Способ получения лизоцима Советский патент 1983 года по МПК A61K38/46 A61K35/56 

Изобретение относится к биологической промышленности, в частности к способам получения биологически активных веществ из сырья животного происхождения. Известен способ получения лизоци ма из клещей путем помещения их пе ред выделением в постоянное поле на пряженностью 25-600 Э на 1-48 ч 1 Однако известный способ длителен. Известен также способ получения зоцима, включающий промывание клеще физиологическим раствором, их гомогенизацию, многократное замораживание и размораживание гомогената, его нагревание, обработку фосфатом натрия, обессоливание гельфильтраци ей с последующей последовательной экстракцией спиртом, буферным раствором, дистиллированной водой и выделением целевого продукта 2. Однако известный способ не обеспечивает выход фермента достаточно высокой активности. Целью изобретения является повышение активности лизоцима. Поставленная цель достигается те что согласно способу получения лизоцима, включающему промывание клещей физиологическим раствором, их гомогенизацию, многократное замораживание и размораживание гомогена та, его нагревание, обработку фосфа том натрия, обессоливание гельфильт рацией последовательной экстракцией спиртом, буферным раствором, дистил лированной водой и выделением целевого продукта, предварительно на клещей воздействуют монохроматическим поляризованным светом видимого диапазона с длиной волны 6328 А, мощностью 0,125-0,50 мВт/см в течение 0,5-30 мин одно-трехкратно с интервалом между обработками 2-6 а промывку и последующую обработку проводят через 1-120 ч после послед него воздействия монохроматическим поляризованным светом. Пример, Клещей Ornithoden papiEEipes общей массой 900-1000 мг помещают в камеру и вносят их в зон воздействия источника лазерного излучения видимого диапазона с длиной волны 6328 А, мощностью 0,125 мВт/см в течение 45 мин однократно с последующим выделением лизоцимаиз органов через 1 ч после обработки. Подвергнутых лазерному воздействию клещей промывают 250 мл физиологическог раствора, 50 мл спирта, а затем триж ды промывают физиологическим раствором по 250 мл, гомогенизируют, добав ляют Д1;1стиллированную воду в соот.ношении 1:4 таким образом, чтобы общий объем гомогената доходил до 90 мл, и доводят рН до 4,0 ледяной уксусной КИСЛОТОЙ. Затем гомогенат 3-кратно замораживают и оттаивают до полного разрушения клеточной структуры тканей.. Отделение сопутствующих, белков клещевого гомогената проводят нагреванием до в течение 3 мин с последующим быстрым охлаждением,. К охлажденному гомогенату добавляют двузамещенный фосфат натрия до концентрации 0,1 М и доводят рН щелочью до 8,5,выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин со скоростью 9000 об/мин. Центрифугаты обессоливают гельфильтрацией на сефадёксе G-25. Фракции, содержащие обессоленный раствор тканей клещей, собирают и лиофилизируют. В дальнейших исследованиях центрифугат фильтруют через стерильный ватно-марлевый тампон, упаривают на роторе, затем фильтруют и лиофилизируют. Полученный порошок растворяют в 5 мл физиологического раствора, добавляют в.осьмикратное количество спирта для выделения в осадок бактерицидного вещества, последнее экстрах-ируют подкисленным уксусной кислотой 60-градусным спиртом, буферным растворомj дистиллированной ВОДОЙ. Затем аморфный порошок, содержащий .бактерицидное вещество, растворяют в 10 мя разбавленной уксусной кислоты и высушивают на лиофильной , после чего порошок растворяют в 10 мл 2 М ацетатного буфера, содержащего 5%-ный раствор хлористого натрия, через 1-2 ч в осадок выпадает бактериц{1дное вещество (лизоцим). Выход биологически активного вещества (лизоцима) из 500 клещей массой 1000 мг составляет 5,6 мг., Активность выделенного бактерицидного вещества (лизоцима) определяют методом диффузии в агаре. Бактерицидное вещество, вьщеленнре из клещей, диффундируя в стандартных условиях в агаре, лизирует оболочки мертвых клеток М. BysodeiE- ticus, равномерно залитых в агаровые .пластинки. В результате .образуются различные зоны .лизиса, по диаметру которых судят об активности бактерицидного вещества. П р и м,е р 2. Берут 6 групп клещей по 500 особей в группе. Клещи первой группы (контрольные) ла- зерной обработке не подвергают. На клещей 2.- 6-й групп воздействуют источником лaзegнoгo излучения с длиной волны 6328 А, мощностью 0,125 мВт/см . На клещей 2-й группы воздейств.уют в течение 0,25 мин, З.й - мин, 4-й - 15 мин, 5-й 30 мин и б-й - 45 мин двукратно с интервалом межяу обработками 2ч. Получение лизоцима из клещей этих групп осуществляют через 60 ч. Примерз. Берут 6 групп кле щей по 500 особей в каждой группе. Клещи 1-й группы (контрольные) обработке лучами лазера не подвергают На клещей 2 - 6-й групп воздействую источником лазерного излучения мощностью 0,25, мВт/см. На клещей 2-й группы воздействуют лазерным излучением S течение 0,25 , 3-й 0,50 мин., 4-й - 14 мин, 5-й 30 мин и 6-й - 45 мин. Клещей опытных групп обрабатывают двукратно с интервалом между обработками 2ч. Получение лизоцима из клещей опытны и контрольной групп проводят через 60 ч. П р и м е р 4. Берут 6 групп кл щей по 500 особей в группе. Клещей 1-й группы не обрабатывают (контрольные) . На клещей 2,3,4,5 и 6-й . групп воздействуют источником лазер ного излучения мощностью 0,750 мВт/ на клещей 2-й группы в течение 0,25 мин., 3-й - 0,50 мин, 4-й-15 мин, 6-й - 45 мин, - двукратно с интервалом меяэду обработками 2 ч, получение лизоцима осуществляют через 60 ч. П р и м е р 5. Берут 6 групп кле щей по 50d особей в группе. Клещи первой группы (контрольные) обработ.ке не подвергают. Клещи 2-6-й групп подвергают обработке источником лазерного излучения мощностью 0,500 мВт/см. На клещей 2-й группы воздействуют в течение 0,25 мин, 3-й - 0,50 мин, 4-й - 15 5-й - 30 мин, и 6-й - 45 мин двукратно с интервалом-между обработками 2 ч, получение лизоцима осуществляется через 60 ч. Зависимость активности и выхода сухого вещества лизоцима от времени и мощности лазерЕюго облучения (примеры 1 - 5) представлена в та.бл.. 1, Таблица

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМА, , включакяций промывание клещей физиологическим раствором, их гомогенизацию, многократное замораживание гомогената, его нагревание, обрабртку фосфатом натрия, обессоливагние гельфильтрацией с последующей последовательной экстракцией спиртом, буфернЕлм раствором, дистиллированной водой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности лизоцима, предварительно на клещей воздействуют монохроматическим поляризованным светом видимого диапазона с длиной волны 6328 А , мощностью 0,1250,50 мВт/см в течение 0,5-30 мин {С одно- TpexKjpaTjio с интервалом между обработками 2-6 ч, а промывку и по- C/J следующую обработку проводят через 1-120 ч после воздействия монохроматическим поляризованным светом.

Мощность облучения 0,125 мВт/см2

Выход сухого в-ва, мг 0,5

5,1 Активность лизоцима,ЕД 2860+101

Выход сухого в-ва, мг 5,0

5,4Активностьлизоцима,ЕД 28601101

Выход сухого в-ва, мг 5,0

5,5 Активность лизоцима,ЕД- 3180±106

Выход сухого в-ва, мг 5,0

5,3 Активность . ли зодима, ед 3260+123 4950+162

5,2

5,3

5,2

5,2

5,4

5,4

5,4

5,3

5,7

5,5

5,4

5,2

S.

5,4

5,2

5,4 4040+115 44051147 .62311170 7l90tl73 7700+185 4450±129 5375+154 6750±145 7990+175 7950+195 4700+183 5800+129 7290±193 8920± 210 7800±170 Мощность облучения 0,250 мВт/см 2 Мощность облучения 0,500 мВт/смМощность облучения 0,750 -мВт/см ; 5300+175 6900±186 78501235

Примере. Берут б групп клещей rio 500 особей в группе. Клещи 1-й группы - контрольные. На клеч щей 2-б-й групп воздействуют источником лазерного излучения мощностьк; 0,500 мВт/см в течение 5 мин двукратно с интервалом между обработКс1ми 2 ч. Получение лизоцима осуПредложе н ный способ Активность 49031175 лизоцима, БД 3750+149

Выход сухого в-ва, мг 5,2

5,2

Известный способ

Активность

285±116

28501116 лизоцима,ЕД

Выход.сухоро в-ва, мг 5,0

5,0 П р и м е р 7. Берут 8 групп кле щей по 500 особей в группе. Клещи 1-й группы (контрольные) обработке не- подвергают. На клеЩей 2-8-й груп воздействуют источником лазерного излучения с длиной волны 6328 А, мощностью О,25р мВт/см в течение .5 мин. Клещей 2-й группы обрабатыва ют однократно, 3-й - двукратно через 2 ч, 4-й - двукратно через 4 ч 5-й-двукратно через 6ч, 6-й - трех кратно через 2 ч, 7-й - трехкратно через 4 ч и 8-й - Трехкратно через б ч. Получение лизоцима осуществляют через 60 ч после обработки способом, описанным в примере 1. П р и м ер 8. Берут 8 групп кле щей по 500 особей в каждой группе.

ществляют через 0,5 ч (2-я группа), 1,0 ч (3-я), 60 ч (4-я), 120 ч (5-я), 150 ч (б-Я) способом, описанным в примере 1.

В табл. 2 представлена зависимость активности и выхода сухого вещества лизоцима от времени, прошедшего после облучения клещей.

Таблица 2

Предлагаемый способ

5,4

5,5

5,6

31001180

3150+185

2930il50

5,0

5,0

5,0 10370±235 105701297 84561273 Клещи 1-й группы (контрольные) обработке не подвергают. На клещей 2-8-й групп воздействуют источником лазерного излучения длиной волны 6328 А, мощностью 0,500 мВт/см в течение 5 мин. Клещей 2-й группы обрабатывают однократно, 3-й - двукратно через 2.ч,4-й - двукратно через 4ч, 5-й - двукратно через 6ч, б-й - трехкратно через 2 ч, 7-й группы трехкратно через 4 ч, 8 8-й - трехкратно черезб ч. Получение лизоцима осуществляют через 60 ч после обработки клещей способом, описанным в примере 1. В габл.З представлена . зависимость активности и выхода сухого вещества от многократного облучения клещей.

Таблица 3