Способ исследования жизнедеятельности @ -клеток Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

оо сд ел Изобретение отно ится к биологии и может найти прим ей те в иситопогии, геи.тике и медицине. Известен спсюоб ;следования жизнедеятельности L-клеток путем купыивирования | -клеток, мар внеклеточным велцест|вом с последующим электронным микроскопированием l . Однако применени маркеров имеет ря недостатков, так как одни из них не кмеют постоянного хими еского состава и по электронным микроск опом нельзя выявить вые, Другие (напри.их молекулы как так тивные белки) перемер ферментативно а вариваются самим лнЬосомным аппаратом третьи проявляют Kameporeimoe действие Все эти вещества остаются в клетке и их превращений под дейсостояние зависит от ствием лизосомной с стемы. Кроме того, извег тный способ не обес печивает избирательн ого разрушения марщфованных клеток. Цель изобретения - избирательное разрушение маркированн; зтх клеток Указанная цель д стигается тем, что согласно способу исс едования жизнедеятельности U-клеток 1утем культивироваНИИ. Ц-клеток маркирования их лизосом внеклеточным вещест ом с последующим эпированием маркиро электрозшым микроск ванне проводят добан лением в питат.епьную среду 2,5-3,5 «1 суспензии твердых иаметром 8-1О нм, частиц магнитите с j Ю частиц/мл, с концентрацией 1О ой средой, далее воз промывают немагнит. действуют на культу jy клеток неоднородным магнитным полем с индукцией в об2,0 Т. ласти монослоя 1,О- I П р и м е р 1. ;попьзуют клетки ли НИИ L,, полученной М1ОМ в результйте трансформации нормЕльных фибробластов мьпцей 20 -метилхозгантреном в культуре Пересеваемую кузЕЬтуру мышиных L, фи 37 С на покров клеток выраищвают Т-199, дополненных стеклах-в среде ной 10%-ной бычьей сывороткой, добавля ют 2,5 мл суспензтш твердых частиц маг ниточувствительной кидкости в воде и с концентрацией 10 астиц/мл. После 80ч роста монослой Ц-кпеток два раза промы вают питательной средой без магниточувствительной жидкости. После адгезии клеток к субстрату препараты префиксируют н 2,5%-ным растворо в течение 45-50 мт глутаровотчз альдегиад в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 , про 30 мин 0,1 М фосфатным буфером рН 7, ение 1 ч 1%-ным постфиксируют в те раствором OS О 4-в ,1 М веронал-ацетат ном буфере рН 7,2. Обеавоживание осуществляют в серии спиртов возрастающей концентрации от 50 до 100%. После выдерживаяия в смеси абсолютного спирта с ацетоном- (1:1) объекты переносят в абсолютный ацетон, а затем в смесь абсолютного ацетона с аральдитсм (1:3), в смесь абсолютного ацетона с аральди- том (3:1). После полимеризации смолы монослой L -клеток отделяют от стекла в хлцщом азоте. Срезы для электрошшй микроскопии приготавливают на ультрамикрогоме, контрастируют 3%-ным раствором уранил-ацегата в этиловом спирте и просматривают под электронным микроскопом, после чего префиксацию и все после.дуюише операции проводят согласно примера 1. Твердые ферромагнитные частицы, со« держащиеся в магниточувствительной жидкости, являются однодоменными со средним магнит1гым моментомгт -3,4-l6 TC/CN 3,4 10 Лм2 , электронно-оптичЪски плотными. Сочетание этих свойств позволяет не только ускорять ик в магнитном поле, но и наблюдать места их сосредоточения в живой материи. Электронно-микроскопическое исследоBaiffie препаратов показывает , что тверцые ферромагнитные частицы после культивирования сосредоточены в лизосомах L,клеток. П р и м е р 2. Монослой L -клеток с твердыми ферромагнитными частицами в лизосомах, полученный согласно примеру 1 после префиксации, помещают в неоднородное магнитное попе (тип магнита ФЛ-1) индукцией 1,5 Т в области монослоя и выдерживают в .течение 6 с, после чего префиксацию и все последуюигае операции проводят согласно примеру 1. Под воздействием магнитного поля ферромагнитные частицы, наход5шгиеся в лизосомах L. -клеток, ускоряются до такой степени, что разрывают лизОсомные мембраны и тем самым разрушают клетки. лизосомы которых маркированы магнитными частицами. Просмотр под электронным микроскопом показывает, что лизосомные мембраны разрушень, т.е. жизнеспособность клеток нарушена, они практически погибают. Аналогичные результаты получены при объеме магнитной суспензии 3,О и 3,5 мл И коьщентрации магнитных частиц Ю частиц/мл облучении магнитным полем с индукцией 2 Т. При объеме ниже 2,5 мл и концентрации ниже 10 частиц/мл способ неосушест31О35519-4

вим иэ-за недостаточности количества фер-дыми феррс лапттнымй частицвкш, разруромагнитных частиц дпя эдоцитоэа их вшаются как И1эдукцией в 2 Т, так и ин-

лизосомы Ц-клегок. Увеличение объемадукщюй 3,0-4,О Т одгаюково. Поэтому

выше 3.5 мл и концентрации выше 1О час- вепичение индукций не целесообразно иэтиц/мл приводит к значительному сниже- 5 расходов энергии.

нию роста U -клеток из-за перенасьшенияИспользова1гае предлагаемого способа

питательной среды твердыми ферромагнит-сокращает расходы, снижает токсичность

ными частицами..маркеров, используемых для идентификаИетенсивность индукции магштного по-шп и выделения лизосом. способствует

ля ниже 1 Т не способствует разрушению 0избирательнсялу разруше гаю клеток, лкзоклеток,а выше 2 Т неэффективна, т.е.сомы которых предварительно загружены

клетки, лизоссй 1ы которых загружены твер-ферромагнитными частицами.

СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ L -КЛЕТОК путем культивирования L,-клеток, маркирования их пизосом внеклеточным веществом с последующим электронным тиикроскопированием, отличающийся тем, что, с целью- избирательного разрушения маркированных клеток, маркирование проводят добавлением в питательную среду 2,5-3,5 мл суспензии твердых частиц магнитита с диаметром 8-10 нм, с концентрацией 10 -1О частиц/мл, промывают немагнитной средой далее воздей ствуют на культуру «леток неоднородным магнитным полем с индукцией в области монослоя 1,О-2,р Т . (Л С