Способ комбинированного выявления клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани на гистологических препаратах печени человека Российский патент 2025 года по МПК G01N33/52 A61B5/00 

Изобретение относится к медико-биологическим наукам и может быть использовано в морфологической диагностике заболеваний печени.

Клетки Купфера (КК) являются резидентными макрофагами печени и составляют самую большую популяцию тканевых макрофагов в организме [Choi W.-M. Kim M.-H.Jeong W.-I. Functions of hepatic non-parenchymal cells in alcoholic liver disease. Liver Res. 2019; 3: 80-87. DOI:10.1016/j.livres.2019.04.002]. КК локализуются во внутреннем пространстве синусоидов печени, играя важную роль в поддержании гомеостаза органа. Они выполняют защитную функцию, фагоцитируя чужеродные частицы и молекулы эндотоксинов, поступающие из желудочно-кишечного тракта через систему воротной вены. КК также осуществляют фагоцитоз стареющих и умирающих эритроцитов, обеспечивая переработку железа. Наконец, КК способны проходить через пространство Диссе и фагоцитировать апоптотические гепатоциты [Slevin Е, Baiocchi L, Wu N, Ekser В, Sato K, Lin E, Ceci L, Chen L, Lorenzo SR, Xu W, Kyritsi K, Meadows V, Zhou T, Kundu D, Han Y, Kennedy L, Glaser S, Francis H, Alpini G, Meng F. Kupffer Cells: Inflammation Pathways and Cell-Cell Interactions in Alcohol-Associated Liver Disease. Am J Pathol. 2020; 190(11):2185-2193. DOI:10.1016/j.ajpath.2020.08.014].

КК, как и все макрофаги, обладают функциональной пластичностью и способны быстро менять свой функциональный статус под влиянием факторов локального микроокружения [Stout R.D. Suttles J. Functional plasticity of macrophages: reversible adaptation to changing microenvironments. J Leukoc Biol. 2004; 76: 509-513. DOI:10.1189/jlb.0504272]. В норме КК обладают иммунологической толерантностью, что необходимо для предотвращения нежелательных иммунных реакций на попадание иммуногенного материала в печеночную синусоиду [Thomson AW, Knolle PA. Antigen-presenting cell function in the tolerogenic liver environment. Nat Rev Immunol. 2010; 10:753-766. DOI:10.1038/nri2858]. Однако, при развитии ряда заболеваний КК теряют свой толерогенный статус и переходят в активированное состояние, что может приводить к развитию воспалительного процесса в печени и гепатоцеллюлярному повреждению [Nagy LE. Recent insights into the role of the innate immune response in the development of alcoholic liver disease. Expt Biol Med. 2003; 228:882-890. DOI:10.1177/153537020322800803; Chiang DJ, Pritchard MT, Nagy LE. Obesity, diabetes mellitus, and liver fibrosis. Am J Physiol Gastromtest Liver Physiol. 2011; 300:G697-G702. DOI:10.1152/ajpgi.00426.2010]. С другой стороны, отмечена защитная и репаративная роль КК при остром и хроническом повреждении печени, развитии фиброза и цирроза. Показано, что КК могут способствовать выживанию гепатоцитов за счет синтеза противовоспалительных цитокинов, а также восстановлению тканей путем регуляции процесса ремоделирования внеклеточного матрикса. Последнее определяет ключевую роль КК при развитии фиброза печени [Li W, Chang N, Li L. Heterogeneity and Function of Kupffer Cells in Liver Injury. Front Immunol. 2022; 13: 940867. DOI:10.3389/fimmu.2022.940867]. Фиброз печени является универсальной реакцией органа на повреждение разной этиологии (инфекции, травмы, воздействия алкоголя, токсических веществ и препаратов и пр.). Это заболевание характеризуется накоплением в органе избыточного количества соединительной ткани (прежде всего, коллагеновых волокон) вследствие как увеличения ее синтеза, так и уменьшения скорости деградации. КК вовлечены в регуляцию состояния соединительной ткани печени через несколько механизмов. Они влияют на функциональную активность звездчатых клеток Ито - основных продуцентов коллагена в тканях печени, способствуя их активации и усиливая выработку ими коллагена посредством воздействия трансформирующего фактора роста бета-1 [Wu Н, Chen G, Wang J, Deng M, Yuan F, Gong J. TIM-4 interference in Kupffer cells against CCL4-induced liver fibrosis by mediating Akt1/Mitophagy signalling pathway. Cell Prolif. 2020; 53(1):e12731. DOI:10.1111/cpr.l2731; Tsuchida T, Friedman S. Mechanisms of hepatic stellate cell activation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2017; 14(7):397-411. DOI:10.1038/nrgastro.2017.38]. КК также способствуют выживанию клеток Ито [Terkelsen MK, Bendixen SM, Hansen D, Scott E, Moeller AF, Nielsen R, et al. Transcriptional Dynamics of Hepatic Sinusoid-Associated Cells After Liver Injury. Hepatology. 2020; 72: 2119-33]. С другой стороны, КК синтезируют матриксную металлопротеиназу 9 (ММР9), активность которой направлена на деградацию коллагеновых волокон [Feng М, Ding J, Wang М, Zhang J, Zhu X, Guan W. Kupffer-Derived Matrix Metalloproteinase-9 Contributes to Liver Fibrosis Resolution. Int J Biol Sci, 2018, 14:1033-40. DOI:10.7150/ijbs.25589]. Показано, что введение культивируемых in vitro КК мышам при экспериментальном фиброзе печени стимулирует деградацию соединительной ткани и облегчает течение заболевания [Li W, Не F. Infusion of Kupffer Cells Expanded in Vitro Ameliorated Liver Fibrosis in a Murine Model of Liver Injury. Cell Transplant. 2021; 30:9636897211004090. DOI:10.1177/09636897211004090].

Доказанная способность КК влиять на состояние коллагеновых волокон соединительной ткани, а также ключевая роль этих двух компонентов печени в развитии фиброза делает высоко актуальным их совместный анализ на препаратах печени человека.

Описано несколько методов для одновременного выявления макрофагов и коллагена на гистологических препаратах, которые могут быть использованы для сочетанной идентификации клеток Купфера, являющихся тканевыми макрофагами, и коллагеновых волокон соединительной ткани в печени:

1. выявление макрофагов путем прижизненной инъекции красящего вещества с одновременной гистохимической окраской коллагеновых волокон гистологическими красителями;

2. двойное иммунофлуоресцентное окрашивание макрофагов и коллагена.

Первый метод основан на прижизненном введении красителя в кровеносную систему экспериментального животного с последующей окраской гистологических препаратов печени этого животного одним из трихромных методов (методом окраски по Маллори или по Массону). Прижизненно введенный краситель способен накапливаться в цитоплазме макрофагов благодаря присущей этим клеткам способности к фагоцитозу (поглощению чужеродных молекул). В качестве красителя используют китайскую тушь, литиевый кармин или 1%-й раствор изаминового синего, которые инъецируют в вену прижизненно. Затем с фиксированных в формалине органов делают срезы и наблюдают накопление красителя в фагосомах макрофагов. Цитоплазма макрофагов в этом случае приобретает черное, иссиня-черное или темно-коричневое окрашивание, благодаря чему они хорошо визуализируются на препаратах. Последующее окрашивание этих препаратов с использованием трихромных методов окрашивания Маллори или Массона с красителем анилиновым синим позволяют идентифицировать коллаген соединительной ткани [Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. 3-е изд. - М.: Советская наука, 1957. - 467 с]. Главный недостаток этой методики заключается в том, что прижизненная инъекция красителя неприменима в отношении человека, что делает невозможным выявление макрофагов, в том числе клеток Купфера, в печени у человека с использованием этого подхода.

Второй метод, который может быть использован для сочетанного выявления клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани, связан с применением многоканальной флуоресцентной иммуногистохимии. Этот метод предполагает постановку на гистологических препаратах двойной иммунофлуоресцентной реакции с использованием антител против маркерных белков макрофагов (например, CD68, F4/80, Iba1) и коллагена [Liu W, С, N, Rask-Andersen H. Human Inner Ear Immune Activity: A Super-Resolution Immunohistochemistry Study. Front Neurol. 2019 Jul 10;10:728. DOI:10.3389/fheur.2019.00728]. Метод надежен и высоко информативен, однако не подходит для широкого использования в связи с высокой трудоемкостью, необходимостью закупки многочисленных дорогостоящих импортных реактивов (двух типов первичных антител и двух типов вторичных антител, а также сопутствующих реагентов), что приводит к значительным материальным затратам. Помимо этого, постановка двойной иммунофлуоресцентной реакции требует высокой квалификации персонала, а также наличия специального дорогостоящего оборудования (конфокального микроскопа) для проведения анализа полученных препаратов.

С целью визуализации и оценки состояния клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани в печени у человека нами был разработан новый метод, который представляет собой комбинацию методов гистохимии и иммуногистохимии и осуществляется следующим образом:

1. Образцы печени фиксируют в 10% формалине, обезвоживают и заливают в парафин любым из рекомендованных для иммуноцитохимических исследований способом. Из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы толщиной от 5 до 10 микрометров и наклеивают их на предметные стекла с нанесенным адгезивным покрытием на основе бычьего сывороточного альбумина (патент RU 2386137 С1) либо на фабричные стекла с адгезивным покрытием (например, HistoBond фирмы Marienfeld, Германия). Полученные препараты высушивают в термостате при температуре 40°С.

2. Удаляют из срезов парафин и проводят по спиртам понижающей концентрации до дистиллированной воды.

3. Переносят препараты в 3%-ый водный раствор перекиси водорода и оставляют в нем на 5 мин при комнатной температуре, после чего промывают препараты в дистиллированной воде в течение 5 мин.

4. Препараты помещают в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (рН=7,4) и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Буферный раствор может быть приготовлен из таблетированной формы.

5. Аккуратно промакивают фильтровальной бумагой предметное стекло вокруг срезов для образования сухого поля и обводят срезы гидрофобным фломастером (например, DakoPen, Liquid Blocker, PAP Pen и др.), не допуская высыхания срезов.

6. Наносят на срезы коммерческий раствор кроличьих моноклональных антител против кальций-связывающего белка Iba1 клона JM36-62 (например, фирмы HuaBio, КНР) в концентрации 1 мг/л. Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения антител. Размещают стекла во влажной камере (например, в квадратные чашки Петри 100x100 мм, SARSTEDT: 82.9923.422, Австралия) и оставляют их в термостате при температуре 35°С на 20 часов. Перед началом инкубации в каждую влажную камеру необходимо налить по 5-10 мл дистиллированной воды для предотвращения испарения раствора со срезов и их высыхания. В качестве подставок под предметные стекла можно использовать крышки от маленьких (40 мм) пластиковых чашек Петри для предотвращения контакта предметных стекол с водой.

7. Промывают препараты в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 5 мин.

8. Наносят на срезы вторичные антитела против иммуноглобулинов кролика, например, реагент Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit - Micro-polymer (Abcam, Великобритания) или аналогичные реагенты других производителей (например, МАСН2 Universal HRP Polymer Kit for mouse or rabbit (Biocare Medical, США), Ultra Vision Quanto HRP DAB Detection System (Thermo Fisher Scientific, США). Аккуратно покачивают предметное стекло для равномерного распределения раствора антител. Стекла размещают во влажной камере и помещают в термостат при температуре 27°С на 40 мин.

9. Последовательно промывают препараты в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 5 мин и в дистиллированной воде в течение 5 мин.

10. Наносят на срезы рабочий раствор хромогена 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида, например, из набора DAB Quanto (Thermo Fisher Scientific, США). В течение 1-3 мин происходит образование окрашенного продукта иммуногистохимической реакции. Этот процесс необходимо контролировать под микроскопом, чтобы остановить реакцию до появления неспецифического фонового окрашивания.

11. Смывают раствор хромогена 3%-м раствором перекиси водорода и промывают препараты в двух порциях дистиллированной воды (по 5 мин в каждой).

12. Наносят на срезы 1%-й водный раствор фосфорномолибденовой кислоты и инкубируют 15 мин при комнатной температуре.

13. Аккуратно сливают раствор фосфорномолибденовой кислоты со срезов и, не промывая препараты, наносят на них свежеприготовленный 1%-ый водный раствор красителя анилинового синего (Unisource Chemicals LTD, Индия) с добавлением ледяной уксусной кислоты (из расчета 400 мкл кислоты на 100 мл раствора). Препараты инкубируют в растворе красителя в течение 7 мин при комнатной температуре.

14. Промывают препараты в дистиллированной воде в течение 5 мин.

15. Обезвоживают срезы в спиртах восходящей крепости и просветляют в ксилоле обычным способом.

16. Заключают препараты в заключающую среду (например, полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды).

При анализе препаратов с использованием световой микроскопии иммунопозитивные клетки (коричневый цвет), локализованные в синусоидах печени, являются клетками Купфера. Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашены в насыщенный синий цвет.

На фиг. 1 приведена микрофотография участка печени человека (мужчина, 58 лет). Иммуногистохимическая реакция на Iba1, визуализация с помощью диаминобензидина, с одновременной окраской коллагеновых волокон соединительной ткани анилиновым синим. В синусоидах печени визуализируются клетки Купфера (коричневый цвет, короткая стрелка). Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашены в насыщенный синий цвет (длинная стрелка). Звездочка маркирует просвет кровеносного сосуда. Увеличение объектива 40х. Масштабный отрезок равен 50 микрометров.

Предложенный метод характеризуется хорошей воспроизводимостью и высокой селективностью в отношении выявления клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани. Метод применим для использования на материале человека. По сравнению с постановкой двойной иммунофлуоресцентной реакции, разработанный метод прост в реализации и требует наличия только светового микроскопа, что делает его доступным большинству научно-исследовательских и клинико-диагностических лабораторий. Применение разработанного метода позволяет отказаться от дополнительного флуоресцентного маркирования коллагена, что значительно снижает стоимость методики и ее трудозатратность. Визуализируемые таким способом клетки Купфера и коллагеновые волокна могут быть проанализированы количественно.

Изобретение относится к медико-биологическим наукам и касается способа комбинированного выявления клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани на гистологических препаратах печени человека. Осуществляют фиксацию препарата в 10% формалине, процедуру обезвоживания, заливку в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 10 микрометров, нанесение их на предметные стекла с адгезивным покрытием, высушивание в термостате при температуре 40°С, удаление из срезов парафина, проводку по спиртам понижающей концентрации до дистиллированной воды, инкубацию в 3% водном растворе перекиси водорода в течение 5 минут при комнатной температуре. Осуществляют промывание препаратов в дистиллированной воде в течение 5 минут, промывание препаратов в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с pH = 7,4 в течение 5 минут, нанесение на срезы раствора кроличьих моноклональных антител против кальций-связывающего белка Iba1 клона JM36-62 в концентрации 1 мг/л. Осуществляют инкубацию препаратов во влажной камере с добавлением в нее 5-10 мл дистиллированной воды в термостате при повышенной температуре 35°С в течение 20 часов, промывку препаратов в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с pH = 7,4 в течение 5 минут, нанесение на срезы вторичных антител против иммуноглобулинов кролика и инкубацию препаратов во влажной камере в термостате при температуре 27°С в течение 40 минут. Осуществляют последовательную промывку препаратов в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с pH = 7,4 в течение 5 минут и в дистиллированной воде в течение 5 минут, нанесение на срезы рабочего раствора хромогена 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида с контролем развития реакции под микроскопом. Осуществляют промывку препаратов в двух порциях дистиллированной воды, нанесение на срезы 1% водного раствора фосфорномолибденовой кислоты на 15 минут при комнатной температуре, удаление раствора со срезов и нанесение на них свежеприготовленного 1% водного раствора красителя анилинового синего с добавлением ледяной уксусной кислоты из расчета 400 мкл кислоты на 100 мл раствора красителя, инкубацию срезов в растворе красителя в течение 7 минут при комнатной температуре, промывку в дистиллированной воде в течение 5 минут, обезвоживание в спиртах восходящей крепости, просветление в ксилоле и заключение в перманентную среду. Осуществляют анализ препаратов с использованием световой микроскопии. При этом иммунопозитивные клетки, локализованные в синусоидах печени и окрашенные в коричневый цвет, - клетки Купфера, коллагеновые волокна соединительной ткани окрашены в насыщенный синий цвет. Изобретение обеспечивает хорошую воспроизводимость и высокую селективность в отношении выявления клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани, применимо для использования на материале человека. Способ прост в исполнении, доступен, значительно снижает стоимость методики и ее трудозатратность. Визуализируемые таким способом клетки Купфера и коллагеновые волокна могут быть проанализированы количественно. 1 ил.

Способ комбинированного выявления клеток Купфера и коллагеновых волокон соединительной ткани на гистологических препаратах печени человека, включающий фиксацию препарата в 10% формалине, процедуру обезвоживания, заливку в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 10 микрометров, нанесение их на предметные стекла с адгезивным покрытием, высушивание в термостате при температуре 40°С, удаление из срезов парафина, проводку по спиртам понижающей концентрации до дистиллированной воды, инкубацию в 3% водном растворе перекиси водорода в течение 5 минут при комнатной температуре, промывание препаратов в дистиллированной воде в течение 5 минут, промывание препаратов в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с рН=7,4 в течение 5 минут, нанесение на срезы раствора кроличьих моноклональных антител против кальций-связывающего белка Ibal клона JM36-62 в концентрации 1 мг/л, инкубацию препаратов во влажной камере с добавлением в нее 5-10 мл дистиллированной воды в термостате при повышенной температуре 35°С в течение 20 часов, промывку препаратов в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с рН=7,4 в течение 5 минут, нанесение на срезы вторичных антител против иммуноглобулинов кролика и инкубацию препаратов во влажной камере в термостате при температуре 27°С в течение 40 минут, последовательную промывку препаратов в 0,01 М фосфатно-солевом буфере с рН=7,4 в течение 5 минут и в дистиллированной воде в течение 5 минут, нанесение на срезы рабочего раствора хромогена 3,3'-диаминобензидинтетрагидрохлорида с контролем развития реакции под микроскопом, промывку препаратов в двух порциях дистиллированной воды, нанесение на срезы 1% водного раствора фосфорномолибденовой кислоты на 15 минут при комнатной температуре, удаление раствора со срезов и нанесение на них свежеприготовленного 1% водного раствора красителя анилинового синего с добавлением ледяной уксусной кислоты из расчета 400 мкл кислоты на 100 мл раствора красителя, инкубацию срезов в растворе красителя в течение 7 минут при комнатной температуре, промывку в дистиллированной воде в течение 5 минут, обезвоживание в спиртах восходящей крепости, просветление в ксилоле и заключение в перманентную среду, осуществление анализа препаратов с использованием световой микроскопии, при этом иммунопозитивные клетки, локализованные в синусоидах печени и окрашенные в коричневый цвет, - клетки Купфера, коллагеновые волокна соединительной ткани окрашены в насыщенный синий цвет.