СРЕДСТВО, ОГРАНИЧИВАЮЩЕЕ ЛИМФОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ МЕТОТРЕКСАТА Российский патент 2008 года по МПК A61K31/56 A61K31/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и иммунологии, и может найти применение при иммунореабилитации после использования иммунодепрессантов.

Антагонист фолиевой кислоты метотрексат (МТ), используемый в клинической онкологии, является классическим иммунодепрессантом (Юшков В.В., Юшкова Т.А., Казьянин А.В., 2002). Этот побочный эффект ограничивает применение МТ, сокращает продолжительность лечения и затрудняет назначение повторных курсов. Представляется перспективным использование с этой целью биологически активных веществ растительного происхождения, обладающих иммуномодулирующим действием и минимальными побочными эффектами. Среди последних заслуживают внимания тритерпеноиды как вещества с выраженной иммунотропной активностью. В частности, установлен стимулирующий эффект тритерпеноидов мыльного дерева на продукцию антител к оболочечным антигенам вируса гриппа (S.Behboudi et al., 1996), к вирусу Эпштейн-Барра у высоко- (СВА; Н-2К) и низкоотвечающих (Balb/c; H-2D) линий мышей (Е. Dotsika et al., 1997), который связывают с усилением активности антигенпрезентирующих клеток и Т_х1 - лимфоцитов (S.Behboudi et al., 1997; В.Morein et al., 1998). Данные, полученные в последние годы, свидетельствуют о проявлении иммуностимулирующего влияния и у других тритерпеноидных сапонинов (S.Loganbal et al., 2000), а также у самих тритерпенов - глицерризиновой и уросоловой кислот и их дериватов (Т.Н.Ильичева с соавт., 2001). Несмотря на столь обширные биологические свойства тритерпеноидов, литературные данные об ограничении лимфотоксического эффекта метотрексата отсутствуют.

В связи с этим актуален поиск средств, направленных на ограничение лимфотоксического действия МТ и повышение эффективности иммунореабилитации после его применения.

К числу тритерпеноидов, нашедших практическое применение в медицине, относится и милиацин, входящий в состав просяного масла (Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др., 1991), используемого для лечения трофических язв, инфицированных ран и некоторых других заболеваний (Б.Г.Нузов с соавт., 2001). Экспериментально показано, что, обладая широким спектром биологической активности, милиацин стимулирует факторы неспецифической защиты и предотвращает их выраженную депрессию в условиях токсического поражения (М.М.Павлова, 1984), вызывает гиперцеллюлярность лимфоидных органов (Кириллова А.В., Корнеев Г.И., 2003), стимулирует иммунный ответ (Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др., 2003), обладает антиоксидантной активностью (Панфилова Т.В., Штиль А.А., Фролов Б.А., 2006) и ограничивает апоптоз лимфоцитов, индуцированный глюкокортикоидами (Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина Е.Р. и др., 2003).

Новизной изобретения является свойство растительного тритерпеноида милиацина ослаблять лимфотоксическое действие метотрексата и обеспечивать более быстрое восстановление морфологических показателей в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (селезенка) органах системы иммуногенеза.

Существенным отличием предлагаемого изобретения является то, что применяют милиацин в качестве средства, ограничивающего лимфотоксический эффект метотрексата.

Предложенное средство 3-β-метокси-Δ18-олеанен (милиацин) относится к группе природных циклических тритерпеноидов, содержится в просяном масле и представляет собой вещество белого цвета с температурой плавления 285-286°С. Он оптически активен, нерастворим в воде, слаборастворим в этиловом спирте, диэтиловом эфире, ацетоне, хорошо растворим в хлороформе. Милиацин обладает хорошей переносимостью в диапазоне доз от 2 до 1000 мг/кг. ЛД₅₀ этого соединения больше 1000 мг/кг (Олифсон Л.Е. с соавт., 1991), что свидетельствует об отсутствии у него токсических свойств.

Химическая структура пентациклического тритерпеноида - милиацина (3-β-метокси-Δ18-олеанена)

Описание эксперимента

Эксперименты выполнены на 219 мышах-самцах (СВАхС₅₇Bl₆)F₁, разделенных на 4 группы: 1) интактные мыши (14 животных); 2) мыши, получавшие МТ (74 животных); 3) мыши, получавшие МТ с последующим введением растворителя милиацина - твина-21 в физиологическом растворе (1,6×10^-7 моль/кг; 71 животное), и 4) мыши, получавшие МТ с последующим введением милиацина (60 животных). МТ применялся однократно внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Милиацин или растворитель вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 2 мг/кг 3-кратно на протяжении 3 дней: через 1 час после инъекции МТ и в последующие 2 дня. Животных выводили из эксперимента на 4, 7, 10, 14 и 21 сутки после введения МТ дислокацией шейных позвонков с соблюдением "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных". Определяли массу лимфоидных органов (тимуса, селезенки), затем органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, готовили гистологические препараты по стандартной методике и окрашивали гематоксилином и эозином. Определяли площади зон коркового и мозгового вещества тимуса, Т- и В-зависимых зон селезенки, а также плотность клеток в этих зонах с помощью морфометрической сетки (Автандилов Г.Г. 1973). Из каждого органа готовили 1-5 препаратов (срезов), в каждом препарате анализировали 10 полей зрения (70×70 мкм). Определяли количество миелокариоцитов (из бедренной кости) и оценивали относительное содержание клеток различных ростков кроветворения в мазках костного мозга, окрашенных по Паппенгейму. В каждом мазке подсчитывали не менее 500 кариоцитов. Данные обрабатывали стандартными методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel с использованием t-критерия Стъюдента.

Полученные результаты представлены в таблицах 1, 2 и 3 и графиках к ним, отражающих влияние милиацина на морфологические особенности тимуса, селезенки и красного костного мозга мышей, подвергнутых воздействию метотрексата.

В ранний период (4-е сутки) после введения МТ происходит резкая гипоплазия тимуса, сопровождающаяся снижением массы органа (на 72,6±2,3% от значений в контрольной группе), площади его мозговой (на 57,7±2,6%) и корковой (на 73,7±2,1%) зон с уменьшением в них плотности клеточного инфильтрата соответственно на 41,0±2,5% и 36,4±1,5% (табл.1 и графики 1а, 1б, 1в на фиг. 1, 2, 3). В указанных зонах появлялись клетки разных размеров с образованием дезориентированных тяжей. Наиболее выраженные изменения регистрировались в мозговой зоне, где в отдельных клетках отмечалась фрагментация ядер, формирование клеточных конгломератов (из 5-6 клеток), образующих по 3-4 подобных очага. На 7-е сутки наблюдения отмечалось незначительное восстановление плотности клеток в мозговой и корковой зонах при сохраняющейся картине дегенеративных изменений. К 10 суткам прирост исследуемых показателей был более выражен, а к 14 суткам плотность клеток в зоне мозгового вещества достигала исходного уровня. Однако нормализация плотности клеточного инфильтрата в зоне коркового вещества выявлялась лишь на 21 сутки. Полное восстановление морфологической картины тимуса не отмечено даже к этому сроку, поскольку показатели площадей исследуемых зон и соответственно масса органа оставались уменьшенными.

Введение растворителя (твин-21) на фоне МТ не сказывалось ни на выраженности клеточного опустошения тимуса и снижении его массы, ни на последующей динамике этих показателей.

На 4-е сутки в тимусе мышей, получавших милиацин на фоне введения МТ, регистрировалось значительно меньшее снижение площади мозгового (на 47,9±4,8%) и коркового (на 51,5±2,4%) вещества (график 16), менее выраженное уменьшение плотности клеток в мозговой (на 16,1±3,2%) и корковой (на 19,6±2,0%) зонах (график 1в) и соответственно значительно меньшее снижение его массы (на 56,0±1,5%) по сравнению с животными, получавшими только МТ или МТ с растворителем (график 1а). Значительно реже регистрировались цитологические нарушения в виде дегенерации ядер, образования клеточных тяжей и клеточных конгломератов. На 7-е сутки наблюдения площадь коркового вещества у мышей, получавших милиацин, была в 2 раза выше, чем у животных, подвергнутых только воздействию МТ или МТ с растворителем. Аналогичный сдвиг отмечен и для мозгового вещества тимуса, площадь которого на 7 сутки у животных, получавших МТ + милиацин, на 33,3% превышала таковую у мышей групп 2 и 3. В группе 4 клетки этих зон имели четкие границы и практически одинаковые размеры без признаков дегенеративных изменений ядер. Подобная закономерность выявлена на протяжении последующих сроков наблюдения. В результате плотность клеточного инфильтрата восстанавливалась к 14 суткам не только в мозговой, но и в корковой зоне органа; к 21 суткам нормализовались размеры площадей указанных зон и масса тимуса.

На 4 сутки после введения МТ регистрировалось снижение массы селезенки (на 36,6±4,0% по сравнению с интактными животными) и уменьшение площадей В-зависимой (на 45,2±4,4%) и Т-зависимой (на 77,9±3,8%) зон органа (табл.2 и графики 2а, 2б, 2в на фиг. 4, 5, 6). Этот эффект сопровождался снижением плотности клеток в указанных зонах, соответственно, на 36,2±1,8% и 26,6±1,8% (график 2в на фиг. 6). К 7-м суткам плотность клеточного инфильтрата восстанавливалась и возрастала площадь Т- и В-зависимых зон селезенки (график 2б на фиг. 5). Однако если площадь Т-зависимой зоны достигала исходного уровня, то площадь В-зависимой зоны сохранялась несколько сниженной (на 17,3±5,6%). Обращает внимание, что на 10-е сутки после введения МТ плотность клеток в В-зависимой зоне продолжала возрастать до значений, превосходящих исходный уровень на 11,7±3,2%. Этот сдвиг сопровождался увеличением массы селезенки, которая к указанному сроку наблюдения превосходила исходный показатель на 23,2±4,1% (график 2а на фиг. 4). Начиная с 14 суток наблюдения морфологические особенности селезенки у животных данной группы соответствовали таковым у интактных мышей.

Введение растворителя не приводило к существенным изменениям исследуемых показателей и их динамики по сравнению с животными, получавшими только МТ.

В группе животных, получавших милиацин после МТ, на 4-е сутки наблюдения отмечено значительно меньшее снижение массы селезенки (лишь на 12,4±4,5% по сравнению с интактными животными), практическое отсутствие редукции В-зависимой зоны органа и менее значимый показатель уменьшения его Т-зависимой зоны (на 63,0±2,7%), чем у мышей групп 2 и 3 (графики 2а и 2б на фиг. 4 и 5). На фоне применения тритерпеноида регистрировалось менее выраженное клеточное опустошение В-зависимой зоны (на 16,7±3,3%) селезенки, чем у мышей, получавших только МТ или МТ с растворителем (график 2в на фиг. 6). Защитное действие милиацина проявлялось и в отношении ограничения клеточного опустошения Т-зависимой зоны селезенки (снижение количества клеток на 12,2±1,8%). В последующие сроки наблюдения позитивное влияние милиацина на морфологические показатели селезенки животных, получавших МТ, не проявлялось в связи с фактическим восстановлением этих показателей у мышей групп 2 и 3. При этом милиацин не предотвращал возрастание плотности клеточного инфильтрата в В-зависимой зоне органа (график 2в на фиг. 6) и не влиял на увеличение массы селезенки на 10 сутки наблюдения (график 2а на фиг. 4).

МТ вызывал опустошение красного костного мозга, что выражалось в резком снижении содержания миелокариоцитов, составившем на 4 сутки наблюдения 40,5±5,7% по отношению к интактным животным (табл.3 и графики 3а и 3б на фиг. 7 и 8). Начиная с 7 суток, регистрировалось восстановление пула миелокариоцитов, которое завершалось к 10 суткам наблюдения (график 3а на фиг. 7). Применение растворителя не оказывало влияния ни на выраженность клеточного опустошения красного костного мозга, ни на последующую динамику его восстановления. В противоположность этому милиацин оказывал выраженный защитный эффект, выражавшийся, прежде всего, в менее значимой убыли миелокариоцитов на 4 сутки наблюдения (9,8±3,5%) и значительно более быстром восстановлении этого показателя уже к 7 суткам. Более того, под влиянием милиацина отмечалась гиперплазия красного костного мозга на 7, 10 и 14 сутки наблюдения: количество миелокариоцитов превосходило таковое у интактных животных соответственно на 15,7±3,7%, 16,7±3,8% и 17,7±1,7%.

Анализ относительного содержания лимфоцитов на 4 и 7 сутки наблюдения не выявил статистически достоверного снижения у животных, получавших МТ + растворитель и животных, получавших только МТ. Напротив, у мышей группы 4 (МТ + милиацин) отмечалось существенное снижение этого показателя, составляя на 4 сутки 21,6±6,6%, а на 7 сутки - 36,6±5,8% от соответствующих показателей у интактных животных. На 10 сутки наблюдения снижение относительного содержания лимфоцитов отмечено во всех группах животных, а к 14 суткам происходило его восстановление до уровня, определяемого у интактных мышей (график 3б на фиг. 8).

Оценивая эти результаты, следует отметить, что отсутствие падения относительного содержания лимфоцитов у животных групп 2 и 3 происходило на фоне клеточного опустошения костного мозга и, следовательно, не могло являться результатом усиления пролиферации и дифференцировки костномозговых предшественников лимфоцитов. Основу этого феномена составляет миграция в красный костный мозг внекостномозговых лимфоцитов, в основном, тимусного происхождения, необходимая для стимуляции подавленного гемопоэза. Такая миграция известна как реакция лимфоидной ткани при действии на организм стрессовых факторов физической и химической (включая цитотоксические лекарства) природы, обладающих выраженным миелоингибирующим действием (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В. 1983). Милиацин ограничивал указанный сдвиг, уменьшая выраженность клеточного опустошения костного мозга и тимуса. Снижение относительного содержания лимфоцитов на 10 сутки наблюдения в группе 4 отражает количество собственных кариоцитов, поскольку к указанному сроку лимфоциты-"мигранты" в красном костном мозге уже не обнаруживаются (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлусов И.А. 1999). Результатом восстановления относительного содержания лимфоцитов и гиперплазии красного костного мозга у животных, получавших МТ + милиацин, был значимый прирост абсолютного числа лимфоцитов к 14 суткам наблюдения (график 3б на фиг. 8).

Таким образом, противоопухолевый препарат метотрексат проявляет выраженное лимфотоксическое действие, характеризующееся клеточным опустошением костного мозга и лимфоидных органов, уменьшением соответствующих зон распределения лимфоцитов и плотности клеточного инфильтрата. Данный эффект более выражен в Т-звене иммунитета (по степени уменьшения исследуемых показателей и длительности их депрессии). Тритерпеноид растительного происхождения милиацин ослабляет лимфотоксическое действие метотрексата и обеспечивает более быстрое восстановление морфологических показателей в центральных и периферических органах иммуногенеза. Полученные результаты расширяют представления о процессах, обусловливающих защитные эффекты милиацина в организме, и обосновывают перспективность этого соединения как иммунокорректора.

Литература

1. Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии. М.: Медицина, 1973. 248 с.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В. Роль лимфоцитов в регуляции гемопоэза. Томск. 1983. 159 с.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Хлусов И.А. Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т.127. №5. С.484-494.

4. Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р., Шульц Э.Э. и др. Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. 2001. №2. С.53-56.

5. Кириллова А.В., Корнеев Г.И. // Морфология. 2003. Т.124. №5. С.54.

6. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. №6. С.36-38.

7. Нузов Б.Г. Стадников А.А., Бородин В.И. Анн. травм, и ортопед. - 2001. - №2. - С.50-51.

8. Олифсон Л.Е. Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Вопросы питания. 1991. №2. С.57-59.

9. Павлова М.М. Изучение влияния активного стероида проса (3-β-метокси-Δ¹⁸-олеанена) при токсическом поражении печени CCl₄ в эксперименте: Автореф. дисс... канд. биол. наук. - Оренбург, 1984. - С.21.

10. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина Е.Р. и др. Бюлл. эксп. биол. мед. 2003. Т.136. №10. С.382-385.

11. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Фролов Б.А. Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. Т.141. №6. С.633-635.

12. Юшков В.В., Юшкова Т.А., Казьянин А.В. Иммунокорректоры. Екатеринбург. ООО "ИРА УТК". 2002. 255 с.

13. Behboudi S., Morem В., Villacress-Eriksson М. Clin. Exp. Immunol. - 1996. - Vol.105. - P.26-30.

14. Behboudi S., Morem В., Villacress-Eriksson М. Cytokine. - 1997. - Vol.9. - P.682-687.

15. Dotsika E., Karagouni E., Sundquist В., Morgan A., Villacress-Eriksson М. Scan. J. Immunol. - 1997. - Vol.45. - P.261-268.

16. Logambal S.M., Michael R.D. Indian J. Exp. Biol. 2000. Vol.38. P.1092-1096.

17. Morem В., Villacress-Eriksson М., Lovgren-Bengtsson К. Dev. Biol. Stand. - 1998. - Vol.92. - P.33-39.

Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств, в частности к применению милиацина в качестве средства для ограничения лимфотоксического эффекта метотрексата. Технический результат - расширения арсенала технических средств для ограничения лимфотоксического эффекта метотрексата. 3 табл., 8 ил.

Применение милиацина в качестве средства для ограничения лимфотоксического эффекта метотрексата.