Способ выявления тучных клеток на гистологических препаратах сердца человека Российский патент 2023 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 

Изобретение относится к медико-биологическим наукам и может быть использовано в медицинской диагностике заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Тучные клетки (мастоциты) встречаются во многих органах и тканях. Выполняемая ими функция опосредуется микроокружением, которое оказывают заметное влияние на способность тучных клеток специфически распознавать и реагировать на различные внешние стимулы посредством высвобождения путем дегрануляции ряда биологически активных медиаторов. Это позволяет тучным клеткам реагировать на изменения в окружающих тканях и взаимодействовать с множеством других клеток, то есть, участвовать в разных физиологических и иммунологических реакциях. В частности, тучные клетки рассматриваются как эффекторы аллергии, особенно на иммунологической и патохимической стадиях аллергических реакций, которые могут приводить к развитию аллергических заболеваний, например, бронхиальной астме или аллергическому риниту. Тучные клетки участвуют в развитии процессов регенерации и ремоделирования органов, патогенезе аутоиммунных заболеваний и могут способствовать развитию опухолей [Elieh АН Komi D., Wohrl S., Bielory L. Mast cell biology at molecular level: a comprehensive review. Clinical reviews in allergy & immunology, 2020, v.58, №3, p.342-365].

Тучные клетки присутствуют в миокарде человека. Недавние исследования показали, что тучные клетки могут участвовать как в физиологических, так и в патологических, процессах в сердце и, таким образом, оказывать различные и даже противоположные эффекты. При этом, число тучных клеток в ткани сердца возрастает при сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как ишемическая болезнь сердца и атеросклероз [Reid А. С, Silver R. В., Levi R.. Renin: at the heart of the mast cell. Immunological reviews, 2007, v. 217, p.123-140], а накопление этих клеток в атеросклеротических бляшках, вероятно, указывает на их возможное влияние на развитие инфаркта и инсульта [Varricchi G., de Paulis A., Marone G., Galli S. J. Future needs in mast cell biology. International journal of molecular sciences, 2019, v. 20, №18, p. 4397].

В связи с этим, тучным клеткам уделяется особое внимание как в фундаментальных, так и в клинических научных исследованиях. При этом, многие результаты этих работ, касающиеся выявления тучных клеток в тканях человека, представляются противоречивыми в связи с методическими ограничениями а также различиями морфологических характеристик тучных клеток, варьирующих в зависимости от локализации в организме [Moon Т. С, St Laurent С.D., Morris K. Е., Marcet С, Yoshimura Т., Sekar Y., Befus A. D. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal immunology, 2010, v. 3, №2, p.111-128]. Поэтому, данные гистологических исследований тучных клеток одного органа имеют свои особенностями трактовки по отношению к данным, полученным при изучении другого органа. Учитывая это, важным представляется разработка методики, подходящей для изучения структурно-функциональных особенностей популяции тучных клеток конкретного органа.

Таким образом, высока актуальность использования надежных и легковоспроизводимых методов качественной и количественной оценки тучных клеток в сердце человека, которые могут отражать функциональное состояние сердечно-сосудистой системы.

В настоящее время предложено несколько методов выявления тучных клеток:

1. гистохимическое выявление гистологическими красителями;

2. иммуногистохимические методы с использованием микроскопии в проходящем свете;

3. многомаркерная иммунофлуоресцентная реакция.

Первый метод относится к классическим гистохимическим методикам окраски. Для выявления мастоцитов широко распространено использование основных анилиновых красителей. К их числу относятся: крезиловый фиолетовый, толуидиновый синий, азур А, тионин. Эти красители окрашивают тучные клетки метахроматически, связываясь с содержащимися в них кислыми мукополисахаридами.

Метахромазия фиолетового оттенка, которую демонстрируют основные анилиновые красители, такие как: крезиловый фиолетовый, толуидиновый синий, метиленовый синий, азур А, тионин, плохо поддаются регистрации с помощью цифровых камер, которыми оснащены лабораторные микроскопы. При правильно выстроенном балансе белого фиолетовый оттенок красителей смещается в синюю область спектра. Таким образом, это способствует неправильной цветопередаче и демонстрирует отсутствие метахромазии.

Важно упомянуть, что метахромазия крезилового фиолетового выражена слабо, а окрашивание тучных клеток толуидиновым синим зависит от метода фиксации. Основной фиксатор, применяемый в патологических исследованиях - 10%-й формалин, плохо сохраняют метахромазию. Однако, даже при применении неальдегидных фиксаторов, важно иметь в виду, что толуидиновый синий вызывает метазромазию не только тучных клеток, но и гранул макрофагов и базофилов, секрета бокаловидных клеток кишечника [Григорьев И.П., Коржевский Д.Э. Современные технологии визуализации тучных клеток для биологии и медицины (обзор). Современные технологии в медицине, 2021, т. 13, №4, с. 93-109].

Альциановый синий относится к группе медьсодержащих фталоцианиновых красителей и используется в комбинации с сафранином О (или сафранин). В результате этого метода тучные клетки с низким содержанием гепарина окрашены в синий цвет (альциановый синий), а гепаринсодержащие мастоциты - в красный и розовый (сафранин). Недостаток применения альцианового синего для изучения тучных клеток состоит в том, что альциановый синий, помимо тучных клеток, окрашивает компоненты межклеточного вещества соединительной ткани, а также скопления амилоида, что может доставить неудобства в идентификации и подсчете тучных клеток.

Для устранения недостатков гистохимических методов в дальнейшем были разработаны более чувствительные, второй и третий методы, основанные на использовании высокоселективных иммуногистохимических реакций на специфичные ферменты тучных клеток, такие как триптаза и химаза. Эти методические подходы лимитированы рядом факторов. Иммуногистохимия в проходящем свете является дорогостоящим, плохо поддающимся стандартизации и трудоемким способом выявления.

Третий метод - применение многоканальной флуоресцентной иммуногистохимии представляется наиболее информативным методом анализа тучных клеток, однако, не подходит для широкого использования в связи с значительной трудоемкостью и материальными затратами на реагенты для иммунофлуоресценции и приобретение специального оборудования, поскольку требует использование дорогостоящего оборудования.

Для изучения архивного или операционного гистологического материала с целью визуализации и оценки состояния тучных клеток в сердце человека нами был разработан новый способ гистохимического выявления тучных клеток на гистологических срезах.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Материал для исследования, фиксированный в 10% формалине, обезвоживают и заливают в парафин любым из рекомендованных для иммуноцитохимических исследований способов. Из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы толщиной от 5 до 10 микрометров и наклеивают их на предметные стекла с нанесенным адгезивным покрытием на основе бычьего сывороточного альбумина (патент RU 2386137 С1) либо на фабричные стекла, ранее обработанные адгезивным покрытием (например, HistoBond фирмы Marienfeld, Германия). Полученные препараты высушивают в термостате при температуре 40°С.

2. Производят депарафинизацию срезов в ксилоле и их регидратацию.

3. Препараты подвергают прогрессивной окраске альциановым синим 8GX (C.I.74240) в сосудах Коплина, в которые предварительно наливают свежеприготовленный раствор красителя и инкубируют в термостате в течение 18-20 часов при температуре 40°С. Для приготовления красителя используют два раствора: 1%-й водный раствор альцианового синего и 5%-й водный раствор уксусной кислоты. 1%-й водный раствор альцианового синего готовится следующим образом: тщательно помешивая, растворить 1 г альцианового синего в 100 мл теплой (30-40°С) дистиллированной воды, добавить 2 мл ледяной уксусной кислоты, профильтровать, добавить 0,1 г тимола.

5%-й водный раствор уксусной кислоты готовят из раствора ледяной уксусной кислоты (ЧДА, например, фирмы Вектон). Рабочий раствор красителя получают смешиванием 1%-го альцианового синего и 5%-й уксусной кислоты в соотношении 1:40.

4. Препараты достают из теплого раствора и, не допуская высыхания срезов, помещают в стаканчики с дистиллированной водой и промывают в течение 5 минут.

5. Фиксируют окраску путем ополаскивания образцов в 0,01% растворе аммиака в течение 30 с.

6. Промывают в двух сменах чистой дистиллированной воды по 5 мин.

7. Аккуратно удалив со стекол фильтровальной бумагой избыточное количество жидкости, наносят кислый 0,2%-й водный раствор ядерного прочного красного (C.1.60760), например, фирмы Sigma Aldrich, США). Рабочий раствор красителя готовят следующим образом: добавляют 10 г алюмоаммонийных квасцов (ЧДА, например, фирмы Вектон) в 100 мл дистиллированной воды, нагревают на водяной бане до полного растворения квасцов, затем добавляют 0,2 г красителя, нагревают до кипения. После извлечения из водяной бани раствор остужают, добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты, фильтруют. При охлаждении может появляться осадок, образованный прозрачными кристаллами квасцов. Предметные стекла с нанесенным на них раствором красителя аккуратно покачивают для равномерного распределения раствора и окрашивают 1 минуту.

8. Промывают препараты в чистой дистиллированной воде.

9.Обезвоживают препараты в спиртах восходящей крепости, просветляют в ксилоле обычным образом.

10. Заключают препараты в фиксирующую среду (полистирол, пермаунт, DPX или другие подобные среды).

При проведении световой микроскопии тучные клетки имеют сине-зеленую окраску, ядра клеток красно-малиновые.

На фиг. 1 приведена микрофотография участка эпикарда. Между адипоцитами видна тучная клетка (синий цвет). Окраска тучных клеток альциановым синим и подкраской ядер ядерным прочным красным. Увеличение ок 10х, об 40х.

На фиг. 2 приведена микрофотография тучных клеток (синий цвет) в соединительной ткани миокарда на большом увеличении. Окраска тучных клеток альциановым синим и подкраской ядер ядерным прочным красным. Увеличение ок 10х, об 100х.

Метод прост для воспроизведения, может быть использован для исследования архивного материала, хранящегося в парафиновых блоках.

Изобретение может быть использовано в медицинской диагностике заболеваний сердечно-сосудистой системы. Способ выявления тучных клеток на гистологических препаратах сердца человека включает фиксацию препарата в 10%-ном формалине, процедуру обезвоживания, заливку в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 10 мкм, нанесение их на предметные стекла, высушивание в термостате, депарафинизацию в ксилоле, регидратацию, окрашивание в свежеприготовленном рабочем растворе красителя, промывку срезов и подкраску препаратов ядерным прочным красным, обезвоживание в спиртах восходящей крепости, просветление в ксилоле и заключение в фиксирующую среду. При этом препараты подвергают прогрессивной окраске альциановым синим 8 GX (C.I.74240) при температуре 40°С в течение 18-20 ч, причем рабочий раствор красителя альцианового синего получают смешиванием 1%-ного альцианового синего и 5%-ной уксусной кислоты в соотношении 1:40, после чего фиксируют окраску в течение 30 с в 0,01%-ном растворе аммиака, затем в течение 1 мин подкрашивают ядра клеток 0,2%-ным кислым раствором ядерного прочного красного (C.I.60760), который готовят путем растворения 10 г алюмоаммонийных квасцов в 100 мл дистиллированной воды, с последующим добавлением 0,2 г красителя ядерного прочного красного (C.I.60760), нагревания до кипения, остужения и добавления 5 мл ледяной уксусной кислоты. Способ прост для воспроизведения, может быть использован для исследования архивного материала, фиксированного в 10%-ном формалине, хранящегося в парафиновых блоках. 2 ил.

Способ выявления тучных клеток на гистологических препаратах сердца человека, включающий фиксацию препарата в 10%-ном формалине, процедуру обезвоживания, заливку в парафин, приготовление гистологических срезов толщиной от 5 до 10 мкм, нанесение их на предметные стекла, высушивание в термостате, депарафинизацию в ксилоле, регидратацию, окрашивание в свежеприготовленном рабочем растворе красителя, промывку срезов и подкраску препаратов ядерным прочным красным, обезвоживание в спиртах восходящей крепости, просветление в ксилоле и заключение в фиксирующую среду, отличающийся тем, что препараты подвергают прогрессивной окраске альциановым синим 8 GX (C.I.74240) при температуре 40°С в течение 18-20 ч, причем рабочий раствор красителя альцианового синего получают смешиванием 1%-ного альцианового синего и 5%-ной уксусной кислоты в соотношении 1:40, после чего фиксируют окраску в течение 30 с в 0,01%-ном растворе аммиака, затем в течение 1 мин подкрашивают ядра клеток 0,2%-ным кислым раствором ядерного прочного красного (C.I.60760), который готовят путем растворения 10 г алюмоаммонийных квасцов в 100 мл дистиллированной воды, с последующим добавлением 0,2 г красителя ядерного прочного красного (C.I.60760), нагревания до кипения, остужения и добавления 5 мл ледяной уксусной кислоты.