менее 640 Ед на литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию; объём раствора, содержащего протеазы, должен составлять 0,1 мл на 5 мл среды для остановки ферментативной реакции. Предложенный способ остановки ферментативных реакций не вызывает появление осажденных белков, не требует последующего центрифугирования или другого метода их сепарирования и не приводит к изменению прозрачности растворов. 13 табл., 2 пр.

Способ остановки глюкозооксидазной и пероксидазной ферментативной реакции, включающий добавление в среду ферментативной реакции протеолитических ферментов, причем в качестве ферментов используют препараты: Панкреатин или Креон с концентрацией не менее 640 единиц протеаз этих препаратов на литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию; Панзинорм форте с минимальной активностью протеаз 900 единиц, амилазы 12000 единиц, липазы 20000 единиц, Креон в капсулах с выделением смеси ферментов из капсул в объеме 150 мг панкреатина в капсуле, которая содержит липазы с активностью не менее 1000 единиц, амилазы - 8000 единиц, протеаз 600 единиц, или Креон, содержащий 300 мг панкреатина и имеющий активность липаз 25000 единиц, амилаз 18000 единиц, протеаз 1000 единиц; из препарата приготавливают концентрированный раствор протеаз так, чтобы конечная активность протеаз составляла не менее 640 Ед на литр раствора, в котором необходимо остановить ферментативную реакцию; объём раствора, содержащего протеазы должен составлять 0,1 мл на 5 мл среды для остановки ферментативной реакции.