Способ сохранения генофонда сортов и видов картофеля Советский патент 1983 года по МПК A01H1/04 C12N5/00 

СП ел

4

СО

| Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам низкотемпературного хранения тканей и клеток растений, и может быть использовано в селекции и семеноводстве для длительного сохранения генофонда картофеля. Известен способ сохранения генофонда картофеля, основанный на глубоком замораживааии меристематических верхушек. Меристематические верхушки, после предварительного культивирования на жидкой питательной среде в течение 3-5 сут и последуюш,ей инкубации на среде с криопротекторами в течение 1 ч быстро погружают на кончиках стерильных игл или в пластмассовых ампулах прямо в жидкий азот. Этот способ позволяет сохранить жизнеспособность меристематических верхушек в пределах от 27% до 76 % для культурного и для дикого видов соответственно 1 Недостатком этого способа является сильное варьирование по уровню жизнеспособности между замороженными образцами после оттаивания. Известен также способ криоконсервации меристематических верхушек картофеля после предварительной подготовки по аналогии с указанными способами, отличительной чертой которого является медленное охлаждение апексов в присутствии криопротектора со скоростью 0,3°С/мин до - 40°С с последующим быстрым погружением в жидкий азот . В этом способе в ходе замораживания производят затравку (искусственную инициацию кристаллизации) раствора криопротектора путем внесения кусочка льда в ампулу с помошью микропипетки при температуре - 5°С. Такой способ позволяет сохранить жизнеспособность апексов на уровне 71% после криоконсервации 2. Однако способ имеет ряд недостатков. После предварительной подготовки ампулы с меристематическими верхушками помещают в спиртовой раствор с температурой 5°С и через 10 мин производят затравку кристаллизации. Для этого в стерильных условиях в каждую ампулу по отдельности вносят кусочек льда с помощью микропинетки , и через 10 мин медленно (примерно 0,3°С/мин) снижают температуру спиртового раствора с помощью системы сосудов Дьюара, о.хлаждаемой жидким азотом. При значительном количестве ампул такой способ усложняет и удлиняет весь процесс заморгГживания. Кроме того, не исключается возможность инфицирования меристематических верхушек в процессе затравки. Таким образом, известный способ криоконсервации является громоздким и трудоемким, так как требует стерильных условий при замораживании и проведении ряда дополнительных операций. Целью изобретения является сохранение высокого уровня жизнеспособности меристематических верхушек картофеля в процессе медленного замораживания и последующего хранения в жидком азоте, а также упрощение способа криоконсервации. Поставленная цель достигается тем, что перед замораживанием меристемахические верхушки помещают в раствор криопротектора в верхнюю часть ампулы, разделенной поперечной перегородкой с отверстиями, которая предотвращает непосредственное повреждение меристематической ткани в момент затравки, процесс охлаждения ведут в программном замораживателе, а затравку раствора криопротектора, находящегося в нижней части ампулы под перегородкой, производят путем одновременного погружения дна всех, а.мпул в жидкий азот до начала образования кристаллов. При этом затравку производят в течение 1,0 ±0,3 с. Температуру в камере аппарата поддерживают неизменной до момента образования кристаллов льда во всем объеме раствора криопротектора. Тем самым обеспечивается медленная дегидратация меристематической ткани, что в свою очередь препятствует кристаллизации воды внутри клеток. Пример. Для замораживания используют меристематические верхущки культурного тетраплоидного вида картофеля сорта «Домодедовский. Предварительная подготовка апексов заключается в культивировании их на жидкой питательной среде с 5% ДМСО (диметилсульфоксид) в течение 24 ч. Размер апексов 250-500 мкм. Условия культивирования: температура 26°С, освещенность 5000 лк, постоянный свет, влажность 70%. После предварительной подготовки Меристематические верхушки переносят Б 1,0мл 5%-нопо раствора ДМСО в питательной среде в а.мпулы с поперечной перегородкой, плотно прилегающей к стенкам и разделяющей весь объем раствора ДМСО на две равные части, сообщающиеся между собой через два отверстия диаметром 0,2 мм в поперечной перегородке. Таким образом, замораживаемый объект отделен от зоны образования и первоначального быстрого роста кристаллов льда, происходящего в момент затравки. Меристематические верхущки охлаждают в программном замораживателе со скоростью 0,5°С мин. При температуре - 5°С производят затравку сразу всех ампул. Находящихся в специальном штативе, путем погружения их дна в жидкий азот На 1,0 с. После этого температуру в камере замораживания поддерживают на уровне - 5° С в течение 20 мин, а затем продолжают охлаждение замораживаемого объекта с первоначальной скоростью до - 40° С, после чего сразу погружают в жидкий азот ( - 196°С). После хранения в жидком азоте ампулы быстро размораживают в воде при 40°С, и меристематические верхушки высаживают на агаризованную среду. Условия рекультивирования такие же, как и при предварительной подготовке материала к замораживанию. Жизнеспособность апексов после оттаивания определяют путем подсчета количества развивающихся меристематических верхушек после рекультивирования на питательной среде в течение 7-10 дней. Уровень жизнеспособности меристематических верхушек в зависимости от способа криоконсервирования показан в таблице.

Предлагаемый способ позволяет увеличить средний уровень жизнеспособности меристематических верхушек на 13% по сравнению с известным способом, а также является менее трудоемким, так как значительно упрош,ает и сокраш,ает процесс замораживания за счет исключения из него всех операций, необходимых для проведения затравки растворя криопротектора в стерильных условиях путем внесения кусочка льда в него с помощью микропипетки.

1. СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ, включающий предварительное культивирование меристематических верхушек на питательной среде, охлаждение объекта в ампулах в присутствии криопротектора, затравку кристаллизации, последующее замораживание и хранение в жидком азоте, отличающийся тем, что, с целью сохранения высокого уровня жизнеспособности меристем и упрощения способа криоконсервации, меристематические верхушки для охлаждения помещают в верхнюю часть ампулы, разделенной проницаемой поперечной перегородкой, а затравку кристаллизации производят путем помещения нижней части ампул в жидкий азот до начала образования кристаллов. (О 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, (Л что затравку производят в течение 1,0+0,3с.

Способ затравки

Внесение кусочков льда в ампулы с помощью микропипетки в стерильных условиях

Погружение дна ампул с поперечной перегородкой в жидкий азот на 1,0 с

Данные взяты из работы Тоуилла 2.

Средний уровень жизнеспособности меристематических верхушек

после замораживания(хранения,оттаивания), %

96,0

71,0

95,0

84,0