Способ криосохранения генофонда сортов и видов картофеля Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии а именно к криогенным методам храпения живых клеток и тканей расте- ний| в частности а пексов (меристема- тических перх;,шек побегов) и может быть использовано в селекции и семеноводстве для длительного сохранения генофонда картофеля.

Целью изобретения является повышение надежности криосохранения, увеличение жизнеспособности апексов и обеспечение генетической идентичности регенерированных растений исходным.

Способ состоит в том, что в качестве исходного материала для вычленения апексов берут заведомо здоровые стерильные растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в раствор криопротектора дополнительно вводят углеводы, в частности, сахарозу в концентрацин 5-IOZ, в питательную среду вводят дополннтельно аденин ч концентрации 10-40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, од- исвременно исключая из среды ауксины и гидролиэат казеина.

Сущность изобретения заключается в замене исходного материала для выделения апексов на наиболее высококачественный в модификации питательной среды для их предварительного культивирования и рекультивирования

после оттаивания и введения дополни- тельиых, помимо криопротекто- ровр в качеству которых используются углеводы, в частнрсти сахароза в концентрации 5-10%. Наиболее высококачественный материал представпен коллекциями вполне оздоровленных стерильных растений в пробирках, имеющихся во всех селекцентрах и мировых центрах генофонда картофеля и насчитывающих сотни и тысячи различных и форм. Такие коллекции являются непременным этапом современного интенсивного семеноводства картофеля и поддеркн ёаются клональным мккрораэн- ножеиием в строго контролиру игх лабораторных условиях, т.е. они максимально стандартизованы. При их ис польэоваиии исключается стерилизация проростков перед вы 1ленением ия них апексов. Модификация питателы ой среды для апексов, с одной стороны, ослабляет рост их клеток растяжен11ем в период предкультивирования, что уменьшает вакуолизацию и оводиенност клеток и благоприятно для кк оыжива-. НИН во время экстремальной процедуры глубокого замораживания и поспадя - щего оттаивания. С другой стороны, предлагаемая модификация полностью предотвращает каллусообразонпние в период рекультивирования после оттаивания, обеспечивая только прямую регенерацию. Введение в состав раствор криопротектора углеводов, в частност сахарозы, каждая молекула которой свяэьшает четыре молекулы воды,, не. Только уменьшает токсичность ЦКСО, н и увеличивает вязкость раствора, сокращая объем образования льда, скорость его распространения и вероятность повреждения им клеток. Одяовре менно, проникая вслед за ДМСО г кле г ки, углеводы связывают воду и вкут- ри 1ГНХ, предотвращая чрезмерное сжатие протопласта в процессе медленноI замораживания. Снабжение пакета с апексами фитилем и его расположоиие позволяет максимально снизить обьем раствора в ампуле, значительно ci;o- .ряя оттаннание, что сокращает uepofn ность повреждений на этом этапе па счет роста возникающих при siirioj/a iH- вании центров кристаллизации.

Способ иллюстрируется примг рагш, Дтя замораживания используит aneh сы размером 300-450 мкм, ны;г i . ик/.к: пазух листьев средней части /:ь- 8

дневньгх стерильньп( растений культурного тетраплоидного вида картофеля сорта Домодедовский. Предварительная подготовка апексов заключается в культивировании их на жидкой питательной среде, модифицированной, как указано пьш1е, в течение 24-26 ч, причем последние 16 ч из этого срока в присутствии добавленных к среде криопро- текторон: 5% ДМСО и 5% сахарозы. Условия культивирования растений: температура 22-23 С, влажность 60-70%, освещенность - 5-8 тыс лк, фотопериод 16 ч/сут; апексов: 26 С, влажность - 60-75%, освещенность 5-8 тыс.лк, фотопериод - 24 ч. После подготовки апексы в пакетике из фильтровальной бумаги, снабженном фитилем, переносят в ампулу под пробку, располагая пакетик вдоль боковой стенки так, чтобы фитиль и пакетик прилегали к ней вплотную и фитиль опускался до дна. В ам- IIVK .; напивают 0,2-0,3 мл вышеуказанного раствора криопротекторов, охлаждают ампуль в ледяной бане, а затем в ПРОГРАММНОМ заморажнвателе со скорос- чbio U,5°f /MHH. При температуре -А, производят злтрайку сразу всех ам тул, iia ходящих с ч в сиециапъном штативе, путем прикоснспепия их дна к поверхности жчпкого пзота в течение 0,3 с. Для затравки возможно также 11с:пильг ование специального устройства. Пели программный замораживатель оснащен гьлд бным устройством, которое по- г. зволяет избежать кратковременного на- рутаения режима в камере замораживания. В обоих случаях апексы отдалены от зоны образования и первоначального быстрого роста кристаллов льда в мо- иек. затравки и не мо ут быть повреждены Е этот момент. После этого температуру в камере замораживания под- деркивают на уровне 5 С в течение 10- 20 мин, а затем продолжают охлгикдв- 1гие с первоначальной скоростью до , после чего сразу погружают в жидкий азот (-19б С). После хранения в жнп.ком пзоте ампулы быстро размораживают, чстрнхи.ная в .воде ири , яатем ahui/.nbi в лг;дяно1 | бане быстро пе-. реиосят и стери/ ьные услови.м и апексы на эглризовзиную среду TOI-0 же гос:тавл. Условия рекультиви- ронэиии и 11ернь:е суч ки же, как и для при/Ц Гульти м рования апексов, но ocuf iienrtonTi - от 1000 до ,6000 лк. 2-i ч, на с;:едуч1;цис сутки и в

дальнейшем через каждые 5-7 дней апек- бель разделяют на ннкрочеренки, кото- сы пересаживают на свежую агарияован- рые переносят ie пробирки для укоре- ную среду, продолжая рекультивирова- нения.

ние в условиях, указанных выше для В табл. I приведены результаты, по- растений. После возобновления роста лученные по предлагаемому способу, в и развития и образования сильного сте- записимости от состава раствора крио- лющегося по чашке стебля, этот сте- протекторов. Т а б ли ц а I

Влияние состава криопротекторов на жизнеспособность апексов и регистрацию растений

Вари- Конечная концентрация крио- Количество апексов, Z ант протекторов, Z

ДМСО глицерин сахароза выжнвшнх образо- регеяерив теч. вавших ровавпих I мес. каллус растения

1502 вОО

250-582О82

35010 50О35

450209О9

555200О

655541О24

755106О6

Таблица 2

Влияние возраста исходных стерильных растений на выход растений- рег-енераитсп после глубокого замораживания и оттаивания апексов

Возраст исходных апексов, ре- .растений, дни генерировавших

растения, %

. 2682

2833

3214

3610

414

Таблица 3

Влияние содержания аденинп D питательной среде на скорость роста регенерантов из меристем картофеля

Вариант (со-Длина регенерантов ( мм/месяц)

держание I

аденина в порт Домодедовский сорт Слапянский сорт Дружный

среде, мг/л)

мм % к конт- мм % к конт- мм I Z к контролюролюI ролю

Изобретение относится к биотехнологии,, а именно к криогенным методам хранения живых клеток и тканей растений, в частности меристем,и может быть использовано в селекции и сенеНСводетse для длительного сохранения генофонда картофеля. Целью изобретения является повышение надеж- кости криосохранения, увеличение жизнеспособности апексов и обеспечение щентичности регенерированных растений исходным. Cnoccf6 состоит в том, что в качестве исходного материала для вычленения апексов беру г заведомо здоровые стерипьные растения, выращиваемые в строго контро- nifpyewbix условия :, в раствор крио- иротектора пподят дополнительно сахарозу в концентрации 5-10Z, в питательную среду вводят аденин в концентрации 10-40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, одиовреьтенно нс.--;почая из среды ауксины и гнцроли- эат казеина. 3 табл. г СО

онтроль: ез аденина

0,5

5,0

10,0

20,0

1,210 2,700 3,103 6,725 6,723

223,1 256,4 555,8 555,6

232,9 315,9 475,8 582,0

1,356 2,563 3,005 5,Г06 6,440

189,0 221,6 376,5 474,9

20

Таким образом, из табл. J ;. Е:ЩНО, что предлагаемый способ тезко выделяемся по Числу растенлй-регенерантов И позволяет полностью исключить обрастание выживших апексов калпусной тканью - все выжившие показываю - прямую, регенеравдпо в растении: для сорта Домодедовский число выживших апек- 5Ой 82% и число растений-1.егенерви- 25 тов также 82%. Характер раздития апексов не оставляет сомнений в гфямой регеиерации, что исключает необходн- мость в проведении сложной и трудоемкой процедуры идентификации генотипа JQ полученньпс растений. Следовательно, предлагаемый способ, обйспечивающий высокий выход растений-регенерантоп И эRoнo Jию труда и средств, расходуемых на поддержание лаборагор),гх и .Полевых коллекций сортов, форм и ви- дов картофеля, ПС сравнгению с аналогами являетсй существенно.менее тру- доемким4 так как не требует ампул сложной конструкции, которую приходится изготовлять .in монтировать ярутную и затем стерилизовать амлулы, позво ляет /исключить операции г.имической стерилизации и последующей трехкратной промывки проростков клубней и получать всегда заведомо вполне здоровый материал для размножения к селекции, исключив сезонные перерывы в работе и опасность инфицирования образцов поверхностной микрофлорой клубФормула иэобр

CFIOCO6 криосохраненин сортов и видов картофеля,, предварительное культивир сон растений на питательн содержащей микро и макро проггиси Мурасиге-Скуга, р их , ампулах, программное ние в упаковке в присутст криопротектора с затравко зации этбго раствора и по стабилизацией температуры распространеми.ч кристаллов объему раствора, :;раиение

ратура ниже -140 С,

отл

35

40

щ и. и с я тем, что, с Це. ния ньдежности криосОхран личения жизнеспособности а обеспечения генетической . ти регенерированных растен честве исходного материала ют 26-28-дневные стерильны выращиваемые в строго конт условиях, в раствор криоп дополнительно вводят спхар цеитрации 5-10%, в пи1 а тел дополнительно вводят адеик 5 чествс 10-40 мг/л, витам1т ют по пропнсн Стаба, а в к ковки для замораживания ап пользуют пакет из фильтров маги, снабженный фитилем, равным высоте ампулы.

невых проростков.

Редактор Н. Козлова

50

Составитель В, Демкин

Техред Л.Сардюкова Корректор о. Кравцова

8

Продолжение табл.З

Формула иэобрете ния

CFIOCO6 криосохраненин генофонда сортов и видов картофеля,, включаюпщй предварительное культивирование апек- сон растений на питательной, среде, - содержащей микро и макроэлементы по , проггиси Мурасиге-Скуга, размецение их , ампулах, программное замораживание в упаковке в присутствии раствора криопротектора с затравкой кристаллизации этбго раствора и последующей стабилизацией температуры до момента распространеми.ч кристаллов по всему объему раствора, :;раиение при температура ниже -140 С,

отличаю

щ и. и с я тем, что, с Це.п..ю повышения ньдежности криосОхранения, увеличения жизнеспособности апексов и обеспечения генетической .идентичности регенерированных растений, в качестве исходного материала используют 26-28-дневные стерильные растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в раствор криопротектора дополнительно вводят спхарозу в кон- цеитрации 5-10%, в пи1 а тельную дополнительно вводят адеикн в- коли- чествс 10-40 мг/л, витам1ты добавляют по пропнсн Стаба, а в качестве«упаковки для замораживания апексов используют пакет из фильтровальной бумаги, снабженный фитилем, по длине равным высоте ампулы.