ВАКЦИНА ПРОТИВ ГРИППА Н5 ДЛЯ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/145 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, разработке вакцины против вируса гриппа Н5.

В связи с учащающимися случаями заражения кошек вирусом гриппа и подтверждёнными случаями передачи его от кошки к человеку [1], а также регулярно регистрирующимися случаями заболевания собак [2, 3, 4] вакцинация домашних животных в неблагополучных регионах является рекомендуемым средством профилактики. Она оправдана с точки зрения экономических затрат, улучшения эпизоотологической обстановки и непосредственно состояния здоровья животных, а также профилактики передачи вируса от кошек к человеку и дальнейшему распространению возбудителя.

Первые случаи заражения домашних животных вирусом гриппа типа А были зарегистрированы в 2004 г, когда имело место несколько обширных очагов среди домашних собак в Азии (Южной Корее, Китае и Таиланде) [5] и в США, где очаги впоследствии стали энзоотичными. Тогда отмечали заражение вирусом гриппа подтипа Н3N2. В 2016 году в приюте для бездомных животных в США произошло заражение кошек вирусом гриппа подтипа Н7N2 [7]. В начале марта 2006 года первые случаи гибели кошек от птичьего гриппа выявлены в Дагестане из-за массового заражения и гибели птиц в птицеводческих хозяйствах и личном подворье [8, 9].

В последнее время появляется все больше сообщений о вспышках заболевания с летальным исходом среди млекопитающих, вызванных вирусами гриппа A (H5), включая грипп A (H5N1). С 2022 года 10 стран на трёх континентах сообщили в ВОЗЖ о вспышках заболевания млекопитающих [10].

Грипп является высококонтагиозной острой инфекцией, обычно верхних дыхательных путей, и был обнаружен во всем мире у многих позвоночных хозяев. Респираторные заболевания кошек, вызванные вирусами гриппа, по-видимому, довольно редки и специфичны для данного вида животных; однако вторичные бактериальные инфекции могут приводить к осложнениям и могут быть связаны со смертельным исходом. Очень редко высокопатогенные вирусы гриппа могут вызывать тяжёлое генерализованное вирусное заболевание с высоким уровнем летальности у кошек [11].

На сегодняшний день случаи заболевания вирусом гриппа типа А подтипа Н5 были зарегистрированы у следующих видов млекопитающих: хорёк, норка, европейская выдра, североамериканская речная выдра, морская выдра, европейский барсук, скунс, виргинский опоссум, дальневосточный леопард, амурский тигр, горный лев, рыболов, европейский хорек, обыкновенная рысь, рыжая рысь, домашняя кошка, рыжая лисица, койот, енотовидная собака, южноамериканская кустарниковая собака, американский черный медведь, бурый медведь, медведь гризли, медведь кадьяк, серый тюлень, обыкновенный котик, морской котик, морской лев, морская свинья, афалина, короткоклювый обыкновенный дельфин, белобокий дельфин, собака, японские енотовидные собака, бурая куница, каспийский тюлень, азиатский черный медведь, чилийский дельфин, морская свинья Бурмейстера. Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять исходные уровни инфекции у диких млекопитающих [10, 11].

В настоящий момент коммерческие вакцины против гриппа подтипа Н5N1 для плотоядных животных не разработаны. Существуют вакцины-кандидаты, не подлежащие реализации среди населения [12].

Существует зарегистрированная вакцина Nobivac NXT Canine Flu Bivalent Indications, содержащая инактивированный вирус гриппа штаммов A/canine/Florida/25/2006 (H3N8) и A/canine/Illinois/12191/2015 (H3N2) и адъювант.

Существует вакцина Nobivac Canine Flu H3N8 для собак, содержащая инактивированный вирус гриппа штамма A/canine/Florida/25/2006 (H3N8) и адъювант.

Также зарегистрирована вакцина Nobivac Canine Flu H3N2 для собак, в состав которой входит инактивированный вирус гриппа штамма A/canine/Florida/25/2006 (H3N2) и адъювант.

Данные вакцины предназначены для иммунизации исключительно собак в возрасте старше 7 недель двукратно с ежегодной ревакцинацией. Продолжительность иммунитета не установлена [13]. В состав данных вакцин входит вирус гриппа типа А подтипа Н3, который способен вызывать клинические симптомы у многих млекопитающих, в том числе человека.

Ни одна из перечисленных выше вакцин не является близкой предполагаемому изобретению по совокупности существенных признаков. Таким образом, предполагаемое изобретение не имеет аналогов.

Вирус гриппа типа А подтипа Н5 является вирулентным для птиц [14], и, следовательно, легко распространяется среди млекопитающих. Ввиду этого, безопасной является вакцина, содержащая подтип вируса гриппа Н5. Также вследствие высокой летальности и вирулентности вируса гриппа типа А подтипа Н5 [14] важным аспектом является профилактика его распространения.

Таким образом, в области техники существует потребность в разработке фармацевтического средства - вакцины, которая являлась бы безопасной и способна была индуцировать иммунный ответ против вируса гриппа Н5 у плотоядных животных.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, которое направлено на формирование протективного иммунитета против вируса гриппа Н5 у плотоядных животных. Предлагаемое средство является уникальным, т.к. на настоящий момент в мире не существует аналогов, полностью прошедших все стадии контроля безопасности для целевых животных и эффективности против вируса гриппа Н5.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в предоставлении эффективного инструмента профилактики гриппа Н5, среди животных.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины для специфической профилактики гриппа Н5 плотоядных животных эмбриональной инактивированной эмульсионной, созданной из штамма «Ямал» вируса гриппа Н5.

Разработанная вакцина содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде антигенного материала штамма «Ямал» вируса гриппа Н5, репродуцированного в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур, в количестве 30% по массе; 2) масляный адъювант Montanide ISA-70 VG, в количестве 70% по массе.

Совокупность компонентов обеспечивает протективную иммунную активность в организме животного после введения ему целевого препарата.

Штамм «Ямал» является РНК-содержащий вирус гриппа рода А, относящийся к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Alphainfluenzavirus influenzae. Штамм адаптирован к репродукции в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур и депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером: №366 - деп / 21-28 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против гриппа Н5 для плотоядных животных.

2. Активное вещество в виде очищенного антигенного материала из штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А в эффективном количестве.

3. Целевая добавка.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный антигенный материал штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Инактивированный антигенный материал из штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, полученный в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур, в эффективном количестве.

2. Инактивированный антигенный материал из штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, полученный в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур и представляющий собой инактивированную вирусную суспензию с инфекционной активностью не менее 7,0 lg ЭИД₅₀/см³, гемагглютинирующей активностью в РГА не ниже 1:16 в количестве 30,0 об.%.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide Isa 70 VG.

4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-70 VG в количестве не менее 70 об. %.

5. Очищенный инактивированный антигенный материал штамма «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, полученный в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур и масляный адъювант Montanide ISA-70 VG в следующих количествах:

Антигенный материал штамма «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А 30,0 Масляный адъювант Montanide ISA-70 VG 70,0

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой вакцины входит адъювант, который усиливает воздействие антигена на иммунную систему вакцинируемых животных, инициируя каскад иммунных реакций и обеспечивая выработку напряжённого иммунитета.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счёт того, что в состав предлагаемой вакцины входит инактивированный очищенный антиген штамма «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, репродуцированного в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту плотоядных животных против гриппа Н5.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счёт того, что для инактивации вируссодержащих материалов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов.

В качестве адъюванта использован Montanide ISA-70 VG в соотношении 30÷70. По внешнему виду препарат представляет собой однородную эмульсию оттенка белого цвета. По лекарственной форме изобретение является эмульсией для инъекции.

Сущность изобретения отражена на графических материалах:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражает филогенетическое взаимоотношения штаммов вируса гриппа Н5 - штамма «Ямал» с другими штаммами низкопатогенного вируса гриппа Н5. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностях NP-гена.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 - Последовательность нуклеотидов участка HA-гена (гемагглютинин) (360 н.о.) штамма «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа А.

SEQ ID NO:2 - Последовательность аминокислот, кодируемых участком HA-гена (гемагглютинин) (120 а.о.) штамма «Ямал» низкопатогенного вируса гриппа А.

Штамм «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя гриппа А: вирионы имеют сферическую форму. Диаметр частицы вируса гриппа составляет 80-120 нм. Штамм «Ямал» относится к РНК-содержащим вирусам гриппа рода А, семейства Orthomyxoviridae, рода Alphainfluenzavirus, вида Alphainfluenzavirus influenzae.

Антигенные свойства.

Вирусы гриппа имеют поверхностные и внутренние антигены. К поверхностным относят гемагглютинин и нейраминидазу. К внутренним антигенам относят нуклеопротеин (белок NP) и М-белки.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Вирионы содержат 1% РНК, 70% белка, 24% липидов, 5% углеводов. Геном представлен односпиральной линейной фрагментированной минус-РНК. В геноме имеется 8 фрагментов. Каждый фрагмент кодирует информацию об одном или двух белках и покрыт капсидом. Все фрагменты покрыты нуклеокапсидом.

Структурные белки Н, N, М2 связаны с суперкапсидной оболочкой. Матриксный белок М1 располагается под суперкапсидной мембраной. В центре вирусной частицы располагается рибонуклеопротеидное ядро, состоящее из 8 фрагментов вирусной РНК, белка NP, трёх белков полимеразного комплекса (РВ1, РА, РВ2) и белка NEP.

В составе суперкапсидной оболочки имеются шипы - выросты около 10 нм, образованные гликопротеинами - гемагглютинином и нейраминидазой. Они закреплены гидрофобными концами в липидном бислое суперкапсида. Внутри контактируют с М-белком. На поверхности вириона присутствует 550-600 шипов, из которых нейраминидазой представлены 50-100 шипов.

Гемагглютинин (Н) представляет собой шип в виде тримера, состоящего из идентичных субъединиц. Каждая из субъединиц состоит из двух цепей - тяжёлой и лёгкой. Нейраминидаза (N) представляет собой грибоподобный тетрамер. Его четыре сферических субъединицы прикреплены к ножке, основанием подлежащей в суперкапсидной оболочке вируса. С внутренней стороны суперкапсида располагается матриксный белок М1, окружающий нуклеокапсид. Белок М1 заполняет пространство между суперкапсидной оболочкой и рибонуклеопротеидом. Мембранный белок М2 встроен в липидную мембрану и представляет собой тетрамер.

Капсид состоит из белка - нуклеопротеина (NP), а также белков полимеразного комплекса. Капсид содержит 32 капсомера. Нуклеопротеин (NP) является внутренним белком, взаимодействующим с одной стороны белком М1, а с другой стороны - с вирусной РНК.

Методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера определена первичная структура участка HA-гена (360 н.о.) (гемагглютинин) штамма «Ямал» вируса гриппа и определено положение данного штамма на филогенетическом древе вируса.

Представлен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участка HА-гена (гемагглютинин, 360 н.о.) штамма «Ямал» вируса гриппа с другими штаммами (Фиг. 1).

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA7 и алгоритма Neighbor-Joining. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (1000 повторов), показан рядом с ветвями. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 31 нуклеотидную последовательность, в том числе последовательность участка HA-гена штамма «Ямал». Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 360 позиции нуклеотидов и 120 аминокислотных остатков. Эволюционный анализ проводился в MEGA7.

В результате проведенной работы по сравнению нуклеотидных последовательностей HA-гена штамма «Ямал» и других штаммов вируса гриппа определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый штамм «Ямал» вируса гриппа относится к генотипу H5N1, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Штамм «Ямал» проявляет генетическую стабильность

Биотехнологические характеристики

Культивирование штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А осуществляют с использованием 9-11-суточных СПФ эмбрионов кур. Вирус вызывает гибель эмбрионов через 26-48 часов.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус гриппа средне устойчив во внешней среде. УФ-лучи вызывают гибель через 5 минут. При температуре +4°С вирус сохраняется в течение 7 дней. В лиофилизированном состоянии вирус сохраняет жизнеспособность 2-3 года. Прямой солнечный свет обезвреживает вирус в течение 50-55 часов. Вирус не выдерживает воздействие высоких температур в течение длительного времени. При температуре 55-60°С гибель вируса происходит за 30-50 минут, при 65-70°С - за 2-5 минут.

Вирус гриппа слабо устойчив к дезинфектантам. 70% этиловый спирт вызывает гибель через 5 минут, 3% фенол, 1% настойка йода, 1% сулема, 1% купорос - через 3 минуты. Не выдерживает воздействие 3% раствора гидроокиси натрия, хлорной извести, креолина, 2% раствора формальдегида, азотной кислоты, эфира, хлороформа.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - не патогенен для домашних животных любой породы и возраста.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в течение 5 пассажей (срок наблюдения) в куриных эмбрионах.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Получение антигенного материала штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А осуществляют с использованием 9-11-суточных СПФ эмбрионов кур. Вирус вызывает гибель эмбрионов через 26-48 часов.

Для получения вирусного сырья СПФ эмбрионы кур контролируют в отношении следующих параметров: яйца должны быть правильной формы с хорошей плотной скорлупой и центральным расположением желтка при овоскопии. Воздушная камера (пуга) должна быть в тупом конце яйца и неподвижна. Яйца с трещинами и дефектами скорлупы (насечки, известковые наросты), двухжелтковые или со смещённым желтком, имеющие кровяные или другие включения, смещённую или подвижную воздушную камеру, считаются непригодными для инкубации.

Инокуляцию возбудителя вируса гриппа в 9-11-суточные СПФ эмбрионы кур производят в дозе 0,1 см³. Заражённые куриные эмбрионы помещают в термостат при температуре (37,5±1,0)°С и относительной влажности 50-70% на срок до 96 часов. Все эмбрионы, погибшие до 24 ч инкубации, выбраковывают. Через 26-48 часов в инфицированных куриных эмбрионах наблюдают гибель, обусловленную вирусом гриппа. По окончании инкубации живые куриные эмбрионы помещают в холодильную камеру при температуре 4°С на 18 ч. Перед вскрытием куриные эмбрионы выдерживают 2-3 ч при комнатной температуре до испарения конденсата (влаги) на скорлупе.

Контроль посевного материала вируса гриппа Н5 штамма «Ямал» осуществляют по показателю отсутствия контаминации грибами, бактериями и микоплазмами. Контроль контаминации грибами и бактериями посевного материала вируса гриппа Н5 штамма «Ямал» проводят по ГОСТ 28085 [15]. Контроль контаминации микоплазмами осуществляют в соответствии с требованиями ГФ XIV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031.15) [16].

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «Ямал» не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Контроль гемагглютинирующей активности вируса гриппа Н5 штамма «Ямал» проводили согласно Методическим рекомендациям по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации [17].

Инактивацию вируса проводят с использованием димера аминоэтилэтиленимина. Для этого подготовленный, как описано выше, вирусный материал подогревают до температуры (25±0,5)°С, после чего в него добавляют раствор димера аминоэтилэтиленимина до конечной концентрации в готовом продукте 0,25%. Процесс инактивации вируса длится 36 часов при температуре (25±0,5)°С.

Контроль полноты инактивации вируссодержащего сырья проводят с помощью трёх последовательных пассажей на 9-11-суточных СПФ-эмбрионах кур с последующим определением биологической активности вируса гриппа методом определения величины титра на эмбрионах кур или определением гемагглютинирующей активности в реакции гемагглютинации. Критерием качества инактивации является отсутствие эмбрионов, имеющих признаки инфекционного процесса и/или отсутствие гемагглютинации в РГА. Инактивированный вирусный материал возбудителя вируса гриппа хранят при температуре от +2 до +8°С.

Инактивированный антигенный материал штамма «Ямал» представляет собой суспензию, содержащую цельновирионные капсиды возбудителя вируса гриппа, которые полностью сохранили свою белковую и антигенную структуру, но в результате разрушения генетического аппарата, потерявшие способность к размножению и вирулентности.

Инактивированный очищенный вируссодержащий материал штамма «Ямал» вируса гриппа с гемагглютинирующей активностью до инактивации не ниже 9 log₂ HA использовали для изготовления вакцины против гриппа Н5 для плотоядных животных.

В качестве адъюванта активного компонента препарата используется масляный адъювант Montanide ISA 70 VG. Процедура получения готовой формы вакцины состоит в следующем: антиген смешивают с масляным адъювантом в соотношении 30÷70 (% по весу) и эмульгируют на высокоскоростном лабораторном смесителе при скорости 6000 об/мин в течение 5 мин.

По внешнему виду полученное средство специфической профилактики вируса гриппа Н5 для плотоядных животных представляет собой однородную эмульсию белого цвета. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла в верхней и уплотнение эмульсии в нижней части флакона. При тщательном взбалтывании эмульсия приобретает однородную структуру.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объём изобретения.

Пример 1. Приготовление предлагаемой вакцины

Для приготовления вакцины против гриппа Н5 для плотоядных животных использовали следующий штамм вируса гриппа Н5: «Ямал».

Технологический процесс состоит из следующих этапов:

• получение вирусной суспензии штамма «Ямал»;

• определение активности полученной суспензии;

• инактивация полученной суспензии;

• добавление адъюванта;

• расфасовка готового продукта.

Посевной материал, используемый для изготовления вакцины, получали в 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур.

Для изготовления вакцины использовали культуральный вирус штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, выращенный на 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур.

Предполагаемая вакцина имеет оптимальный компонентный состав, об.%:

1. Антигенный материал из штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, репродуцированный на 9-11-суточных СПФ эмбрионах кур, с 9,6 lg ЭИД₅₀ инфекционной активностью и 10 log₂ гемагглютинирующей активностью, в количестве 30,0 об. %.

2. Адъювант Montanide ISA-70 VG в количестве 70,0 об. %.

Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанной выше концентрации является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла в верхней и уплотнение эмульсии в нижней части флакона. При тщательном взбалтывании эмульсия приобретает однородную структуру.

До и после составления вакцины, соблюдая условия асептики, от компонентов отбирали пробы для определения стерильности. Из собранного материала пробу высевали на бактериальные среды для исключения контаминации микробами, грибами и микоплазмами, после чего отбирали пробы для определения инфекционной активности.

Смешивание компонентов осуществляли с соблюдением условий асептики. Фасовку антигена с адъювантом проводили по 0,5 или 500 см³ во флакон. Далее в условиях асептики на флаконы надевали алюминиевые колпачки и закатывали при помощи автомата закатки алюминиевых колпачков. Наклеивали этикетку при помощи установки для этикетирования флаконов.

Вакцину контролировали на полноту инактивации (авирулентность), безвредность и фасовали в стерильные флаконы. Вакцина должна быть стерильной, авирулентной и безвредной.

Стерильность вакцины определяли в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Методы биологического контроля стерильности» [15]. Сущность метода заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибной микрофлоры в посевах из образцов вакцины на питательные среды. Проверку на отсутствие контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV том 2, ОФС 1.7.2.0031.15 [16].

Полноту инактивации препарата определяли общеизвестным способом, аналогично определению безвредности.

Таким образом, в результате проведенной работы авторами было разработано безопасное для человека и целевых животных и эффективное средство специфической профилактики вируса гриппа птиц у плотоядных животных: инактивированная вакцина, содержащая в своем составе цельновирионные структуры штамма «Ямал» подтипа H5N1 низкопатогенного вируса гриппа А в качестве активного вещества и масляный адъювант Montanide ISA-70 VG в качестве вспомогательного вещества.

Пример 2. Безвредность и ареактогенность вакцины против гриппа Н5 для плотоядных животных

В исследовании использовали котят (кошки) 3 месячного возраста в количестве 16 голов, щенки (собаки) 5-6 месячного возраста в количестве 12 голов, песцы 9-10 месячного возраста в количестве 16 голов, лисицы 9-10 месячного возраста в количестве 16 голов, хорьки 9-10 месячного возраста в количестве 20 голов, норки 9-10 месячного возраста в количестве 20 гол. Животных случайным образом разделили на группы каждого вида животных. Две опытные группы, в каждой: 4 головы котят, 4 головы щенков (собаки), по 4 головы песцов, по 4 головы лисиц, по 5 голов хорьков и по 5 голов норок. Две контрольные группы, в каждой: 4 головы котят, 3 головы щенков (собаки), 4 головы песцов, 4 головы лисиц, 5 голов хорьков и 5 голов норок.

Сформированные группы животных соответственно объёмам и способам введения были привиты вакциной против гриппа Н5 для плотоядных животных. Опытным №1-2; №5-6; №9-10; №13-14; №17-18; №21-22 группам вакцину вводили в дозе 1,0 см³ (двойной объём препарата), а контрольным группам №3-4; №7-8; №11-12; №15-16; №19-20; №23-24 вводили вакцину в дозе 0,5 см³. В течение 14-суток за животными вели клиническое наблюдение на предмет выявления изменений в общем состоянии (угнетение, отказ от корма) и наличия отёка в местах введения вакцины. Безопасность вакцины оценивали по клиническому состоянию после вакцинации (табл. 1), а также по результатам оценки реактогенности по результатам патологического вскрытия через 14 суток после вакцинации (табл. 2).

По окончании срока наблюдений провели диагностический убой животных и патологоанатомический осмотр точек введения препарата и окружающих тканей на наличие в них патологических изменений (гиперемия, отёки, некрозы, экссудация, инкапсуляции, присутствие изменённой или неизменённой эмульсии). Вакцину считали ареактогенной и безвредной, если не наблюдали описанные прижизненные или посмертные явления.

После применения вакцины в одной прививной дозе, введенной внутримышечно и подкожно различным видам животных (кошки, собаки, песцы, лисицы, ноки, хорьки) каких-либо отклонений в общем состоянии и поведении не выявлено. Животные в продолжении всего срока наблюдения оставались активными, снижение аппетита не наблюдали. После применения вакцины в двукратном прививном объёме, введенной внутримышечно и подкожно различным видам животных (кошки, собаки, песцы, лисицы, ноки, хорьки) каких-либо отклонений в общем состоянии и поведении не выявлено. Животные в продолжении всего срока наблюдения оставались активными, снижение аппетита не наблюдали (табл. 1).

После вынужденного диагностического убоя патологоанатомический осмотр также не выявил ни у одной из подопытных групп животных каких-либо изменений в тканях в месте инъекции вакцины (табл. 2).

Полученная вакцина против гриппа Н5 для плотоядных животных безвредна и ареактогенна для естественно-восприимчивых животных.

Пример 3. Подбор иммунизирующего объёма вакцины против гриппа Н5 для плотоядных животных

Для подбора иммунизирующего объема вакцины (предлагаемое изобретение) использовали хорьков 10 месячного возраста в количестве 15 голов, котят 2,5-3 месячного возраста - 15 голов.

Животных каждого вида разделили на 3 группы по 5 голов. До проведения исследования от каждой группы отобрали кровь для исследований сывороток в РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 согласно утверждённым методическим рекомендациям [18].

Котят групп №1, №2 и №3 и хорьков групп №4, №5 и №6 вакцинировали однократно, внутримышечно в объеме 0,2 см³, 0,5 см³ и 1,0 см³, соответственно.

Через 28 суток после иммунизации от животных всех подопытных групп отбирали пробы крови для исследований сывороток в РТГА на присутствие антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 (табл. 3).

Вакцину считали антигенно-активной, если через 28 суток после вакцинации у вакцинированных животных титр антител к вирусу гриппа Н5 составил не ниже 3,0 log₂ (1:8) в РТГА.

Было установлено, что все животные всех групп до проведения исследования были серонегативны. Через 28 суток после вакцинации различных объёмов вакцины у 100% животных сформировался напряжённый гуморальный иммунитет. Среднегрупповые титры антител для всех вводимых объемов находились в диапазоне 4,6÷6,6 log₂.

Исследования показали, что у животных, которым вводили вакцину в дозе 0,2 см³, средний уровень специфических антител к вирусу гриппа Н5 был достоверно ниже аналогичного показателя у животных, иммунизированных в дозах 0,5 см³ и 1,0 см³. Статистической разницы между испытанными инъекционными объёмами 0,5 см³ и 1,0 см³ установлено не было. Таким образом, на основании полученных результатов установлено, что минимальной иммунизирующей дозой испытуемого препарата является 0,5 см³.

Пример 4. Контроль напряжённости иммунитета у животных после применения вакцины против гриппа Н5 для плотоядных животных

Вакцину изготавливали как описано в примере 1. Для контроля напряжённости иммунитета сформировали 6 групп животных каждого вида (кошки, собаки, хорьки, песцы, лисы, норки), по 8 голов в каждой, которым была иммунизирована экспериментальная серия вакцины, в объеме 0,5 см³ внутримышечно. Контрольная группа (2 головы) оставалась интактной.

До вакцинации и через 28 суток после иммунизации от животных отбирали пробы крови для исследований сывороток крови в РТГА на присутствие антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5.

Вакцину считали антигенно активной, если через 28 суток после вакцинации у вакцинированных животных титр антител к вирусу гриппа Н5 составил не ниже 3,0 log₂ в РТГА.

В результате проведенных исследований было установлено, что через 28 суток у 100% всех животных опытных групп сформировался напряженный иммунитет. Среднегрупповое значение титра специфических антител к вирусу гриппа (Н5) составило величину (Т±m) у котят 5,8±0,99 log₂ (табл. 4), у щенков 4,25±1,03 log₂ (табл. 5), у хорьков 5,3±1,59 log₂ (табл. 6), у песцов 6,0±1,3 log₂ (табл. 7), у лисиц 5,25±1,48 log₂ (табл. 8), у норок 5,62±1,68 log₂ (табл. 9) в РТГА. При этом животные контрольной группы так и остались серонегативны.

Через 28 суток после однократной вакцинации вакциной против гриппа Н5 для плотоядных животных (предлагаемое изобретение) у котят, щенков, хорьков, песцов, лисиц и норок формируется напряжённый иммунитет.

Таким образом, вакцина против гриппа Н5 для плотоядных животных обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью и безвредна для плотоядных животных.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против гриппа Н5 для плотоядных животных»:

1. "Вирусы гриппа типа A". cdc.gov. США: Центры по контролю и профилактике заболеваний. 2024-02-01.

2. Crawford et al. 2005, Payungporn et al. 2008, Castleman et al. 2010

3. Crawford et al. 2005, Daly et al. 2008, Kirkland et al. 2010, Pratelli & Colao 2014, Schulz et al. 2014

4. Klivleyeva N., Glebova T.I., Shamenova M.G., Saktaganov N.T. Influenza A viruses circulating in dogs: A review of the scientific literature. Open Veterinary Journal 12(5):676. doi: 10.5455/OVJ.2022.v12.i5.12

5. «Продолжающиеся вспышки птичьего гриппа птиц среди животных представляют опасность для человека. Анализ ситуации и рекомендации для стран со стороны ФАО, ВОЗ, ВОЗЖ» // Всемирная организация здравоохранения URL: https://www.who.int /news/item/12-07-2023-ongoing-avian-influenza-outbreaks-in-animals-pose-risk-to-humans (дата обращения 10.07.2024 г. ).

6. «Грипп птиц и другие виды зоонозного гриппа». // Всемирная организация здравоохранения URL: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(avian-and-other-zoonotic) (дата обращения 10.07.2024 г. ).

7. Санин А.В. Птичий грипп - опасен ли он для наших питомцев? // ЗАО «Микро Плюс» URL: http://micro-plus.ru/ru/articles/24-dlya-vladeltsev/36-ptichij-gripp-opasen-li-on-dlya-nashikh-pitomtsev-1 (дата обращения 10.07.2024 г. ).

8. Brian R. Easik, Ian E.H. Voorhees, Colin R. Parrish. Canine and Feline Influenza. Cold Spring Harb Perspect Med. 2021 Jan; 11(1): a038562. doi: 10.1101/cshperspect.a038562

9. «Онищенко подтвердил наличие птичьего гриппа в Дагестане» // РИА Новости URL: https://ria.ru/20060216/43586682.html (дата обращения 10.07.2024 г. ).

10. Thiry E., Zicola A., Addie D., Egberink H., Hartmann K., Lutz H., Poulet H., Horzinek M. Highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in cats and other carnivores. Vet. Microbiol. 2007;122:25-31.

11. Krammer F., Smith G.J.D., Fouchier R.A.M., Peiris M., Kedzierska K., Doherty P.C., Palese P., Shaw M.L., Treanor J., Webster R.G., et al. Influenza. Nat. Rev. Dis. Primers. 2018;28:3. doi: 10.1038/s41572-018-0002-y.

12. Muralidhar Deshpande, Faris Jirjis, Anna L Tubbs, Huchappa Jayappa Evaluation of the Efficacy of a Canine Influenza Virus (H3N8) Vaccine in Dogs Following Experimental Challenge. Veterinary Therapeutics: Research in Applied Veterinary Medicine 10(3):103-12

13. Нобивак против собачьего гриппа двухвалентный // URL: https://www.drugs.com/vet/nobivac-canine-flu-bivalent.html, дата обращения 10.07.2024 г.

14. Elisha Hall, PhD, RD. 14-е издание «Розовая книга». Глава 12: Грипп. Эпидемиология заболеваний, предотвращаемых с помощью вакцин. CDC". CDC. 2019-03-29.

15. ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

16. ГФ ХIV, т. 2, с. 2997-3008 Испытания на присутствие микоплазм (ОФС.1.7.2.0031.15).

Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации / И. А. Чвала, М. А. Циванюк, Ю.Ю. Бабин [и др.]; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир: [б. и.], 2011. - 13 с.

18. Методические рекомендации по определению титра антител в сыворотке крови плотоядных животных к вирусу гриппа подтипа H5 в реакции торможения гемагглютинации / утв. ФГБУ "ВНИИЗЖ" 26.01.2024 г. - Владимир, 2024. - 32 с.

Таблица 1

Результаты клинического осмотра животных, иммунизированных вакциной против гриппа Н5 для плотоядных животных в одной прививной дозе

Номер группы Способ введения вакцины и виды животных Оценка состояния животных соответственно времени наблюдений (сут) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 п/к Котята Н* Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 2 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 3 п/к Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 4 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 5 п/к Щенки (собаки) Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 6 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 7 п/к Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 8 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 9 п/к Песцы Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 10 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 11 п/к Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 12 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 13 п/к Лисицы Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 14 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 15 п/к Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 16 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 17 п/к Хорьки Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 18 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 19 п/к Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 20 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 21 п/к Норки Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 22 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 23 п/к Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н 24 в/м Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Н Примечание: * - Н - клиническое состояние животных в пределах нормы
п/к - подкожное введение
в/м - внутримышечное введение

Таблица 2

Результаты патологоанатомического осмотра животных, иммунизированных вакциной против гриппа Н5 для плотоядных животных в одной прививной дозе различными методами введения

Номер группы Способ введения вакцины Степень поражения тканей Нет поражений Лёгкая Средняя Тяжёлая 1 котята Подкожно 4/4* 0/4 0/4 0/4 2 Внутримышечно 4/4 0/4 0/4 0/4 3 Подкожно 4/4 0/4 0/4 0/4 4 Внутримышечно 4/4 0/4 0/4 0/4 5 щенки (собаки) Подкожно 3/3 0/3 0/3 0/3 6 Внутримышечно 3/3 0/3 0/3 0/3 7 Подкожно 3/3 0/3 0/3 0/3 8 Внутримышечно 3/3 0/3 0/3 0/3 9 песцы Подкожно 4/4 0/4 0/4 0/4 10 Внутримышечно 4/4 0/4 0/4 0/4 11 Подкожно 4/4 0/4 0/4 0/4 12 Внутримышечно 4/4 0/4 0/4 0/4 13 лисицы Подкожно 4/4 0/4 0/4 0/4 14 Внутримышечно 4/4 0/4 0/4 0/4 15 Подкожно 4/4 0/4 0/4 0/4 16 Внутримышечно 4/4 0/4 0/4 0/4 17 хорьки Подкожно 5/5 0/5 0/5 0/5 18 Внутримышечно 5/5 0/5 0/5 0/5 19 Подкожно 5/5 0/5 0/5 0/5 20 Внутримышечно 5/5 0/5 0/5 0/5 21 норки Подкожно 5/5 0/5 0/5 0/5 22 Внутримышечно 5/5 0/5 0/5 0/5 23 Подкожно 5/5 0/5 0/5 0/5 24 Внутримышечно 5/5 0/5 0/5 0/5 Примечание: * - отсутствие поражений, в числителе количество животных (разного вида) без местных поражений и в знаменателе - общее количество животных в группе

Таблица 3

Активность сывороток крови в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц Н5 после вакцинации животных вакциной против гриппа Н5 для плотоядных животных в разных объёмах

Номер образца Титр сывороточных антител (Т, log₂) к вирусу гриппа птиц (Н5) у животных после вакцинации соответственно объёму введения препарата № 1
(котята,
0,2 см³ ) №2
(котята,
0,5 см³ ) № 3
(котята,
1,0 см³ ) № 4
(хорьки,
0,2 см³ ) № 5 (хорьки,
0,5 см³ ) № 6 (хорьки,
1,0 см³ ) 1 6 4 5 6 6 6 2 4 4 5 6 6 7 3 3 7 6 5 7 7 4 5 7 7 5 7 7 5 5 5 7 4 5 6 "Т±m* 4,6±1,14 5,4±1,51 6,0±1,0 5,2±0,83 6,2±0,83 6,6±0,54 Примечание: * среднее значение по группе и стандартная ошибка

Таблица 4

Активность сывороток крови котят в РТГА на наличие антител к вирусу ГП (Н5)

Таблица 5

Активность сывороток крови щенков в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц (Н5)

Таблица 6

Активность сывороток крови хорьков в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц (Н5)

Таблица 7

Активность сывороток крови песцов в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц (Н5)

Таблица 8

Активность сывороток крови лисиц в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц (Н5)

Таблица 9

Активность сывороток крови норок в РТГА на наличие антител к вирусу гриппа птиц (Н5)

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана вакцина против гриппа Н5 для плотоядных животных, содержащая активное вещество и целевую добавку. В качестве активного вещества она содержит инактивированный антигенный материал штамма «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А. Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в предоставлении эффективного инструмента профилактики гриппа Н5 среди животных. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл., 4 пр.

1. Вакцина против гриппа Н5 для плотоядных животных, содержащая активное вещество и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит: инактивированный антигенный материал штамма «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №366 – деп / 21-28 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в 9-10-суточных СПФ эмбрионах кур, в качестве целевой добавки содержит масляный адъювант Montanide ISA-70 VG, взятые в соотношении 30:70.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит инактивированный антигенный материал из штамма «Ямал» подтипа Н5N1 низкопатогенного вируса гриппа А, полученного в 9-10-суточных СПФ эмбрионах кур, с инфекционной активностью 9,6 lg ЭИД₅₀ и гемагглютинирующей активностью 10 log₂.