СРЕДСТВО С ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1997 года по МПК A61K33/08 A61K45/05 

Изобретение относится к медицине, в частности иммунологии, и может быть использовано для восстановления нарушенного иммунного гомеостаза, в том числе лечения иммунодефицитных и острых инфекционных состояний.

Известна большая группа лекарственных препаратов, повышающих общую сопротивляемость организма или его неспецифический иммунитет (стимуляторы - кофеин, фенамин, элеутерококк и др. и витамины ретинол, аскорбиновая кислота, витамины группы B и др.), а также влияющих на специфические иммунные реакции, например ряд экстрактов вилочковой железы (тималин, Т-активин, тимоптин, вилозен) [1]
Среди лекарственных средств, способных стимулировать иммунные процессы и специфически активировать иммунокомпетентные клетки (T- и B-лимфоциты), как и дополнительные факторы иммунитета (макрофаги, нейтрофилы и др.), известны препараты микробного и дрожжевого происхождения (продигиозан, пирогенал и др.) [1]
Прототипом заявляемого изобретения можно считать продигиозан - бактериальный полисахарид, представляющий собой аморфный порошок серовато-желтого цвета [1]
Однако обычно применяемая суточная дозировка продигиозана часто вызывает у пациента побочные явления: повышение температуры тела, головную боль, ломоту в суставах, лейкопению, понос.

Задачей заявляемого изобретения является изыскание иммуностимулирующих средств природного происхождения, эффективных при малых лечебных дозах, исключающих побочное действие и оказывающих более широкое по сравнению с известными иммуностимуляторами и благоприятное воздействие на все системы организма, т.е. на организм в целом.

Известны природные цеолитсодержащие туфы различного районирования, среди которых главенствующее значение имеют клиноптилолитовые породы. Высокое содержание клиноптилолита (от 30 до 90%) в отечественных цеолитсодержащих туфах определяет сходство геохимических, адсорбционных, ионообменных, каталитических и ситовых свойств различных разновидностей цеолитсодержащих туфов, типичным представителем которых является шивыртуин -клиноптилолитсодержащий туф Шивыртуйского месторождения (Читинская область).

Качественная и количественная характеристика шивыртуина представлена в табл. 1 (Кормление животных и цеолиты: Методические указания по изучению природных цеолитов в кормлении сельскохозяйственных животных. Кемерово. 1990. С.5-6).

Нормы содержания токсичных микроэлементов в цеолитсодержащих туфах приведены в соответствии с техническими условиями на цеолиты [1] Из табл.1 видно, что содержание токсичных микроэлементов в шивыртуине не превышает норму, определяемую техническими условиями на цеолитовое сырье.

Тонина помола применявшегося цеолитсодержащего туфа была менее 1 мм, что также соответствует техническим условиям, где указано, что наиболее эффективная тонина помола этих туфов -до 1 мм.

Уникальное сочетание в цеолитовом сырье сорбционных, каталитических, ионообменных, ситовых и других свойств обеспечивает широкий спектр его промышленного и сельскохозяйственного применения.

Однако в современном уровне техники не обнаружены данные по использованию цеолитсодержащих туфов в качестве иммуностимуляторов при иммунодефицитных состояниях и острых инфекционных заболеваниях.

Сущность изобретения заключается в применении цеолитсодержащего туфа Шивыртуйского месторождения в качестве средства с иммуностимулирующим действием. Схемы влияния шивыртуина приведены на фиг. 1-15: фиг. 1 влияние шивыртуина на вес тимуса у облученных мышей; фиг. 2 влияние шивыртуина на количество ядросодержащих клеток в тимусе облученных мышей; фиг. 3 влияние шивыртуина на вес селезенки у облученных мышей; фиг. 4 влияние шивыртуина на количество ядросодержащих клеток в селезенке облученных мышей; фиг. 5 - влияние шивыртуина на количество лейкоцитов в периферической крови облученных мышей; фиг. 6 влияние шивыртуина на количество ядросодержащих клеток в селезенке облученных мышей на 4-е сутки после иммунизации ЭБ; фиг. 7 влияние шивыртуина на величину гуморального иммунного ответа на ЭБ у облученных мышей; фиг. 8 -влияние шивыртуина на величину интегрального индекса имуннодефицита у облученных мышей; Фиг. 9 -влияние шивыртуина на вес тимуса после введения гидрокортизона; фиг. 10 влияние шивыртуина на количество ядросодержащих клеток в тимусе мышей после введения гидрокортизона; фиг. 11 влияние шивыртуина на вес селезенки мышей после введения гидрокортизона; фиг. 12 - влияние шивыртуина на количество ядросодержащих клеток в селезенке мышей после введения гидрокортизона; фиг. 13 влияние шивыртуина на количество лейкоцитов периферической крови мышей после введения гидрокортизона; фиг. 14 -влияние шивыртуина на количество ядросодержащих клеток в селезенке мышей, получавших гидрокортизон, на 4-е сутки после иммунизации ЭБ; фиг. 15 влияние шивыртуина на величину гуморального иммунного ответа на ЭБ у мышей, получавших гидрокортизон.

Для подтверждения заявленного применения цеолитсодержащего туфа Шивыртуйского месторождения (шивыртуина) были проведены исследования на лабораторных животных (белых крысах и мышах).

Пример 1. Иммуностимулирующее действие шивыртуина при иммунизации животных эритроцитами барана.

В первой серии экспериментов оценивали величину гуморального иммунного ответа, используя метод иммунизации белых крыс линии Wistar эритроцитами барана. Иммунный ответ определялся на 5-й день после иммунизации животных (табл. 2). Введение шивыртуина в рацион крыс продолжалось 3 месяца.

Анализ полученных результатов показал, что скармливание животным шивыртуина при последующей иммунизации эритроцитами барана повышает иммунный ответ.

На массу селезенки у крыс потребление шивыртуина не влияло. В группе, получавшей шивыртуин, отмечено относительное повышение количества розеткообразующих клеток (РОК) по сравнению с контролем. При оценке результатов определения IgM-продуцирующих клеток установлены те же закономерности, что при определении РОК. Иммунный ответ по этому показателю у крыс, потреблявших шивыртуин, был почти в 2 раза выше, чем в контроле.

Таким образом, трехмесячное введение шивыртуина в рацион крысам производит иммуностимулирующее воздействие на организм животных, вызывая более выраженный, чем в контрольной группе, иммунный ответ на введение эритроцитов барана.

Морфологически в селезенке наблюдали резко выраженную гипертрофию белой пульпы у животных, получавших с кормом шивыртуин.

В лимфоидном аппарате обращает на себя внимание активация макрофагальных элементов не только в герминативных центрах, но и в маргинальных отделах фолликулов (табл. 3).

Аналогичная морфологическая реакция наблюдается в фолликулах лимфатических узлов (паратимических и корня брыжейки). В лимфатических узлах, кроме этого, имеются морфологические признаки активности как T-зависимых, так и B-зависимых структур. В B-зависимых зонах лимфатических узлов увеличены в объеме и количестве лимфоидные фолликулы, в герминативных центрах которых отмечается накопление бласттрансформированных клеток. Мякотные тяжи находятся в состоянии гипертрофии за счет увеличения количества клеток плазмацитарного ряда. В T-зависимых зонах лимфатических узлов, а также селезенки имеются морфологические признаки повышения функции сопряжения в иммунной реакции: увеличение абсолютного объема ядер ретикулярных клеток и макрофагов, преобладание среди лимфоидных клеток лимфоцитов, дифференцирующихся в плазмацитарном направлении, а также увеличение числа макрофаг-розеток.

В мозговых синусах лимфатических узлов наблюдается плотный лимфоцитоз, что указывает на повышенную функцию выведения лимфоцитов из лимфатических узлов.

При гистологическом исследовании кишечника крыс, получавших шивыртуин, обнаружено повышение удельного объема лимфоидной ткани в собственной пластинке кишечника. Во всех отделах кишечника существенно увеличено количество лимфоидных фолликулов. Основная часть фолликулов имеет четко дифференцированный герминативный центр. В последнем отмечается активация макрофагов, образующих вместе с прилегающими лимфоидными клетками типичные макрофаг-розетки. Мантийная зона фолликулов состоит из плотно агрегированных малых и средних лимфоцитов.

Таким образом, у шивыртуина был обнаружен положительный эффект: стимуляция иммунной системы, что может иметь большое значение в лечении очень многих заболеваний.

Пример 2. Воздействие шивыртуина на морфологические и функциональные параметры иммунного статуса животных в условиях экспериментально созданных моделей иммунодефицита in vivo.

В опытах по изучению иммуностимулирующего действия шивыртуина использовались мыши-гибриды F1 (CBA x C57B1), самки в возрасте 2-4 месяцев. Животные содержались в стандартных условиях вивария, шивыртуин добавляли им в корм, заменяя 5% веса корма.

Для создания экспериментального иммунодефицита у мышей использовали два способа: однократное рентгеновское облучение в дозе 200 рад и однократное внутрибрюшинное введение гидрокортизона ацетата в дозе 1 мг/мышь.

Для выявления воздействия шивыртуина на параметры иммунодефицитного состояния все животные были разделены на 5 экспериментальных групп):
интактные мыши;
контрольные мыши, облученные в дозе 200 рад;
контрольные мыши, получившие инъекцию гидрокортизона;
"опытные" мыши, облученные в дозе 200 рад и получавшие корм с добавкой шивыртуина;
"опытные" мыши, получавшие инъекцию гидрокортизона и получавшие корм с добавкой шивыртуина.

Животные "опытных" групп (группа 4 и 5) в течение трех недель получали с кормом шивыртуин, после чего их и контрольных животных либо облучали (группы 2 и 4), либо вводили им гидрокортизон (группы 3 и 5). После облучения или введения гидрокортизона животные "опытных" групп продолжали получать с кормом шивыртуин до окончания опыта. Интактные мыши (группа 1) не подвергались каким-либо воздействиям.

День облучения (или введения гидрокортизона) обозначали как день 0. На 3-й, 10-й и 17-й день после начала создания иммунодефицита у интактных, контрольных и "опытных" мышей (в один и тот же день у животных всех групп) оценивали исследуемые параметры иммунного статуса. Для этого часть мышей из каждой группы забивали, определяя у них количество лейкоцитов в периферической крови, вес тимуса и селезенки и количество ядросодержащих клеток в этих органах, а часть мышей иммунизировали эритроцитами барана, определяя на 4-е сутки после иммунизации количество антителообразующих клеток в селезенке.

Полученные в контрольных и "опытных" группах результаты выражали в процентах от исходного уровня, принимая величину исследуемых параметров у интактных животных (группа 1) за 100%
Животных забивали, забирая у них кровь и выделяя тимус и селезенку. Лимфоидные органы взвешивали, после чего из них готовили клеточные суспензии и подсчитывали число лейкоцитов в периферической крови и количество ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке стандартным способом в камере Горяева.

Величину гуморального иммунного ответа оценивали по методу Каннингхема (Cunningham A. J. Szenberg A. // Immunology 1968. V.14, No. 3. P. 599-600), определяя количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей на 4-е сутки после внутривенной иммунизации их ЭБ в дозе 200 млн. клеток. Для этого клетки селезенки суспендировали в 5 мл среды 199 и камере Горяева подсчитывали количество ядросодержащих клеток в селезенке. Полученную клеточную суспензию разводили в 10 раз и смешивали в разных объектах (по 0,5 мл с раствором комплемента из сыворотки крови морской свинки (разведение 1:5) и с 10% взвесью эритроцитов барана. Эту смесь заливали в стеклянные камеры объемом 0,18 0,24 мл, которые инкубировали в термостате при 37^oC в течение 45 мин. После чего под бинокулярной лупой подсчитывали в каждой камере число зон лизиса эритроцитов, соответствующих клеткам селезенки, вырабатывающих антитела к ЭБ. Результаты выражали в количестве АОК на селезенку.

Для статистической оценки различных сравниваемых выборок использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

В табл. 4 и на рисунках (фиг. 1-15) представлены средние арифметические величины (M) и ошибки средних (m). За уровень значимости различий принимали P < 0,05.

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере PC/XT по программе "StatGraphics" (США).

Для создания радиационной модели иммунодефицита у мышей было использовано однократное облучение животных в относительно небольшой дозе (200 рад), которая практически не увеличивает смертность мышей, но в то же время вызывает существенное поражение иммунной системы, что проявляется в массовой гибели радиочувствительных иммунокомпетентных клеток (главным образом лимфоцитов тимуса) и в подавлении их функциональной активности. Влияние выбранной дозы радиации на исследуемые показатели иммунного статуса в различные сроки после облучения представлено в табл. 4. Видно, что через 3 дня у облученных мышей наблюдается существенное снижение величины всех исследованных показателей иммунного статуса как морфологических (вес тимуса и селезенки и количество лейкоцитов в периферической крови снижаются на 50 70% по сравнению с интактными животными, а количество ядросодержащих клеток в тимусе почти на 90% ), так и характеризующих функциональную активность иммунной системы (неспецифическая пролиферативная реакция клеток селезенки на иммунизацию снижается вдвое, а количество клеток, синтезирующих специфические иммуноглобулины M к эритроцитам барана, падает до 15% от контроля). Но благодаря тому что использовалась небольшая доза облучения, не вызывающая полного опустошения костного мозга и резкого угнетения процесса кроветворения, в более поздние сроки (через 10 и 17 дней после облучения) наблюдалось заметное увеличение веса и клеточности лимфоидных органов и восстановление интенсивности иммунного ответа на ЭБ, хотя отдельные показатели иммунного статуса оставались достоверно сниженными до конца опыта.

Предполагалось, что такая модель "мелкого" иммунодефицита, вызванного действием облучения, позволит выявить влияние исследуемого цеолитсодержащего туфа шивыртуина на процесс восстановления иммунной системы радиационной травмы. Результаты проведенных экспериментов представлены на фиг. 1-8.

Полученные данные говорят о том, что введение цеолитов в корм экспериментальных животных (до и после облучения) оказывает определенное влияние на процесс восстановления иммунологических показателей, сниженных под действием радиации.

Так, например, добавка в корм животных шивыртуина достоверно увеличивает количество ядросодержащих клеток в селезенке облученных мышей (фиг. 4), количество лейкоцитов в крови животных на 17-й день после облучения (фиг. 5). Аналогичным образом прием шивыртуина влияет на величину гуморального иммунного ответа на эритроциты барана у облученных мышей (фиг. 7).

Рассматривая полученные данные, можно заметить, что влияние шивыртуина на показатели иммунного статуса в радиационный модели иммунодефицита характеризуется тенденцией к повышению исследуемых показателей по сравнению с облученными животными. Для иллюстрации этого обусловленного шивыртуином эффекта на фиг. 8 представлены значения интегрального индекса, характеризующего степень иммунодефицита у облученных мышей, получавших и не получавших шивыртуин с кормом, в различные сроки после начала эксперимента (интегральный индекс иммунодефицита вычисляется простым суммированием и усреднением всех определяемых параметров, выраженных в относительных единицах, при этом за 1 принималась величина соответствующего параметра у интактных животных). Видно, что к 17-му дню после облучения величина индекса в группе животных, получавших шивыртуин, выше значения этого индекса у облученных мышей, его не получавших.

Для того чтобы проверить, насколько эффект шивыртуина зависит от специфических условий, создаваемых радиационной моделью иммунодефицита, экспериментально было изучено влияние шивыртуина на параметры иммунного статуса в другой стандартной модели иммунодефицита, вызываемого введением животным гидрокортизона. При этом общая схема опытов (исследуемые параметры, сроки их определения и т.д.) была совершенно одинаковой при исследовании обеих моделей иммунодефицита.

Из данных, приведенных в табл. 4, видно, что внутрибрюшинное введение мышам гидрокортизона сопровождается снижением основных измеряемых показателей иммунного статуса, причем выраженнность иммунодефицита на 3-й день после воздействия близка к той, которая наблюдается после облучения в дозе 200 рад. Так же как и в радиационной модели, в более поздние сроки эти показатели возвращаются к норме, и на 10-й и 17-й дни величина лишь некоторых параметров достоверно отличается от их величины у интактных животных. Единственное (но важное) отличие этих моделей иммунодефицита заключается в том, что введение гидрокортизона не только не вызвало снижение интенсивности гуморального иммунного ответа на эритроциты барана, но, напротив, привело к достоверному и весьма значительному усилению специфического ответа на антиген. Такое парадоксальное увеличение интенсивности иммунного ответа при наличии у животных несомненного (тестируемого по другим показателям) иммунодефицита может быть объяснено тем хорошо известным фактом, что наибольшей (по сравнению с другими лимфоидными популяциями) чувствительностью к ингибирующему действию гидрокортизона обладают T-супрессоры, специфически подавляющие развитие иммунных реакций (Behrens T.W. Goodwin J.S. // The pharmacology of lymphocytes. B. H. N. Y. 1988. P. 425-439). Поэтому в определенных экспериментальных условиях эффект гидрокортизона, который подавляет супрессорную активность в большей степени, чем функции других клеточных популяций, проявляется в видимом усилении интенсивности иммунных реакций (Там же; Piccolella E. et. al. // J. Immunol. 1985. V.134, No. 2. -P.1166-1171). С большой степенью вероятности можно предположить, что подобный стимулирующий эффект использованной в эксперименте относительно небольшой дозы гидрокортизона на специфический иммунный ответ наблюдался и в вышеописанных экспериментах. Это объяснение полученных результатов подтверждается и тем, что у тех же самых животных гидрокортизон подавил неспецифическую пролиферативную реакцию спленоцитов на антигенное раздражение, достоверно уменьшив количество ядросодержащих клеток в селезенке после иммунизации.

Результаты исследования влияния шивыртуина на параметры иммунного статуса у мышей после введения гидрокортизона представлены на фиг. 9-15 и в основном сводятся к следующему:
добавка в корм шивыртуина приводит к значительному (на 60%) увеличению клеточности селезенки на 17-й день после введения гидрокортизона (фиг. 11);
под действием шивыртуина на 17-й день опыта увеличивается количество лейкоцитов в периферической крови по сравнению с животными, не получавшими шивыртуин;
шивыртуин на 10-й день после введения гидрокортизона увеличивает количество клеток в селезенке после иммунизации эритроцитами барана (фиг. 14).

В целом полученные данные свидетельствуют о том, что, как и в радиационной модели иммунодефицита, пероральное введение животным шивыртуина оказывает стимулирующее влияние на величину параметров иммунного статуса мышей в различные сроки после введения гидрокортизона.

Можно предположить, что наиболее вероятным и обоснованным с точки зрения имеющихся на сегодняшний день данных механизмом действия шивыртуина при иммунодефицитных состояниях является связывание на своей поверхности и выведения из кишечника бактериальных токсинов, играющих важную роль в условиях искусственно созданных моделей иммунодефицита.

Использование: в иммунологии для восстановления нарушенного иммунного гомеостаза, в том числе при лечении иммунодефицитных и острых инфекционных заболеваний. Сущность изобретения: применение цеолитсодержащего туфа Шивыртуйского месторождения - шивыртуина - в качестве средства с иммуностимулирующим действием. 4 табл. 15 ил.

Применение природного цеолитсодержащего туфа Шивыртуйского месторождения шивыртуина в качестве средства с иммуностимулирующим действием.