Способ выявления хламидий Советский патент 1993 года по МПК G01N1/30 C12N1/00 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к микробиологии и хирургии, и может быть использовано в качестве одного из этапов диагностики хлэмидиоза сельскохозяйственных животных.

Способ выявления хламидий может найти применение при непосредственном обнаружении корпускул хламидий в мазках из патологического материала, а также в гистологических срезах, приготовленных из пораженных органов и тканей, окрашенных толуидино вым синим. Особое значение способ приобретает в процессе прижизненной диагностики хламидиоза, осуществляемой путем выявления хламидий в кляч-препаратах, приготовленных из биопсийного материала.

Хламидий в препаратах-отпечатках и гистологических срезах достоверно выявляют им- мунофлуоресцентным методом. Однако этот способ применяется только в хорошо оснащенных лабораториях, требует дефицитных реактивов, сложного оборудования и дает весьма нестойкие препараты, непригодные к длительному хранению и повторному излучению. В диагностике хламидиоза в условиях обычной лаборатории или хозяйства этот метод практически неприменим; к тому же он требует затрат большого количества времени.

Аналогичным недостатком обладает также метод выявления корпускулярных частиц хламидий в препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым, приготовленным на фосфатно-цитратном буфере.

Близкой по технической сущности к изобретению является окраска хламидий по Ро- мановскому-Гимза, которая дает весьма нечеткие результаты, поскольку краситель сильно закрашивает фон препарат-отпечатка, а на гистологическо м срезе вообще неприменим. Кроме того, при данном способе окраски хламидий трудно отличать от клеточного детрита и остатков красителя.

Окраска хламидий по Стемпу карбол- фуксином возможна только на препаратах- отпечатках. Способ требует отмывки избытка красителя (дифференцировка) и до- краска малахитовым зеленым для образования фона, на котором будут видны хламидий. Этот метод требует известного мастерства и интуиции. Окраска гистологических срезов этим методом практически невозможна.

VJ

00

о о

g

Окраска хламидий по методу Маккиавел- ло фуксином основным с докраской препарата метиленовой синью характеризуется теми же недостатками, что и приведенный выше способ. Это же относится и (с другим почти идентичным способам выявления хламидий.

Наибблее близким к изобретению является метод обнаруж ейия включений Chlamydea trac rib metis в патологическом материале. Метод п р ГдуЙмаТ-рй6ает окраску препаратов смесью ме ттшэвого зеленого и нейтрального красного с добавлением ДМСО. Затем препараты с нанесенной окрашивающей смесью инкубируют 10-15 мин в термостате при 37°С с последующей микроскопией. Однако данный метод рассчитан на выявление компактных колоний, характерных для Chlamydea trachomatis, локализующихся в клетках. Информативность его значительно снижается в отношении хламидий, находящихся вне клеток.

Целью изобретения является более точное выявление хламидий на прёпэратах-от- пе чатках и гистологических срезах в процессе диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных. При этом можно проводить исследования на месте, непосредственно в хозяйствах,где представляется возможным использование светового микроскопа. Препараты-отпечатки получены из поверхности слизистых оболочек, паренхиматозных органов, семенников, суставной жидкости, плодовых оболочек и отделяемого родовых путей (в случае аборта или патологических родов). Предлагаемый способ вместе с проведением биопсии печени, легких, семенников или пункций пора- жённых суставов дает возможность нёпЧэсредетвённб на месте ставить прижизненный диагноз и проводить необходимые лечебно-профилактические мероприятия.

Применение предлагаемого способа при окраске гастопрепаратов, кроме того, дает возможность увязать наличие хламидий с определен ними патогистблогическими и патоци- тологическИми изменениями, что позволяет верифицировать диагноз и углубить изучение болезни, в частности патогенез; выяснить изменение хламидий в связи с использованием лечебных средств, наличие полной или частичной санации различных органов и тканей.

Эта цель достигается тем, что хламидий содержат обе нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), и их обнаружение в препаратах-от- icax и гистологических срезах- предлагается осуществлять при помощи гистЬхимических реакций, используемых для суммарного выявления нуклеиновых кислот.

Препараты-отпечатки готовят из свежеиссеченной поверхности кусочка органа или

5

ткани, полученного после убоя или гибели животного, а также хирургическим путем при жизни (метод биопсии). У молодняка и плодов, в том числе абортированных, хламидии локализуются в печени, селезенке, почках, легких, мезентериальных лимфоузлах, семенниках, капсуле суставов, стенке сухожильного влагалища, конъюнктиве. Препараты также готовят из плодынх оболочек абортировавших

Q коров и свиноматок, из отделяемого родовых путей (после аборта или патологических ро- . дов), семенников производителей.

Свежеиссеченный острой .бритвой или скальпелем отобранный кусочек материала ополаскивают физиологическим раствором

5 с целью удаления крови с его поверхности, затем осторожно прикасаются к обезжиренному в спирт-эфире предметному стеклу. При этом клетки с поверхности разреза прикрепляются к стеклу, причем в первую очео ре дь прилипают подвижные клеточные элементы (моноциты и макрофаги), инфиль- трующие орган или ткань в связи с хламиди- озным воспалением. Лейкоциты при данном процессе отсутствуют или встречаются очень редко. Кроме моноцитов и макрофагов на стекло хорошо переходят паренхиматозные клетки, инфицированные о хламидиями и теряющие прочную связь с соседними элементами.

Приготовленные препараты подсуши0 вают на воздухе, помещают в чашку Петри отпечатками вверх на фильтровальную бумагу/предварительно пропитанную 40% раствором формальдегида (формалина), и закрывают крышкой. Препараты оставляют

5 ПРИ комнатной температуре в течение 12 ч или в бытовом холодильнике при 4°С на 24-48 ч, что приводит к нежной их фиксации парами формальдегида. Фиксированные таким способом препараты-отпечатки можно хранить в чашках Петри в холодильнике на протяжении нескольких месяцев.

Из исследуемых тканей готовят также парафинированные срезы, которые депара- финируют, проводят через этанол нисходящей концентрации (100. 96, 70°),

5 ополаскивают ацетатным буфером (рН 4,2- 4,5) и помещают в рабочий раствор (1:1000) толуидимового синего, приготовленного на указанном буфере. Время окраски 10-15 мин. Затем срезы подсушивают фильтроQ вальной бумагой, высушивают в термостате при 37-40°С в течение 1 ч, просветляют ксилолом, наносят каплю бальзама, накрывают покровным стеклом и исследуют с помощью обычного светового микроскопа под средним и иммерсионным увеличением.

Окраску препаратов-отпечатков рабочим раствором толуидинового синего проводят по

0

5

аналогии с гистосрезами в химических стаканчиках, придавая предметному стеклу вертикальное или наклонное положение. Профильтрованный раствор красителя можно наносить и на горизонтальную поверхность препарата. Окраску проводят в течение 15-20 мин при комнатной температуре или (лучше) в термостате при 37°С. Затем препараты дифференцируют ксилолом до наступления просветления, наносят каплю пихтового или канадского бальзама, накрывают покровным стеклом и исследуют под обычным световым микроскопом при среднем и иммерсионным увеличениях

Толуидиновый синий относится к основным красителям ф-лы

NvX.,

fcHu XDCXX

N

СИ:

Он взаимодействует с фосфатными группами нуклеиновых кислот и в слабокислой среде при рН 4-5 дает синее окрашивание клеточных и субклеточных структур. Реакция красителя с обеими нуклеиновыми кислотами протекает более интенсивно (примерно вдвое), чем с белками или проте- огликанами, с которыми толуидиновый синий также способен связываться своими реакционноспособными группировками. В связи с этим при сравнительно высоких степенях разведения красителя толуидиновый синий относительно слабо окрашивает фоновые структуры, довольно отчетливо, однако, маркируя хламидий.v,

Опытным путем подобрана концентрация красителя, которая оказалась наиболее оптимальной в разведении толуидинового синего 1:1000. Важную роль в специфичности выявления нуклеиновых кислот играет рН раствора красителя. При рН последнего 4,6 в структурах цитоплазмы и ядра только нуклеиновые кислоты сохраняют резко выраженный отрицательный заряд. Остальные компоненты цитоплазмы, в том числе белки, заряжены положительно или слабо отрицательно, в результате чего краситель ими почти не связывается.

Чем дальше рН раствора сдвигается в щелочную сторону, тем больше белков участвует в связывании основных красителей, тем менее специфической в отношении нуклеиновых кислот становится адсорбция этих красителей. В кислой.среде, начиная с рН 2,0, ДНК и РНК легко денатурируют, что приводит к изменению сорбции основных красителей при постановке реакции на нуклеиновые кислоты, что ухудшает их выявление.

Для определения максимальной специфичности в целях обнаружения хлэмидий

5

разведение толуидинового синего 1:1000 испытано с различной концентрацией водородных ионов в растворе, начиная с рН 4,0 до 4,8 с интервалом в 0,1. Максимальную 5 контрастность маркировки хламидий удалось получить при рН раствора толуидинового синего 4,2-4,5. Именно при такой концентрации водородных ионов толуидиновый синий наиболее отчетливо выявляет внутриклеточные и внеклеточные формы хламидий. Первые в виде мелких (0,2-0,8 мкм) образований круглой или овальной формы определяются в цитоплазме зараженных клеток, формируя иногда рыхлые колонии. Окраска ядра и цитоплазмы не ме- 5 шает обнаружению хламидий, так как ДНК в клетке содержится главным образом в ядре, а РНК - в цитоплазме, в связи с чем интенсивность окраски этих клеточных структур в два-три раза меньше, чем микроQ организма, содержащего обе нуклеиновые кислоты; кроме того, концентрация нуклеиновых кислот на единицу объема в хламиди- ях в несколько раз больше, чем в клетке, где паразитирует микроорганизм.

Одновременно при таком методе опре1 деления хламидий выявлено специфическое изменение хламидийных телец за пределами клетки, куда они поступают в связи с разру- шением инфицированных клеточных элементов. Здесь элементарные тельца хлами0 дий в силу неблагоприятного воздействия среды претерпевают выраженные морфологические изменения, которые могут быть использованы в диагностировании зараженного этим видом паразита материала. За пределами

е клетки отдельные тельца хламидий сравнительно быстро увеличиваются в размерах, как бы разбухают, и внутри них возникает вначале точечное, а затем все более увеличивающееся п росветление. Вследствие этого образуются весьма характерные кольцеобразные структуры, покрытые

0 снаружи гликолипопротеидной оболочкой, что

помогает легко дифференцировать хламидий в

препаратах-отпечатках и гистологических срезах.

Предлагаемый способ также выявляет и

инициальные (ретикулярные) тельца хламидий,

5 которые имеют обычную конфигурацию и располагаются скоплениями различной величины. Данные по зависимости качества идентификации от параметров способа приведены в таблице.

Данные таблицы свидетельствуют о значительном преимуществе выявления хламидий путем окрашивания препаратов 1:1000 раствором толуидинового синего при рН 4,2-4,5, лучше при 37°С (хорошие результаты получены окраской при комнатной температу5 ре). Четкая контрастность хламидий обеспечивает постановку достоверного диагноза.

0

Формула изобр е т е н и я Способ выявления хламидий, включающий приготовление препаратов, их окрашивание, инкубацию и микроскопию, отличающийся тем, что, с целью повышения

точности способа, в качестве красителя используют 0,1%-ный раствор толуидинового синего в ацетатном буфере при рН буфере 4,2-4,5, а инкубацию препаратов проводят в течение 15-20 мин.

Продолжение таблицы

Продолжение таблицы

Продолжение таблицы

Использование: ветеринарная микробиология. Сущность изобретения: способ выявления хламидий включает приготовление препаратов, их окрашивание, инкубацию и микроскопию, при этом в качестве красителя используют 0,1%-ный раствор толуиди- нового синего в ацетатном буфере при рН буфера 4,2-4,5, а инкубацию препаратов проводят в течение 15-20 мин. 1 табл.