Способ консервирования живых клеток или тканей растений Советский патент 1985 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к криогенным методам консервирования и хранения живых клеток и тканей как непосредственно выделенных из организма растения, так и длительно культивируемых на искусственных питательных средах и составляющих основу биотехнологии производсгйа ряда ценных, в частности лекарственных веществ, природное растительное сырье для получения которых уже исчерпано. Известны способы сохранения живых клеток и тканей путем их культивирования или инкубации в природных или искусственных питательных средах, добавления криозащитных веществ, глубокого программного замораживания, хранения в жидком азоте, оттаивания и рекультивирования. В случае особо чувствительных к данной экстремальной процедуре клеток, например клеток растений, наибольшая жизнеспособность достигалась при использовании программ замораживания с затравкой (инициацией кристаллизации криозащитного раствора, в котором находятся живые клетки и ткани). Затравку обеспечивали с помощью внесенизя в пробирки с клетками и тканями кусочков льда 1. Недостатками указанного способа являются необходимость стерильных условий в процессе затравки, а также сложность и трудоемкость этого процесса, если работают с большим числом ампул. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ консервирования живых клеток или тканей растений, включающий их культивирование в питательной среде, внесение раствора криопротектора в емкость с клетками или тканями с образованием в ней зоны раствора криопротектора и зоны клеток или тканей, последующее глубокое замораживание с затравкой кристаллизации и хранение в криогенной жидкости 2. Клетки и ткани, находящиеся в питательной среде осаждают, избыток среды удаляют, а к осадку клеток добавляют криозащитный раствор. Затем их переносят в цилиндрические полиэтиленовые ампулы (наружный диаметр 10 мм, внутренний 8,6 мм. высота до пробок 24 мм, полезный объем 1 мл). Ампулы (до 30 шт. одновременно) помещают в плоскую кассету с перфорированными стенками. Если ампул немного, их помещают вертикально на одном уровне в штатив. Штатив или кассету переносят в камеру программного замораживателя и охлаждают до температуры на 1-2°С ниже точки замораживания раствора криопротектора. Очень быстро вынимают кассету или штатив и на 0,5-1,5 с погружают в жидкий азот всю кассету или дно ампул в штативе и сразу же возвращают их в камеру. После окончания замораживания ампулы переносят в жидкий .азотдля хранения. Таким образом, при осуществлении этого способа затравка может привести к прямому повреждению части клеток слишком низкой температуры (жидкий азот - 196°С) и не получиться в некоторых ампулах, так как при погружении кассеты жидкий азот вскипает, и пузырьки смеси его паров с воздухом могут воспрепятствовать проникновению жидкости в кассету и касанию ею всех ампул без исключения. Целью изобретения является повышение жизнеспособности клеток или тканей. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу консервирования живых клеток или тканей растений, включающему их культивирование в питательной среде. . ,, внесение раствора криопротектора в емкость с клетками или тканями с образованием в ней зоны раствора криопротектора и зоны клеток или тканей, глубокое замораживание с затравкой кристаллизации и хранение в криогенной жидкости, затравку кристаллизации производят .хладагентом, имеющим температуру в 10-13 раз ниже темпе4)атуры замерзания раствора криопротектора, причем затравку производят в зону раствора криопротектора. Дополнительный хладагент имеет ее сверхнизкую температуру, а лишь необходимую и достаточную для затравки. Такая температура должна быть в 10-13 раз ниже точки замерзания криозащитного раствора. Этот хладагент действует строго локально, только на самую верхнюю узкую (2-3 мм) зону обычных ампул, где расположен мениск раствора, в то время как клетки и ткани оседают на дно ампул и даже самые верхние из них находятся не ближе 12 мм к зоне действия дополнительного хладагента. Обеспечивается это тем, что ампулы находятся вспециальном щтативе, представляющем собой чашку с плоским дном, причем в дне имеются отверстия, диаметр которых точно соответствует диаметру ампул. Ампулы закрывают эти отверстия плотно, так как пробки и Дно штатива располагаются на 2-3 мм ниже мениска раствора в ампулах. В отдельных сл.учаях. когда объекты плавают на поверхности раствора криопротектора, а не оседают в нем, ампулы могут быть вставлены в те же отверстия только своей донной частью. В этих условиях уровень мениска дополнительного хладагента, наливаемого в чашку-штатив в момент затравки, на 2-3 мм выше дна, и расстояние между ним и клетками сохраняется приблизительно тем же. Дополнительный хладагент представляет собой спирт, охлажденный с помощью сухого льда до рассчитанной температуры в отдельном сосуде. Способ осуществляют следующим образом.

В данных экснериментах для замораживания использовали длительно культивируемые и ранее хранившиеся в жидком азоте клетки тропической лианы диоскореи дельтовиднЬй. Осаждение клеток, добавление криопротектора (диметилсульфоксид ДМСО, 7%) и перенос в ампулы проводили точно так же, как в способе-прототипе. Количество клеток было таким, что они оседали на дно ампул в виде слоя, высота которого была около 1 мм. Ампулы вставляли в специальный штатив, В центр штатива вставляли контрольную ампулу, в которую вводили термодатчик программного замораживателя ЗП 00.00.00. Конец термодатчика располагался на уровне дна штатива, горизонтально установленного в камере аппарата. Снижение температуры проводили со скоростью 0,5°С/мин и стабилизировали ее при -6°С. Тем временем в небольшом сосуде Дьюара охлаждали спирт до -33 -38°С, так как точка замерзания питательной среды с ДМСО равна -2,82°С. Открывали крышку камеры, вливали в штатив этот спирт и закрывали крышку.

На чертеже представлены термограммы опытов.

Через 15 с температура в зоне мениска контрольной ампулы начинала снижаться (нижняя кривая).

Пример 1. При темлературе около -8°С начиналась кристаллизация в этой зоне и

Жизнеспособность (%) клеток диоскореи дельтовидной

температура в ней начинала подниматься. Подъем температуры продолжался более 4 мин и достиг приблизительно точки замерзания. Следовательно, начальная кристаллизация проходила очень медленно, что благоприятно сказывается на жизнеспособности

Верхние кривые являются фрагментами термограмм, полученными в опытах, в которых концентрация ДМСО была 10°/о и точка замерзания - 4,12°С. Моменты затравок показаны стрелками, над которыми указана температура дополнительного хладагента. Только при снижении ее почти в 10 раз или ниже по сравнению с точкой замерзания появлялись типичные пики кристаллизации. При более высокой температуре дополнительный хладагент вызывал лишь кратковременное снижение температуры в зоне мениска раствора с последующим возврашением к температуре камеры (показана пунктиром в те периоды, когда после кристаллизации она не совпадала с температурой ампул).

После окончания программы замораживания ампулы хранили в жидком азоте несколько дней, быстро оттаивали и определяли жизнеспособность клеток по окраске с феносафранином.

В таблице представлена жизнеспособность (%) клеток диоскореи дельтовидной.

Таблица

СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК ИЛИ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ, включающий их культивирование в питательной среде, внесение раствора криопротектора в емкость с клетками или тканями с образованием в ней зоны раствора криопротектора и зоны клеток или тканей, последующее глубокое замораживание с затравкой кристаллизации и хранение в криогенной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности клеток или тканей, затравку кристаллизации производят хладагентом, имеющим температуру в 10-13 раз ниже температуры замерзания раствора криопротектора, причем затфавку производят в зоне раствора криопротектора. (Л

Погружение дна ампул в жидкий азот на 1,0-1,5с

76,0

Затравка с помощью дополнительного хладагента

76,0

18,6

50,8

Пример 2. Длительно культивируемые клетки наперстянки Digitalis lanata специально подготавливали к глубокому замораживанию, для чего при очередном их пересеве добавляли в питательную среду осмотически активное вещество - маннит в концентрации 3%. Для клеток наперстянки такая подготовка обязательна для успеха глубокого замораживания, так как после нее большинство клеток имеет сравнительно небольшие размеры и меньшую вакуолизацию, что благрприятств1ует их выживанию. Клетки осаждали как в способе-прототипе, и добавляли криопротектор: смесь глицерина и сахарозы до конечной концентрации 10% каждого из этих веществ. Остальные операции проводили точно так же, как в примере 1, но с учетом другой точки замерзания раствора криопротектора (-3,4°С) и, следовательно, температура дополнительного хладагента должна быть не выше -34°С. На этих клетках был испытан весь диапазон скоростей охлаждения, обеспечиваемый аппаратом ЗП.00.00.00 от 0,5 до 75°С/мин. Эти результаты показали, что наилучшей для клеток растений является скорость 0,5°С/мин.

Пример 3. Использовали длительно культивируемые клетки женьшеня Рапах ginseng. При этом в случае исходного щтамма ИФР Ж 1 можно обойтись без специальной подготовки клеток и применить тот же криопротектор, как и для клеток наперстянки. В случае же мутантных штаммов ИФР Ж 2 и ИФР Ж 3, которые менее устойчивы к глубокому замораживанию, необходимо специальное предварительное культивирование в течение 3 недель при пониженных температурах (первая неделя при 8-10С, затем при 2°С) и при еженедельном увеличении концентрации сахарозы в питательной среде: сначала до 10, потом до 15 и до 20%. Затем клетки осаждали как в способе-прототипе и добавляли криопротектор, равный объем 40°/о-ного раствора сахарозы. Конечная концентрация сахарозы составила 30%, точка замерзания -2,4°С и температура дополнительного хладагента должна быть не выше -24°С. Для клеток женьшеня, предварительно подготовленных, хорошие результаты дает и другой криопротектор: смесь диметилсульфоксида и сахарозы, конечные концентрации которых 10 и 30% соответственно. Точка замерзания -5,9°С и температура дополнительного хладагента должна быть около -60°С. Остальные операции проводят, как в примере 1.

Таким образом возможные отличия в проведении предлагаемого способа зависят от конкретных живых клеток или тканей, подлежащих криосохранению, и не касаются способа проведения затравки кристаллизации в процессе охлаждения.

Согласно полученным данным, предлагаемый способ позволяет увеличить уровень жизнеспособности клеток по сравнению со способом-прототипом, а также гарантирует затравку всех ампул и ликвидирует возможность повреждения клеток и тканей в момент затравки сверхнизкой температурой хладагента и быстрорастущими кристаллами льда. Предлагаемым способом облегчается

0 работа на программном замораживателе, не способ можно использовать и без этого аппарата: в таких случаях применяют поэтапное замораживание с помощью нескольких ХОЛОДОВЫХ шкафов или смесей, имеющих различные отрицательные температуры

5 и обеспечивающих охлаждение до - (40-70) °С с непостоянной скоростью. Такое охлаждение дает худщие результаты, но позволяет обойтись простыми приспособлениями.