Способ исследования жизнедеятельности @ -клеток Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

о:

о :л

о

Изобретение относится к биологии и может найти применение в цитологии и медицине. Для исследования внутреннего стр ения клеток с помощью электронного микроскопа ткани фиксируют соединениями осмия и заключают в акриловую пластмассу, а затем изготавливают тончайшие срезы, которые накладывают на очень тонкую сетку, помещаемую на пути пучка электронов. . .Известен способ исследования жиз недеятельности L -клетокпутем куль тивирования L -клеток, маркирования их лизосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроскопиро,ванием 2 . Однако., известный способ не позво ет внедрять, внеклеточные вещества при сохранении жизнеспособности кле ток. Цель изобретения - внедрение вне клеточных веществ при сохранении жи неспособности клеток. Поставленная цель достигается те чтосогласно способу исследования жиз недеятельности L -клеток путем культивирования L -клеток, маркирования их лизосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроскопиро ванием, в качестве внеклеточного ве-, щества используют суспензию твердых частиц магнита с диаметром 8-10 нм, 0,02-0.04 мл суспензии в концентрации частиц/мл добавляют в питательную: среду, далее культуру клеток подвергают воздействию несэднородного магнитного поля с индукцией 1,5-3,0 Тл. Способ поясняется следующими при мерами . Пример 1. Используют клетки линии L , полученной в результате трансформации нормальных фибробл тов мышей 20-метилхолантреном в кул туре . Пересеваемую культуру мышиных L -клеток выращивать при 37°С на по кровных стеклах в среде Т-199, допо ненной 10% бычьей сыворотки, добавляют 0,3 мл суспензии твердых части высокодисперсного магнитита в воде с концентрацией 10 частиц/мл, пол ченного химическим осаждением солей FeCIj, FeS04 аммиаком. н выдерживают в течение 1,5 . После адгезии кл ток к субйтрату препараты префиксируют в течение 45-50 мин 2,5%-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4, промывают 30 мин 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4, постфиксируют в течение 1 ч 1%-ным раствором 0s о в О,1 М веронал-ацетатном буфере рН 7,2. Обезвоживание осуществляют 3 серии спиртов возрастающей концен рации cJT 50 до 100%. После выдерживания в смеси абсолютного спирта с ацетоном (1:1) объекты переносят в абсолютный ацетон, а затем - в смесь абсолютного ацетона с аралди.том (1:3), в смесь абсолютного ацетона с аралдитом (3:1). После полимеризации смолы монослой и -клеток отделяют йт стекла в жидком азоте и на ультрамикротоме приготавливают срезы для электронной микроскопии, контрастируют их раствором уранилацетата в этиловом спирте и просматривают под электронным микроскопом ЭВМ-100 Л. Твердые ферромагнитные частицы, содержащиеся в высокодисперсной магниточувствительной жидкости, являются однодоменными со средним магнитным моментом m 3,4 10 Гс и электроннооптически плотными. Совокупность этих свойств позволяет ускорить их в магнитном поле и наблюдать места их; сосредоточения в живой материи. Электронная микрофотография показывает, что после взаимодействия твердых частиц, находящихся в магни точувствительной жидкости с монослоем L-клеток магнититы находятся только на на.ружной поверхности клеточных мембран и внутриклеточно не обнаруживаются.. Пример 2. Монослой L-клеток с ферромагнитными ч.астицами, полученный согласно примера 1 до префиксации, помещают в магнитное поле с .индукцией 1,5 Тл и выдерживают б с, после чего фиксацию и все последующие операции проводят соглас-. но описанию примера 2. Воздействие неоднородного магнитного поля (тип магнита ФЛ-1) на монослой L -клеток а ферромагнитными частицами позволяет внедрить их в отдельные клеточные структуры и прострелить в некоторых участках клеточный объем насквозь,, при этом жизнеспособность клетки сохраняется.Аналогичные результаты получены с количеством 0,02-0,04 мл суспензии, а 10 частиц/мл и при воздействии полем с инщукцией 2,0 Тл и 3,0 Тл. При объеме ниже 0,02 мл и концентрации ниже 10 частиц/мл способ не осуществим из-за недостатка количества ферромагнитных частиц. Повышение, объема и концентрации выше 0,04 мл и 10 частиц/мл делают способ неосуществимым из-за Леренасыщения клеток ферромагнитными частицами, что., исключает возможность наблюдать структуры клеток под электронным микроскопом. При снижении индукции ниже 1,5 Тл способ не осуществим из-за отсутствия внедрения клеток внутриклеточно, а выше 3,0 Тл приводит к излишнему ускорению ферромагнитных частиц, изза чего наблюдается разрушение клеточной мембраны и потери жизнеспособности клеток, вследствие многочисленных прострелов.

Предлагаемый способ впервые разрешает вводить непосредственно внутриклеточно твердые частицы - магнититы с помощью простого и легкоосуществимого объекта - магнитного поля. В качестве внеклеточных веществ в предлагаемом способе используются TBepjjHe ферромагнитные частицы магниточувствительной жидкости, поэтому применение предлагаемого способа в исследовании жизнедеятельности Ь -клеток может сократить расходы, снизить токсичность маркеров. Кроме того, предлагаемый способ целесообрано использовать для создания высокоэффективных способов непосредственного воздействия на клеточные структуры биологически активными, например , лекарственными веществами путем их привязывания к ферромагнитным частицам, поскольку сохраняется жизнеспособность клеток.

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ li. -КЛЕТОК путем культивирования U -клеток, маркирования их лизосом внеклеточным веществом с последующим электронным микроскопированием, отличающийся тем, что, с целью внедрения внеклеточных .веществ при сохранении жизнеспособности клеток, в качестве внеклеточного вещества используют суспензию твердых частиц магнита с диаметром 8-10 нм, 0,02-0,04 мл суспензии в концентрации частиц/мл добавляют в питательную среду, далее культуру клеток подвергают воздействию ч I неоднородного магнитного поля с индукцией 1,5-3,0 Тл,s