Способ получения низших @ - @ -аминокислот Советский патент 1984 года по МПК C07C101/04 C07B29/00 C12P13/04 

О5

СО Ф

ю ю

Изобретение относится к усовер шествованию получения низших d-t,аминокислот, использующихся в фармакологии, пиадевой промыитенности, а также в качестве исходных соединений в пептидном синтезе.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения низших о.1.-аминокислот, заключающийся в том что исходную соответствующую d -кетокислоту вводят во взаимодействие со специфической к субстрату дегида ргеназ.ной в присутствии 0,1 М водного раствора соли аммония (например, двузамещенного Фосфата аммония), никотинамидаденййдинуклеотйда (НАД /НАДН при одновременной регенерации .HAflH из НАД с помощью метанола, этанола или этоксиэтанола в присутствии алкогольдегидрогеназы. При этом концентрация никотинамидадениндинуклеотида составляет приблизительно 1 ммоль/л, концентрация исходной Д-кётокислоты 10 ммоль/л, выходы целевых продуктов 4,4-93,1% (без учета стадии их отделения от никотинамидадениндинуклеотида, ферментов и фосфа та аммония) 1.

Недостатком известного способа яв ляется сложность пров.едения процесса, связанная с необходимостью отделения целевых продуктов от никотинамидадениндинуклеотида, дёгидрогеназы кетокислоты и алкогольдегидрогеназы. В результате этого указанные ферменты инактивируются, а Никитинамидадениндинуклеотид может частично разрушаться, что делает практически невозможным повторное использование указанных компонентов.

Целью изобретения является упрощение процесса энзиматического получения низших ot-1,-аминокислот из соотвётствующих низших oi-кетокислбт.

Указанная цель достигается способом получения низших о -Ь-аминокислот из соответствующих низших о(-кетокислот, заключающимся в том, что в реактор с мембраной для ультрафильтрации, средний размер пор которой равен 1-3 мкм помещают раствор формиатдегидрогеназы и специфической по отношению к исходной низшей оС-кетокйслоте дегидрогеназы, содержащий ВАД/НАДН в концентрации 3,553,92 ммоль/л, который связан с полиэтилен гликолем со средним мол-.весом 10 000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходной oi-кетокислоты в вида водорастворимой соли, и водный раствор формиата аммония в качестве ,соли аммония концентрацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе стороны мембраны поддерживают в пределах 0,2-0,5 бар,, и -непрерывно отводят из реактора через мембрану поток

фильтрата, содержащий целевоЦ .продукт.

Как правило, соотнесение между активностями формиатдегидрогенаэы и специфической по отношению к субстрату дегидрогеназы находится в интервале 1:(1-5).

Как правило, иьолобилизацию никотин ашдцин у клеотида на полиэтилен- . гликоле проводят обработкой кофермёнта этиленимином с последующей концентрацией полученного Ы аминоэтильного производного с карбоксилировайным поли эти лен гликолем с помсяцью водо растворимого карбодщимида, после чего иммобилизованньй продукт восстанавливают до соответствующего производного :f НАДН, превращают перегруппировкой по Димроту в N-производное и, в случае необходимости, окисляют до соответствующего произ водного НАД1.При зтом концентрация коэнзима обычно составляет 0,1 10 ммоль/л, предпочтительно 1 7 ммоль/л.

Концентрация формиата аммония предпочтительно должна быть равной концентрации исходной -кетокислоты или, по крайней мере, не ниже последней

Величину рН реакционной смеси пр проведении процесса обычно подцержи вают в интервале 5-9.

Как правило, целевые продукты выделяют известнь1ми способами, например, с помощью анионообменных смол. Осуществление предлагаемого способа дает уп ющение процесса получения низших oC-ti-аминокислот из соответствующих низших оС-кетокислот и заключается в более простом отделении целевых продуктов от исходных, например с помощью анионобменных смол; в возможности неоднократного повторного использования дорогостоящих компонентов - Формиатдегид1рогеназы, специфической по отношению к исходной с -кетокислоте дегидрогеназы, .никотинамидадениндинуклеотида в непрерывности проведения процесса; в меньшем объеме. | еакционной смеси (за счет увеличения концентраций) .

Пример. Термостатируемый при 40с реактор объемом 10 мп с плоской мембраной, снабженный магнит ной мешалкой и мембраной для ультрафильтрации диаметром 62 мм с номинальным пределом исключения 3QOO (фирма-поставщик Амикон, Виттен, тип ДМ 5) промывают для стерилизации водным раствором формальдегида при скорости подачи 20 мл/ч с применением дозирующего, насоса, в течение примерно 5ч. Затем в течение еще примерно 5ч раствор формальдегида вытесняют дистиллирование водой, После этого также при скорости подачи 20 МП/Ч в течение примерно 2,5 ч

пропускают профильтрованный через стерильный фильтр (0,2 мкм) раствор субстрата, содержащий 500 ммоль/л натриевой соли пировиноградной кислоты, 400 ммоль/л и 50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрич и дове- 5 данный до рН 8 при помсяци гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора субстрата подают, 10 мл раствора никотинамидадениндинуклеотида, содержащего 3,66 ммоль/л HAJrt ев я- занного с полиэтиленгликолем со средним мол. весом 10 000 и 50 ммоль/л фосфатного буферного.раствора Для .установления рН на уровне 8. После этого снова подают раствор cyecTpja- J5

та этого же состава со скоростью 20 мл/ч.

Затем в реакционное пространство перед мембраной через боковое отверстие вводят 100 мг формиатдегидроге- 20 назы .(активность 6,74 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстра та, и рН 8) в форме водного глицеринового раствора (50% по весу глицерина), 10 мг формиатдегидроге- 75

назы/мл и 1,62 MV Ь-аланиндегидрогеназы (активность 415 мкмоль/мг в минуту при пирувате в качестве субстрата, 40 с и рН 8) в форме водного раствора в сульфате аммония (2,4 моль/л сульфата аммония, 5 мг 30 Ь аланиндегидрогеназы/мл) при помощи шприца. При таком составе соотношение между активностями формиатдегидрогеназы и L-аланиндёгидрогеназы составляет ГЛ. За процессом превращенияЗЗ непрерывно следят при помсади вмонтированной в поток фильтрата проточной

кюветы поляриметра. Дифференциальное давление у мембраны достигает вначале О, 2 бар, затем постепенно повыша- 40 ется.до 0,5 бар и остается после этого постоянным, В течение рабочего периода, составляющего примерно 50 ч, получают 175 ммоль L-аланина. Максимальная скорость превращения достига-45 ет 6,45 ммоль L-аланина/ч.

Получают 108 ммоль L-аланйна. из ра гчета на 1 мг L-аланиндегидрогеназы или 1,75 ммоль L-аланина из расчета на 1 MJf формиатдегидрогеназы. -д Выход целевого продукта 35%, оптическая чистота 100%.

П р и м е р 2. Стерилизацию мембранного реактора объемом 10 gg плоской мембраной (мембрана с номинальным пределом исключения 5000, фирма-поставщик Амикон, Виттен, тип УМ 5), поддерживаемого при ,. проводят таким же способом, как и в примере 1.-60

При скорости подачи 20 мл/ч, в течение примерно 2,5 ч подают стерильно профильтрованный раствор, содержащий 400 ммоль/л натриевой соли пировиноградной кислоты, 400 ммоль/л фор-65

миата аммония и 50 ммоль/л однозамещенного ,фосфата натрия и установленный на уровне рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора субстрата при скорости подачи 4 мл/ч подают смесь из 7 мл раствора кознзима (в соответствии с примером 1) и 138 мг формиатдегидрогеназы (активность 0,85, мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата,. и. рН 8) в форме водного глицеринового раствора (50% по весу глицерина), 10 мг формиатдегидрогеназы/мл}. После этого в реакционное пространство через боковое отверстие в водят 2,78 мг L-аланиндегидрогеназы (активность 233 мкмоль/мг в минуту при пирувате в качестве субстрата, 25с и рН 8) в форме водного раствора в сульфате аммония (2,4 моль/л сульфата аммония, 5 мг Ь-аланиндегидрогеназы/мл) при помощи шприца Соотнсянение между активностями .формиатдегидрогеназы и Ь-аланиндегидрогеназы достигает 1:4, В течение 59 ч получают 48 ммоль L-аланина, что соответствует 17,3 ГУМОЛЬ L-аланина из расчета на 1 мг L-аланиндегидрогеназы или 0,35 ммоль Ь-аланина из расчета на 1 мг формиатдегидрогеказы. Выход.целевого продукта 10,2%, оптическая чистота 100%.

Пример З. Стерилизацию реактора объемом 10 мл с плоской мембраной (мембрана с номинальным пределом исключения 5000, фирма-поставщик Амикон, Виттея, тип УМ 5), термостатируемого при 25°С, проводят, как описано в примере 1.

При скорости подачи 20 мл/ч, в течение примерно 2,5 ч подают стерилно . профильтрованный раствор, содержащий 400 ммоль/л. натриевой соли пировиноградной кислоты, 800 ммоль/л формиата аммония и 50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрия и установленный на уровне рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора субстрата при скорости псщачи 4 мл/ч вводят смесь из 10 мл раствора коэизима (в соответствии спримером 1) и 85 мг форниатдегидрогеназы (активность 0,85 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата, и рН 8) в форме водного глицеринового раствора (50% по весу глицерина), 10 мг формиатдегидрогеназы/мл. После этого в реакционное пространство через боковое отверстие вводят при помоиди шприца 0;94 мг .L-аланиндегидрогеназы (активность 233 мкмоль/мг в минуту при пирувате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в форме водного раствора сульфата аммония (2,4 моль/л сульфа. та аммония, 5 мг L-аланиндегидрогеназы/мл), Соотношение между активностями достигает 1:2,2, В течение 140 ч получают 92 ммоль L-аланина, что соответствует 98 ммоль L-аланина из расчета на 1 мг L-аланиндегид рогеназы или 1,08 ммоль L-аланина из расчета на 1 мг Формиатдегидроге назы. Выход целевого продукта соста ляет 8,2%, оптическая чистотаЮО. П р и м е р 4. Термостатируемый при 25°С реактор объемом 11,3 мл с плоской мембраной, который снабжен магнитной мешалкой и ультрафильтрационной мембраной диаметром 62 мм с номинальной границей исключения 5рОО (фирма-поставщик Амикон, виттен, тип УМ 5), промывают для ст ерилизации с помощью установленно го на скорость подачи 20 мл/ч дозирующего насоса примерно в течение 5 ч водным 70%-ным раствором этилового спирта вытесняют дистиллирован ной водой. После этого также со ско ростью подачи 20 мл/ч примерно в те чение 5 ч подают профильтрованный ч рез стерильный фильтр (0,2 ммк) рас вор субстрата, который содержит 100 ммоль/л натриевой соли 2-оксо4 метилпентановой кислоты и 400 ммоль/л формиата аммония, и с п мощью раствора едкого натра устанав ливают рН 8. Затем в ток субстрата между дозирующим субстрат насосом и стерильным фильтром подают дозирова но 11,77 мл, соответственно 35,2 мг формиатдегидрогеназы (активность 4,06 мк моль/мг в минуту в случае формиата в качестве субстрата,- при 25°С и, рН 8) в форме водного полиэти лен гли кол евого раствора (40 вес.% этиленгликоля со средней мол, массой 400; 3 мг формиатдегидрогеназы/мл), Дополнительно аналогичным образом дозируют 1,6 мл, соответственно 6,72 мг лейциндегидрогеназы (активность 10,46 мк моль/мг в минуту в случае натриевой соли 2-оксо-4-метилпентановой кислоты в качестве субстрата, 400 ммоль/л формиата аммония, 25С и рН В) в форме водного раствора фосфата.калия (10 ммоль/л, рН 7)i следующие 5 ч дозируют раствор субстрата. После этого устанавливают.скорость подачи субст рата при. значении 11,3 мл/ч и добав ляют 2,88 мл раствора кофермента к ферменту, который содержит 3,92 ммоль/л НАДН, связанного с по лиэтиленгликолем со средней мол. массой 10 000 в форме водного раствора, в котором с помощью раствора едкого натра установлено рН 8, При этом соотношение активностей формиатдегидрогеназы к лейциндегидрогеназе составляет 1:2. Процесс контро лируют с помодью встроенной в поток фильтрата проточной кюветы поляриметра. Дифференциальное давление над мембраной постепенно повышается до О,35 бар и затем остается постоянным, В течение 205 ч (8,5 дней) получают 202 ммоль L-лейцина. Максимальная скорость процесса составляет 1,12 ммоль L-лейцина в час. Выход целевого продукта 87,2%, оптическая чистота 100%. ПримерБ. Термостатируемуй при 25°С реактор объемом 10 мл с Ш1ос,кой Мембраной, который снабжен магнитной мешалкой и ультрафильтрационной мембраной диаметром 62 мм с номинальной границей исключения 5000 (фирма-постановщик Амикон, Виттен, тип УМ 5), с помощью установленного на скорость подачи 20 мл/ч дозирующего насоса примерно в течение 5 ч для стерилизации промывают 70%-ным водным раствором этанола. Затем в течение следующих 5 ч раствор, этанола вытесняют дистиллированной водой. После этого со скоростью подачи 20 мл/ч примерно в течение 2,5 ч подают профильтрованный через стерильный фильтр (0,2 мкм) раствор субстрата, который содержит 100 ммоль/л натриевой соли 2-оксо4-метилпентановой кислоты, 400 ммоль/л формиата аммония и 50 ммоль/л однозамещенногр фосфата натрия, и с помощью раствора едкого натра устанавливают рН 8. Затем вместо раствора субстрата дозируют 7,| мл раствора кофермента, который содержит 3,80 ммоль/л НАДН, связанного с полиэтиленгликолем средней мол, массы 10 000,.и 50 ммоль/л фосфатного буфера с рН В. После этого дозируют 6J.,5 формиатдегидрогеназы (активность 2,60 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата, 25°С и рН 8) в форме водного раствора глицерина (50 вес,% глицерина; 10 мл формиатдегидрогеназы/мл) , Вслед за этим далее дозируют описанным образом раствор субстрата. Спустя примерно 5 ч поток субстрата уменьшают до 2 мл/ч. Затем в реакционный объем перед мембраной через боковое отверстие с помощью шприца Добавляют 31,6 мг лейциндегидрогеназы (активность 11,48 мкмоль/мг в минуту в случае натриевой соли 2-оксо-4-метилпентановрй кислоты в виде субстрата, при концентрации 4рО ммоль/л формиата аммония, 25°С и рН 8) в форме водного раствора фосфата калия(10.ммоль/л 4,2 мг лейциндегидрогеназы/мл). Соотношение активностей формиатдегидрогеназы и лейциндегидрогеназы составляет 1S2,3 .. Процесс контролируют с помощью встроенной в поток фильтрата проточной кюветы поляриметра, .Дифференциальное давление над мембраной устанавливается при значении

710696228

0,35 бар и затем остается постоям- . рость процесса составляет 0,20 ммоль ным.В течение 1152 ч 48 днеЛ) получааат L-лейцин а/ч. Выход целевого продукта 150 ммоль Ь-лейцина.Максимальней ско- 65Д% оптическая чистота 100%.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗШИХ 0 -L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ соответствующих низших ot-кетркислот в присутствии специфической по отнсшению к субстрату дёгидрогеназы, соли аммония и никотинамидадёйиндинуклеотида (НАДVHAflH) при одн9времённой регенерации НАДН из НАД отличаю-, щ и и с я тем, что, с целью упроадения процесса, в реактор с мембраной для ультрафильтрации, средний размер пор кот.орой равен 1-3 мкм, помещают раствор форьшатдегидрогеназы и специ.фической по отношению к исходной низшей oi. -кетокислоте дегидрогеназы, содержащий НАД VHAДH в концентрации 3,55-3,92 1 1моль/л, который связан с полизтиленгликолем со средним молекулярным весом 10 000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходной сА--кетЬкислоты в виде водорастворимой соли и водный раствор формиата аммония в качестве соли аммония концент- § рацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе стороны мембра- /Л на поддерживают 0,2-0,5 бар, и непре-V рывно отводят из реактора через мемб- 1. рану поток фильтрата, содержащий целевой продукт 2