Способ моделирования недостаточности тимуса Советский патент 1983 года по МПК G09B23/28 

-U о. ел

Изобретение относится к эксперимен- тальной меаиш1не.,а именно к иммудопогии и патофизиологии и может найти приме некие для моцегшрования заболеваний, солроважцающихся недостаточностью . тимуса.

Известен способ MoaeirappBainiH недостаточности тимуса нутем введения антиге ш ij .

Однако использование больших доз антигена для моде/шрования процесса, многократность введения цля создания стойкой гипофункции тимуса, ведет.к подавлению противомикробного иммунитета и повышению чувствительности оргашзма к инфекции.

Цель изобретения - создание .моцещ адекватной клиническому эквиваленту.

Поставленная цепь достигается тем, что в способе моделирования недостаточности тимуса путем введения антигена HtHSOTHoe в области селезенки предварительно подвергают воздействию ультразвука с частотой 65 кГц, амплитудой 3-5 мкм, экспозицией 40-60 с, затем вводят белковое вещество с мо- лекупярным весом 150000, полученное из гетерогенной лимфондной ткани в доузе 10О-2ОО мкг.

Способ осуществляют следующие офазом.

Для осуществления способа экспериментальных животных (мыши GBA) подвергают действию ультразвука в области селезенки с частотой 65 кГц, амплиту ,цой 3-5 мкм, .экспозицией 40-6О с. Контактной средой между волноводом н подопытным животным служит дегазированное вазелиновое масло. Затем сразу вводят белковое вещесгво с MB,; 15ОООО, полученное из гашфоидной ткаmi в дозе 100-2ОО мкг.

Для получения белкового вещества стерильно забирают лимфатические узШ)1 у 5 кроликов. 1О г . лимфатических узлов расщепляют в 10 мл лимфатид с ких узлов расщепляют в 10 мл физиологического раствора. Полученную клеточную взвесь фильтруют через капроновую ткань. Концентрация клеток составляет 2,5-3-10° /МП. От примеси эритроцитов освобождаются с помощью осмотического шока: к осадку клеток добавляют 2 мл цистиляированной воды и 15 с пипетируют,затемдо эвляют среду 199иконцен грацию клеток доводят до первоначальной (2,5-3/Ю /мп). Полученную клеточную взвесь подвергают утьтразвуковой о6работке- в течение 1,5 мин на ультразвуковом генераторе. Взвесь центрифугируют на ушьтрацентрифуге 1 ч 2О мин. Супернатант пропускают на колонке с Сефадексом С-200. Полученную белковую фракцию с MB 1500ОО концентрируют на приборе Амикон до содержания белка 3 мг/мл и используют в качестве антигена.

После введения белкового вещества в дозе 100-200 мкг мышам, подвергнутым действию ультразвука, животных забивают на 7,14, 30 сутки после иммунизации. Для контроля прлученных изменений у животных изучают содержание Т- и В-лимфоцитов в крови, а также проводят морфологическое изучение тимуса. Экстирпированный тимус фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы окрашивают гематоксилин-эозином.

Проведенные исследования показывают, что при введении мышам подвергнутым действию ультразвука в области селезенки, белкового вещества из лимфоидной ткани с MB 15ОООО в дозе 100-2ОО мкг развивается недостаточность тимуса, характеризующаяся выраженной перестройкой систоструктуры тимуса, заключающейся в редукции коры, разрастании участков соединительной ткани и замещении ими лимфоидных элементов корковых отделов тимуса, и, как следствие этих изменений, снижение количества Тлимфоцитов. в крови.

П,р и м е р 1. 15 мышей линии СВА, вером 14 г, подвергают действию ульт развука в области селезенки (частота 65 кГц, амплитуда 3 мкм, экспозиция 20 с),, затем им вводят 50 мкг белкового вещества из лимфоидной ткани с

MB 150000. На 7,14 30 сутки забивают по 5 мышей путем .декапиташш. Экстерпированный тимус фиксируют в растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-6 мк,окрашивают гематоксилинэозином. В периферической крови иссл&дуют количество Т- и В-РОК.

У мышей, забитых на 7 сут, в тймусе отмечалась незначительная редукция коркового :слоя за счет уменьшения числа лимфоидных элементов. У мыщей, забитых на 14 и 30 сутки, гистоструктура тимуса не отличалась от акрвой у интактных животных. Количество Тлимфоцитов в крови у мышей, забитых на 7 сут, не отличалось от контроля. . На 14 сут у забитых эксперимента льных животнык количество Т-РОК снижапась на 11%, а у мышей забитых на ЗО сут, нормапизовалось - 42 %. Чиопо В-пимфоцитов у мышей, забитык на 7,14 и 30 сутки, изменялось недостоверно. На основании полученных цаннык сцапано заключение об отсутствии изменений, свицетеггьствующих о развитии недостаточности тимуса. Приме р2ф 15 мышей линии СВА массой 14 г, поцвергают воздействию ультразвука в области селезенки (часто та 65 кГц, амплитуда 3 мкм, экспозн-, ция 4О с), затем им вводят 100 мкг белкового вещества из гшмфоицной тка- ни с МБ 15000О. На.7,14 и 30 сутки забивают по 5 мышей путем декапитации Экстирпирова1нный тимус фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального форма лина. Серийные парафиновые срезы, толшиной 5-6 мк, окрашивают гематоксилин-эозином. В периферической крови исследуют количество Т- и В-РОК,При морфологическом изучении тимуса у мышей, забитых на 7 сут, отмечалось опустошение коры тимуса за счет умень шения количества ткмоцитов и гиперплаЗИН ретикулярных клеток. У мышей, забитых на 14 сут, отмечалось более выраженное опустошение корковой зоны по сравнению с изменениями у мышей забитых на 7 сут. Вы5шлвно мелкоочагювое разрастание клеток соединительной кани, У мышей, забитых на .30 день,разрастание клеток ретикулоэндотелия было повсеместным. В периферической крови у мышей, за битых на 7 день, отмечалось снижение количества Т-лимфоцитов на сравнению с интактными животными, У мышей, забитых на 14 и 30 сут, число Т-ЛИМФО1ШТОВ было низким 28% и 16% соответственно. Количество В-лимфоцитов было повышенным у животных, за битых на все исследуемые сроки. Указанные изменения свидетельствуют о ра витии недостаточности тимуса, сопровоя давшейся опустошением корковой зоны тимуса за счет уменьшения числа тимоцитов и соответственно снижением количестваТ-лимфоцитов в периферичгеокой крови. Примерз. 15 ;мышей линии СВА, массой 14 г, поцвергают воздействию ультразвука в области селезенки (чаотота 65 кГц, амплитуда 5 мкм, экспоз ция 60 с), затем им вводят 200 мкг белкового вещества из лимфоидной ткани с MB 150000. На 7,14 и 30 сутки забивают по 5 мышей путем декапитации. Экстирпированный тимус фиксируют в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы толщиной 5-6 мк окрашивают гематоксилинэозином. В периферической крови исследуют количество Т- и В-РОК. В тимусе при морфологическом исследовании у мышей, забитых на 7 сут, отмечалось выраженное опустошение коры тимуса за счет резкого уменьшения числа лимфоцитов и обнажение ретикулярного осто-. ва, а также расширение границ мозго вого слоя за счет увеличения лимфойдных элементов. У мышей, забитых на 14 сут, отмечалось более выраженное уменьшение числа тимоцитов в коре, разрастание соединительнотканных элементов, У мышей, забитых на 30 сут, отмечалась рецукция коры тимуса и смещение корковых отделов ретикуло эндотелиальными клетками. В периферической крови отмечали достоверное снижение количества лимфоциТО& у мышей, забитых на все исследу&мые сроки (16% на 7 сут; 20% на 14 сут 9% на 30 су Количество В-лимфоцитов у мышей, забитых на 7, . 14 и ЗО сутки, более чем вдвое превышает фоновые значения что свидетельствует о нарушении супрессорной функции Т лимфоцитов и увеличении популяции Влимфоцитов, вырабатывающих аутоантитела. Полученные данные подтверципи развитие недостаточности тимуса. Предлагаемый способ позволяет создать модель недостаточности тимуса наиболее адекватной ее клиническому эквиваленту. Использование предлагаемого способа обусловливает создание модели, сопровождающейся изолированным повреждением -Т-системы иммунитета.

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ТИМ УСА путем введения антигена, о тпичагошийс я тем, что, с цепью создания модеяи, адекватной клиническому эквивапенту,, животное в области селезенки предварительно подвергают воздействию ультразвука с частотой 65 кГц, амплитудой 3-5 мкм, экспозицией 40-60 с и вводят белковое вещество с молекулярным весом 150000, полученное из гетеротенной лкмфоидной ткани, в, дозе 10О200 Micr.