ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ГКВ 2389 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ И ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2008 года по МПК C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа с помощью интраназальной живой и парентеральной инактивированной гриппозной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2).

Широкое распространение в странах Юго-Восточной Азии высокопатогенных вирусов гриппа подтипа A (H5N1) привело, начиная с декабря 2003 г., более, чем к 100 случаям заболевания людей, более половины из которых скончались. В последнее время высокопатогенные вирусы гриппа подтипа А (Н5N1) были выделены на территории России и ряда стран СНГ. Подобное обширное распространение вирусов H5N1 создает угрозу возникновения пандемической ситуации и вызывает необходимость разработки срочных противопандемических мер, что отражено в приказе Минздрава РФ о создании Координационного совета по подготовке к пандемии гриппа [Приказ №40 от 28.12.2004]. Применяемые в настоящее время для профилактики эпидемического гриппа А вакцины подтипов H1N1 и H3N2 не могут вызывать выраженную защитную реакцию в случае широкомасштабной вспышки, вызванной вирусами подтипа H5N1, к которым у подавляющего большинства населения нет иммунитета.

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является получение вакцинного штамма новой антигенной разновидности на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2М2) - обозначение «Лен/17» - с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенного вируса гриппа птиц А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) - обозначение «Н5N2-дт». Штамм А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2), выделенный в 1986 г. в Потсдаме от домашних уток в процессе текущего надзора за гриппом, был получен из коллекции Центра по контролю и предупреждению заболеваний США. Секвенирование гена гемагглютинина (НА) показало, что структура сайта протеолитического расщепления НА не содержит вставки из основных аминокислотных остатков, что характерно для апатогенных вирусов гриппа птиц.

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1986. - С.66-83]. Применяемые в настоящее время вакцинные штаммы для живых гриппозных вакцин (ЖГВ) получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (ХА) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS) - от безвредного ХА донора аттенуации. Известен вакцинный штамм А/17/Новая Каледония/99/145 (Н1N1) [Патент №2183672, опубл. 20.06.02], а также вакцинный штамм А/17/Панама/99/242 (Н3N2) [Патент №2248935, опубл. 20.03.05] на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2).

В отношении создания вакцинного штамма, содержащего поверхностные антигены вируса гриппа птиц подтипа H5N2 была выбрана стратегия, аналогичная получению реассортантных штаммов на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) с современными эпидемическими вирусами H1N1 и H3N2. Реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) - обозначение «Лен17/Н5» - был получен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) апатогенного птичьего вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) с ХА штаммом А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2). Метод классической генетической реассортации включает коинфицирование РКЭ смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, после чего полученный вируссодержащий материал пассируется 3-4 раза при пониженной до 25°С в присутствии антисыворотки к донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2), после чего проводится клонирование методом конечных разведении [Г.И.Александрова. Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - С.387-395]. Полученные клоны подвергаются детальному анализу. Анализ генома одного из полученных реассортантов (А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) был выполнен с помощью ПЦР-рестрикционного анализа [Klimov A.I., Сох N.J. J. Virol. Method. - 1995. - №55. - Р.445-44] и частичным или полным секвенированием ДНК-копий отдельных генов. Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS и NA обрабатывали соответственно эндонуклеазами рестрикции Tru9I, HindIII, BamHI, AsnI, EcoRI, PvuI, NciI, SphI соответственно. Дополнительно копии сегментов РВ1, PA и M были обработаны рестриктазами BstXI, AsnI BciVI. Было показано, что сайты рестрикции в положениях нуклеотидной цепи, характерные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2), присутствуют в генах ВР2 (1459), PA (107 и 1045), NP(1066), M(68 и 969), NA(78). В то же время утрачены сайты рестрикции в генах РВ1(819 и 975) и NS(798), что также характерно для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2). Таким образом показано, что реассортант унаследовал ген NA и 6 генов негликозилированных белков от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕАССОРТАНТНОГО ШТАММА А/17/УТКА/ПОТСДАМ/86/92 (Н5N2).

Принадлежность НА реассортанта родительскому штамму «дикого» типа А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором иммунных антисывороток. РТГА проводили в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций, в которые последовательно вносили последовательные падающие разведения иммунных антисывороток с шагом 2, соответствующие антигены в стандартной дозе (4 агглютинирующих единицы) и 0,75% взвесь эритроцитов индюка. Титр антигемагглютинирующих антител выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдалось торможение агглютинации.

Показано, что вакцинный кандидат А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) антигенно идентичен родительскому штамму А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5N2) (Таблица 1) [Desheva et al., Options for the control of Influenza V. - Ed. Y. Kawaoka, Elsevier. - 2004. - P. 724-727].

Таблица 1.
Антигенная специфичность реассортантного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2).АнтигеныАнтисыворотки хорьковГК/156Гусь/ГКВН/113ВН/342ГК/213Лен17/Н5А/Гонконк/156/97320160640640<20160А/гусь/Гонконг/437-4/99640640512025606401280А/гусь/Вьетнам/113/0116040256032016080А/утка/Вьетнам/342/013201603202560<20640А/Гонконг/213/036401601024025602560640Лен17/Н5160401280640<20640А/утка/Потсдам/86160801280640<20640А/курица/Гонконг/409.1/02160805120320640320А/гусь/Гонконг/668.1/0116080640640160160

ТЕМПЕРАТУРОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И ХОЛОДОВАЯ АДАПТАЦИЯ.

Для определения инфекционной активности делали ряд падающих десятикратных разведений исследуемого вирусного материала, зараженные РКЭ инкубировали при оптимальной (34°С), пониженной до 25°С или повышенной до 40°С температуре. К числу температурочувствительных (имеющих ts фенотип) относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной температуре по сравнению с оптимальной с разностью в 5,0-6,0 Ig ЭИД₅₀ и более. Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25°С температуре не превышала 3,0-3,5 Ig EID₅₀ вирусы относили к ХА группе. Было показано, что штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) является температурочувствительным (разность титров при 33°С и 40°С - 6,8 Ig ЭИД₅₀/мл) и холодоадаптированным (разность титров при 33°С и 25°С - 3,1 Ig ЭИД₅₀/мл) (Таблица 2).

Таблица 2.
Репродукция реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) и родительских вирусов при различной температуре инкубации.ВирусыИнфекционная активностьRCT₂₅ (Ig ЭИД₅₀)RCT₄₀ (Ig ЭИД₅₀)А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)9,5±0,37,3±0,21,5±0,02,28,0А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) [7:1]9,3±0,36,2±0,31,6±0,23,17,7А/утка/Потсдам 1406-86 (H5N2)8,5±0,21,8±0,18,0±0,38,00,5

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму - структурой генома, необходимой для реассортантных вакцинных штаммов, антигенной специфичностью гемагглютинина вируса «дикого» типа А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2), температурочувствительностью, холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией, характерной для ХА донорского штамма и соответствует требованиям Фармакопейной статьи [ФСП 42-0417409703 на вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную сухую. - 2003. - 12 с.].

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2389.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°С в течение 48 часов - 9,3 Ig ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность после пассажа в носовых ходах хорька. Реассортантный вирус А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) вводили в носовые ходы хорька в дозе 7,2 Ig ЭИД₅₀ с последующим выделением реизолятов на 3-й и 6-й день после инокуляции. Носовые смывы пассировали трехкратно в РКЭ. Вакцинный вирус, выделенный на 3-й день после инокуляции, сохранил все кодирующие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, характерные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) (Табл.3). На 6-й день после инокуляции вирус не был выделен.

Таблица 3.
Анализ кодирующих мутаций в геноме реизолята Лен17/Н5.ВирусНуклеотидные заменыРВ2РВ1РАМNS14598191795107104568969798Лен/17ТТАСТGААЛен 17/Н5ТТАСТGААРеизолятТТАСТGАА

Вирулентность: авирулентен.

Штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) безвреден при введении курам и белым мышам.

Пример 1. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ КАНДИДАТА В ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ НА КУРАХ.

При определении патогенности на курах, внутривенное введение 0,2 мл вакцинного вируса было безвредным, не наблюдалось симптомов заболеваемости ни в одном случае из 8. При интраназальном введении 0,5 мл вакцинного вируса также не наблюдалось симптомов заболеваемости, вирус не был выделен из носоглоточных и клоакальных смывов и не вызывал сероконверсий ни в одном случае из пяти (Табл. 4). Таким образом, реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) продемонстрировал высокую степень аттенуации для кур, что подтверждает безопасность при производстве и использовании вакцины на его основе.

Таблица 4.
Результаты изучения безвредности реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86-92 (Н5N2) при введении курам.ВирусАпатогенность при внутривенномБезвредность и приживаемость при интраназальном введенииЗаболеваемость/ смертностьВыделение вируса на 3-й день после зараженияСероконверсииЗаболеваемостьСмертностьНосоглоточные смывыКлоакальные смывыЛен17/Н50/80/80/50/50/50/5Н5№2-дт0/80/80/50/50/53/5

Пример 2. ПРОВЕРКА БЕЗВРЕДНОСТИ ШТАММА - КАНДИДАТА В ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ НА МЫШАХ.

Безвредность штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) изучена на мышах линии BALB/c при интраназальном введении 50 мкл аллантоисной жидкости, содержащей 10⁶ 50% эмбриональной инфекционной дозы (ЕИД₅₀) вируса. Концентрацию вирусов определяли в легких и носовых ходах мышей на 3-и сутки по показателям титрования суспензии органов в развивающихся куриных эмбрионах начиная с разведения 1:10 для легких и 1:2 для носовых ходов. 50% мышиную инфекционную дозу (МИД₅₀) 50% летальную дозу (LD₅₀) определяли по методу Reed-Muench. Результаты выражали как значение ЭИД₅₀, соответствующее 1 МИД₅₀ или 1 LD₅₀ Реассортант был аттенуированным для мышей, репродуцируясь более эффективно в носовых ходах (3,5 Ig ЕИД₅₀/мл), чем в легочной ткани (1,6 Ig ЕИД₅₀/мл) (Табл.5).

Таблица 5.
Результаты изучения безвредности реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) и родительского штамм А/утка/Потсдам/1402-6/86 (H5N2) при интраназальном введении мышам.ВирусРепродукция в легких (Ig ЭИД₅₀/мл)Репродукция в носовых ходах (Ig ЭИД₅₀/мл)МИД₅₀** (Ig)Максимальное снижение веса (%)LD₅₀** (Ig)Лен17/Н52,1±1,03,5±0,07.01>7,0Н5N2-дт6,3±0,31,6±0,23.34>7,0

Штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2) иммуногенен и эффективен против последующего заражения высокопатогенными вирусами подтипа H5N1 при интраназальном введении мышам.

ОЦЕНКА ИММУНОГЕННОСТИ И ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ.

Оценка гуморального иммунного ответа в сыворотках подопытных животных проводилась через 28 дней после введения препаратов в иммуноферментном анализе (ИФА) по описанной методике [Rowe Т., et al. J. of Clinical microbiology. - 1999. - Vol.37. - Р.937-943]. 96-луночные панели для ИФА покрывали 100 ГАЕ/0,1 мл цельного очищенного инактивированного формалином вируса А/Гонконг/213/03 (Н5N1) (Гонконг/213) или очищенным рекомбинантным НА вируса А/Гонконг/483/97 (Н5N1) (Гонконг/483) в концентрации 4 мкг/мл. Результаты выражали в десятичных логарифмах величины, обратной конечному разведению. За конечное разведение принимали наивысшее разведение образца, дающее оптическую плотность при длине волны 490 нм, превышающую среднюю оптическую плотность в контрольных образцах более чем на 3 стандартных отклонения.

В ИФА выявлено наличие в сыворотках мышей, иммунизированных реассортантом А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2), специфических IgG и IgA к вирусам подтипа H5N1: к цельному вирусу Гонконг/213 и очищенному рекомбинантному НА вируса Гонконг/483 (Табл.6).

Таблица 6.
Специфические IgG и IgA антитела к вирусам H5N1 в сыворотках крови у мышей, иммунизированных реассортантным вирусом А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5№2).ПрепаратIgG к вирусамIgA к вирусамГонконг/213Гонконг/483Гонконг/213Гонконг/483Лен17/Н54,73,22,82,4Н5N2-дт5,14,53,12,6Контроль<2,0<2,0<2,0<2,0

Для заражения животных (по 5 животных в группе) через 2 месяца после первичной иммунизации использовали вирусы подтипа H5N1: Гонконг/483 или Гонконг/213. Мышей, иммунизированных 10⁶ ЭИД₅₀ каждого из исследуемых вирусов, инфицировали 10 LD₅₀ вируса Гонконг/483. Летальность и снижение веса регистрировали в течение 14 дней. Животных, иммунизированных 10⁷ ЭИД₅₀, заражали 100 МИД₅₀ вируса Гонконг/213. Концентрацию вируса в легких определяли на 3-й день после заражения по результатам титрования суспензии легких на РКЭ.

Мыши, иммунизированные однократно с помощью ЖГВ из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2) в дозе 300 50% мышиных инфекционных доз (МИД₅₀), были защищены на 100% от летальной инфекции вирусом Гонконг/483 в дозе 50 LD₅₀, в то время как в контрольной группе наблюдалась 100% смертность животных. Однократная интраназальная иммунизация ЖГВ вызывала 100% защиту против последующей инфекции 100 МИД₅₀ вируса Гонконг/213, заражающий вирус не был выделен из легких ни в одном случае из пяти (Табл. 7).

Таблица 7. Резистентность мышей, иммунизированных реассортантным вирусом А/17/утка/Потсдам/86-92 (Н5N2) к заражению вирусами подтипа H5N1.

ПрепаратЗаражение 10 LD₅₀ А/Гонконг//483/97Заражение 100 МИД₅₀ А/Гонконг/213/2003ЛетальностьМаксимальная потеря в весе (%)Средние титры выделения вируса из легочной ткани (Ig EID₅₀/ml)Лен17/Н50/85≤1.5Н5N2-дт0/80≤1.5Контроль8/8234.9

Таким образом, было показано, что ЖГВ из реассортантного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2), содержащего НА апатогенного птичьего вируса подтипа H5N2, была безвредной, иммуногенной и эффективной при однократном введении против последующей инфекции высокопатогенными вирусами подтипа H5N1, в том числе и значительно отличавшимися по антигенным свойствам.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НА МЫШАХ ПРИВИВОЧНЫХ СВОЙСТВ ЖГВ И ИГВ ИЗ ШТАММА А/17/УТКА/ПОТСДАМ/86/92 (Н5N2).

Изучение на мышах прививочных свойств цельновирионной вакцины из штамма Лен17/Н5 с добавлением гидроокиси алюминия и без нее показало, что однократное применение вакцины без адьюванта было недостаточно эффективным против последующей инфекции высокопатогенным вирусом H5N1, выделенным в 2005 г. во Вьетнаме [Lu X., Edwards L.E., Desheva J.A., et al. Vaccine. - 2006. - Vol.24 (44-46). - P 6588-6593]. Для достижения 100% защиты от инфекции требовалось двукратное введение вакцины с адьювантом (Табл.8)

Таблица 8.
Эффективность против заражения антигенным вариантом вируса H5N1, выделенным во время вспышки во Вьетнаме в 2004 г.ПрепаратПуть введенияКратность введенияТитр нейтрализующих антител к вирусу А/Вьетнам/1203/04Средние титры вируса Ig ЭИД₅₀/млСнижение веса (%)Летальность / всегоЛегкиеНосовые ходыГоловной мозгЖГВинтраназально1<401.6±1.2≤0,8≤0,87,30/5ИГВвнутримышечно1<402,8±1,81,0±0,41,1±0,711,20/5ИГВвнутримышечно2<40≤0,8≤0,8≤0,88,00/5ИГВ+адьювантвнутримышечно2<40≤0,8≤0,8≤0,81,80/5Контрольинтраназально1<406,1±0,74,7±0,94,5±0,119,45/5

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2).

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2);

б) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2).

4. Количество пассажей - 7 в процессе рекомбинации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции - 33°, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность 1:512;

в) инфекционная активность 8,5±0,3 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторорезистентный;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С - 6,8 Ig ЭИД₅₀/мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С - 3,1 Ig ЭИД₅₀/мл;

ж) структура генома реассортанта:

- гены от апатогенного птичьего вируса - НА

- гены от донора аттенуации - PA, PB1, РВ2, NP, M, NS, NA

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации: 24.11.2005 г.;

б) объем материала во флаконе: 1 мл;

в) количество доз в серии: 4;

г) инфекционная активность - 7.5 Ig ЭИД₅₀/0.2 мл;

д) гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации 1:2.

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина - идентичен вирусу А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) по данным РТГА с крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы - идентична вирусу А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) по данным секвенирования.

9. Безвредность для мышей при подкожном и интраназальном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль лиофилизированного материала: дата проведения - 30 ноября 2005 г. - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/93 (H5N2), депонированный в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2389 - реассортант, полученный путем апатогенного птичьего вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86 (Н5N2) с холодоадаптированным температурочувствительным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Штамм активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33°С, характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью, унаследовал от донора аттенуации H5N2 ген, кодирующий поверхностный гликопротеин гемагглютинин, шесть генов, кодирующих негликозилированные белки и ген нейраминидазы. Штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) безвреден для животных и способен создавать защиту против высокопатогенных вирусов H5N1, обладающих пандемическим потенциалом. 8 табл.

Штамм вируса гриппа ГКВ 2389 для получения живой интраназальной и инактивированной парентеральной гриппозной вакцины.