Способ метахроматической идентификации с визуализацией триптаза-позитивных тучных клеток Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 

Изобретение относится к медико-биологическим наукам, а именно к клеточной биологии, цитологии, гистологии, предназначено для окрашивания и анализа тканей, клеток или компонентов клеток на предметных стеклах.

Каждый орган обладает специализированными клеточными ансамблями тканей, которые используют для поддержания местного гомеостаза собственные регуляторные механизмы. В управлении клеточными кооперациями активно принимают участие тучные клетки (ТК), уникальность которых заключается в регуляции функций адаптированного сенсорного аппарата при взаимодействии с информационно значимым сигналам интегративно-буферной метаболической среды а так же полифункционального эффекторного аппарата, представленного секретомом.

Особое значение имеют специфические протеазы тучных клеток - триптаза и химаза, секреторные пути которых представляют собой различные варианты выведения веществ во внеклеточный матрикс с высокой избирательностью по отношению к внешним вызовам [Atiakshin D., Buchwalow I.,- Samoilova V., Tiemann M. Tryptase as a polyfunctional component of mast cells. Histochemistry and Cell Biology. 2018, 149(5), 461-477; Atiakshin D., Samoilova V., Buchwalow I., Boecker W., Tiemann M. Characterization of mast cell populations using different methods for their identification. Histochem Cell Biol. 2017; 147(6):683-694].

На сегодняшний день методическая база морфологического анализа популяции тучных клеток в светлопольной микроскопии с одновременной иммуногистохимической детекцией триптаза-позитивных тучных клеток имеет ограничения.

Известна методика иммуногистохимической идентификации триптазы тучных клеток мышиными моноклональными антителами Anti-MastCellTryptaseantibody, AbCam, разведение не менее 1:2000, согласно стандартному протоколу [Buchwalow IB, Boocker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. 1st ed. London: New York: Springer; ISBN 978-3-642-04609-4; 2010. URL: https://www.springer.com/gp/book/9783642046087]. LoMonora4Hbie мышиные иммуноглобулины блокируются при предварительной инкубации срезов с неконъюгированными Fab-фрагментами Goatanti-mouseIgG, Jackson Immuno Researh, разведение не менее 1:13. Для светлопольной микроскопии связанные первичные антитела детектируются с помощью пероксидазы хрена AmpliStain™ HorseradishPeroxidaseconjugates в соответствии с инструкцией производителя. В дальнейшем ферментную метку визуализируют набором с 3,3'-диаминобензидином в качестве субстрата DABsubstratekit, VectorLaboratories. Срезы докрашивают гематоксилином Майера и эозином, далее заключают в монтажную среду.

Недостатки метода: идентифицируются только ТК содержащие большое количество гранулы с триптазой. При малой наполненности триптаза-позитивными гранулами ТК могут идентифицироваться как свободнолежащие гранулы или цитопласт. Невозможно визуализировать триптаза-негативные, то есть не содержащие триптазу ТК.

Способ иммунофлуоресцентной детекции триптазы в тучных клетках включает несколько стадий. Инкубация с первичными антителами к триптазе в разведении не менее 1:2000 проводится в течение ночи при температуре +4°С. Связанные антитриптазные первичные антитела в рабочей концентрации 10 мг / мл PBS визуализируют с помощью козьих вторичных антител, конъюгированных с Су3 СуТМ3-conjugatedAffinPureGoatAntiMouseIgG и используют соответствующий набор фильтров. Ядра контрастируют неинтеркалирующим красителем DAPI, после чего срезы заключают в монтажную среду Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, США. Иммунофлуоресцентную маркировку выполняют в соответствии со стандартными протоколами

Недостатки метода: при хорошей возможности анализа триптазного профиля ТК невозможно визуализировать триптаза-негативные ТК. Данная методика, рассчитанная на использование иммунофлуоресцентной микроскопии в темном поле с использованием специальных фильтров и подсветок на микроскопе, имеет ограничения для использования в лабораториях, не имеющих дорогостоящего оснащения, в том числе в патологоанатомических бюро, клинических гистологических лабораториях.

Известный способ для определения числа тучных клеток, обладающих метахроматическими свойствами, основан на использовании окрашивания толуидиновым синим для тучных клеток [Buchwalow IB, Boocker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. 1st ed. London: New York: Springer; 2010. URL: https://www.springer.com/gp/book/9783642046087]. Для этого депарафинированные срезы помещают в дистиллированную воду, затем окрашивают в рабочем растворе толуидинового синего, 50 мл раствора красителя толуидинового синего и 2 мл модификатора для окраски тучных клеток. После окрашивания 10-25 минут и промывают дистиллированной водой. Ополаскивают в 96% этаноле и помещают в новую порцию 96% этанола на 1-4 минуты. Затем просветляют и заключают. В результате ядра клеток окрашиваются в синий цвет, базофильные структуры цитоплазмы клеток в синий и голубой цвет - ортохроматическая окраска, гранулы тучных клеток (ТК) и основное вещество гиалинового хряща имеют фиолетовые оттенки метахроматическая окраска, коллагеновые волокна, эритроциты - не окрашены.

Недостатки метода: невозможно проанализировать триптазный профиль ТК, то есть подсчитать количество содержащих триптазу и не содержащих триптазу тучных клеток.

Классические методики, включающие иммуногистохимическое окрашивание триптазы с докрашиванием гематоксилином Майера, и окрашивание толуидиновым синим, не могут объективно характеризовать уровень экспрессии триптазы в органоспецифичной популяции тучных клеток.

Технический результат - идентификация тучных клеток в светлопольной микроскопии с одновременной иммуногистохимической детекцией объема содержания триптазы в тучных клетках.

Разработанный способ позволяет повысить точность оценки протеазного профиля популяции тучных клеток с учетом цитотопографии гранул с триптазой и их направленной миграции от ядра к плазматической мембране при использовании светлопольной микроскопии. Способ позволяет объективно интерпретировать и характеризовать вовлеченность ТК в течение адаптивных или патологических процессов, а так же визуализировать процесс биогенеза и секреторных путей триптазы ТК, цитотопографии ее гранул и их направленной миграции от ядра к плазматической мембране (фиг. 2).

Определение частоты солокализации ТК с гранулоцитами, лимфоцитами, макрофагами, а также представителями фибробластического дифферона дает возможность оценить и интерпретировать с точки зрения гистотопографии вопросы межклеточного сигналлинга в специфическом тканевом микроокружении.

Использование светлопольной микроскопии позволяет использовать предложенную методику практически любым, в том числе небольшим и мало оснащенным лабораториям.

Технический результат достигаю путем окрашивания микропрепаратов в два этапа с использованием на втором этапе окрашивания толуидинового синего вместо стандартного докрашивания гематоксилином Майера и эозином.

На первом этапе проводят иммуногистохимическую детекцию триптазы согласно стандартному подходу [Buchwalow IB, Boocker W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. 1st ed. London: New York: Springer; 2010. URL: https://www.springer.com/gp/book/9783642046087 (дата обращения 11.08.2021)].

Срезы депарафинизируют и инкубируют с мышиными моноклональными антителами, разведение не менее 1:2000 в течение двенадцати часов. Затем наносят вторичные антитела, коньюгированные с HRP (Goat anti-Mouse IgG H&L, #AS-M1-HRP), которые выявляют реагентом ImmPACTTM DAB Peroxidase Substrat Kit (#SK-4105) согласно инструкции производителя. В результате при завершении первого этапа на микропрепаратах визуализируют только триптаза-позитивные ТК, отдельно лежащие гранулы триптазы либо фрагменты цитоплазмы.

На втором этапе срезы докрашивают для выявления метахромазии клеток толуидиновым синим по предложенным нами модифицированным протоколам.

А именно, после иммуногистохимического окрашивания и визуализации специфического коричневого окрашивания свидетельствующего о наличии триптазы, незамедлительно, не допуская высыхания препарата после первого этапа окрашивания, на срез ткани наносят толуидиновый синий. Протокол окрашивания срезов толуидиновым синим выполняют по стандартным методикам.

На срезы ткани, промытые дистиллированной водой после иммуногистохимического окрашивания, наносят 1,5-2 мл рабочего раствора толуидинового синего, время экспозиции от 3 - 10 минут.

Споласкивают в изопропиловом спирте. Выдерживают посменно в двух порциях изопропилового спирта не менее, чем по 30 сек в каждой порции.

Просветляют не менее, чем в трех порциях О-Ксилола не менее, чем по 3 минуты в каждой порции.

Наносят на препарат монтажную среду, покрывают препарат покровным стеклом.

Методический прием сочетания иммуногистохимического и гистохимического протоколов окрашивания позволяет провести одновременную метахроматическую идентификацию популяции тучных клеток с визуализацией триптаза-позитивных ТК, что позволяет уточнить особенности в структуре популяции тучных клеток и питотопографию триптазы в отдельных клетках. Способ дает возможность объективно оценить органоспецифичные особенности триптазного профиля популяции тучных клеток.

При помогли методики двойного окрашивания установлено, что различные тучные клетки могут содержать как единичные гранулы, так и гранулы заполняющие от одной трети до двух третей объема цитоплазмы клетки. Встречаются ТК с полным заполнение цитоплазмы триптазой (фиг. 1).

На микрофотографии (фиг. 2) обращает на себя внимание разное содержание триптаза-позитивных гранул в клетках. Мы наблюдали перинуклеарный и периферический, практически соприкосновение с плазмалеммой, вариант положения гранул триптазы. Данный факт может быть рассмотрен как этапы биогенеза триптазы и использован для интерпретации хронологии биосинтеза и секреции протеазы во внеклеточный матрикс. При рассмотрении деталей интрагранулярного расположения триптазы следует отметить, что свойствами метахромазии в большей степени обладала центральная область гранулы. Молекулы триптазы чаще локализовались по периферии гранулы, окаймляя гранулу (фиг. 2).

Описание к фигурам.

Фиг. 1. Типы тучных клеток в зависимости от уровня экспрессии триптазы. Фиксация - 10% нейтральный формалин. Иммуногистохимическое окрашивание на триптазу ТК с докрашиванием толуидиновым синим.

1 - тучная клетка с низким уровнем экспрессии триптазы, цитоплазма окрашена базофильно, имеет фиолетовый цвет, гранулы триптазы имеют коричневую окраску, количество их в клетке незначительно;

2 - тучная клетка с высоким уровнем экспрессии триптазы, цитоплазма окрашена базофильно, имеет фиолетовый цвет, бо'льшая часть цитоплазмы заполнена гранулами триптазы, имеющими коричневую окраску.

Фиг. 2. Цитотопографические особенности секретома тучных клеток. Фиксация - 10% нейтральный формалин. Иммуногистохимическое окрашивание на триптазу ТК с докрашиванием толуидиновым синим.

3 - ядро тучной клетки, окрашено в синий цвет;

4 - гранулы, практически полностью заполненные триптазой, имеют темно-коричневую окраску;

5 - гранулы, содержащие большое количество триптазы, окаймляющей секреторные гранулы по периферии - ободок коричневого цвета, окружающий метахроматически окрашенную субстанцию секретома в центре гранулы.

6 - гранулы не содержащие триптазу, имеют фиолетовое окрашивание.

Изобретение относится к медико-биологическим наукам, а именно к клеточной биологии, цитологии, гистологии, предназначено для одновременной визуализации популяции тучных клеток с признаками метахромазии и триптаза-позитивными гранулами в гистологических срезах микропрепаратов тканей. Способ включает: фиксацию 10%-м нейтральным формалином, иммунногистохимическую детекцию триптазы с использованием моноклональных антител, с завершением подготовки путем заключения микропрепарата в монтажную среду. После иммуногистохимического окрашивания незамедлительно, не допуская подсыхания микропрепарата, наносят 1,5-2 мл раствора толуидинового синего, выдерживают от 3 до 10 минут. Промывают изопропиловым спиртом посменно в двух порциях изопропилового спирта не менее чем по 30 секунд в каждой порции; просветляют не менее трех раз в О-Ксилоле, выдерживая каждый раз три минуты. Способ позволяет повысить точность оценки протеазного профиля популяции тучных клеток с учетом цитотопографии гранул с триптазой и их направленной миграции от ядра к плазматической мембране при использовании светлопольной микроскопии, объективно интерпретировать и характеризовать вовлеченность ТК в течение адаптивных или патологических процессов, а также визуализировать процесс биогенеза и секреторных путей триптазы ТК, цитотопографии ее гранул и их направленной миграции от ядра к плазматической мембране. 2 ил.

Способ одновременной визуализации популяции тучных клеток с признаками метахромазии и триптаза-позитивными гранулами в гистологических срезах микропрепаратов тканей, включающий фиксацию 10%-м нейтральным формалином, иммунногистохимическую детекцию триптазы с использованием моноклональных антител, с завершением подготовки путем заключения микропрепарата в монтажную среду, отличающийся тем, что после иммуногистохимического окрашивания незамедлительно, не допуская подсыхания микропрепарата, наносят 1,5-2 мл раствора толуидинового синего, выдерживают от 3 до 10 минут, промывают изопропиловым спиртом посменно в двух порциях изопропилового спирта не менее чем по 30 секунд в каждой порции; просветляют не менее трех раз в О-Ксилоле, выдерживая каждый раз три минуты.