СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ IV И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 2009 года по МПК C07D209/04 C07C269/04 C07C271/12 C12N1/21 C07H21/04 C12P13/00 C12P15/00 C12N9/02 C12N9/06 C12N15/74 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Способ получения циклопропилконденсированных ингибиторов дипептидилпептидазы IV предусматривает использование ВОС-защищенного амина структурной формулы (3), полученного путем восстановительного аминирования кислоты формулы (1) обработкой указанной кислоты формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенным концентратом ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH) и без вьделения - обработкой полученного амина формулы (2) дитретбутил-дикарбонатом с получением ВОС-защищенного амина. 6 н.и 7 з.п. ф-лы.

1. Способ получения частично очищенных концентратов фенилаланиндегидрогеназы и/или формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), который включает следующие стадии:
а. получение культуральной жидкости микроорганизма Escherichia coli JM110 (pBMS 2000-PPDFDH-mod), способного продуцировать фенилаланиндегидрогеназу и/или формиатдегидрогеназу;
b. подвергание культуральной жидкости микрофлюидизации для высвобождения ферментативной активности из клеток и получения микрофлюидизированной культуральной жидкости, обладающей PDH и/или FDH активностью,
c. очистка культуральной жидкости путем обработки ее флокулирующим агентом, чтобы скоагулировать клеточный дебрис и удалить ДНК и нежелательные белки;
d. фильтрование очищенной культуральной жидкости; и
е. концентрирование культуральной жидкости с получением частично очищенного ферментного концентрата, обладающего PDH/FDH активностью, с PDH активностью, по крайней мере, около 400 МЕ/мл и FDH активностью, по крайней мере около 20 МЕ/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость подвергают микрофлюидизации под давлением в интервале от около 12000 пси до около 20000 пси.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость подвергают микрофлюидизации при поддержании температуры культуральной жидкости ниже 25°С.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что температуру культуральной жидкости поддерживают ниже 25°С.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищенную культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации.

6. Способ получения амина структурной формулы

который включает стадии
а. обработки водного раствора кетокислоты структурной формулы

формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенной смесью ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), полученных способом по п.1, при температуре от 35 до 40°С;
b. поддержания pH реакционной смеси гидроксидом натрия в пределах от 7,8 до 8,2 с получением амина формулы 2.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что реакцию ведут течение периода времени от около 24 ч до около 48 ч для получения амина формулы 2.

8. Способ получения ВОС-защищенного амина структурной формулы

который включает стадии
а. получения водного раствора аминокислоты (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло [3.3.1.1^3,7]декан-1-уксусной кислоты структурной формулы

путем восстановительного аминирования кетокислоты

где водный раствор (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло[3.3.1.1^3,7] декан-1-уксусной кислоты, формиата аммония, никотинамидадениндинуклеотида, дитиотреитола и частично очищенным концентратом ферментов
фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), полученным способом по п.1, нагревают до температуры от 35 до 40°С и поддерживают pH реакционной смеси гидроксидом натрия в пределах от 7,8 до 8,2, с получением указанного раствора аминокислоты; и
b. обработки вышеуказанного водного раствора дитретбутилдикарбонатом с получением ВОС-защищенного амина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что pH смеси водного раствора и дитретбутилдикарбоната поддерживают в пределах от около 8,5 до около 12,5.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадии выделения ВОС-защищенного амина из реакционной среды и его кристаллизации.

11. Частично очищенная смесь ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, полученная способом по п.1.

12. Способ получения ВОС-защищенного амина формулы

который включает стадии
а. получения частично очищенного концентрата ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, путем
получение культуральной жидкости микроорганизма Escherichia coli JM110 (pBMS 2000-PPDFDH-mod), способного продуцировать фенилаланиндегидрогеназу и/или формиатдегидрогеназу;
подвергание культуральной жидкости микрофлюидизации для высвобождения ферментативной активности из клеток и получения микрофлюидизированной культуральной жидкости, обладающей PDH и/или FDH активностью,
очистки культуральной жидкости путем обработки ее флокулирующим агентом, чтобы скоагулировать клеточный дебрис и удалить ДНК и нежелательные белки;
фильтрование очищенной культуральной жидкости; и
концентрирование культуральной жидкости с получением частично очищенного ферментного концентрата, обладающего PDH/FDH активностью, с PDH активностью, по крайней мере, около 400 МЕ/мл и FDH активностью, по крайней мере около 20 МЕ/мл;
b. обработки водного раствора кетокислоты структурной формулы

формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенной смесью ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, полученных на этапе (а) при температуре от 35 до 40°С;
c. поддержания pH реакционной смеси с помощью гидроксида натрия в пределах от 7,8 до 8,2 с получением амина формулы 2

и
d. обработку вышеуказанного водного раствора дитретбутилдикарбонатом без выделения промежуточной аминокислоты с получением ВОС-защищенного амина структурной формулы
.

13. Способ получения соединения в виде свободного основания формулы

который предусматривает получение ВОС-защищенного соединения формулы 3

путем получения водного раствора аминокислоты (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло[3.3.1.1^3,7]декан-1-уксусной кислоты структурной формулы

путем восстановительного аминирования кетокислоты

где водный раствор (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло[3.3.1.1^3,7]декан-1-уксусной кислоты, формиата аммония, никотинамидадениндинуклеотида, дитиотреитола и частично очищенных концентратов ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), полученных способом по п.1, нагревают до температуры от 35 до 40°С и поддерживают pH реакционной смеси гидроксидом натрия в пределах от 7,8 до 8,2, с получением указанного раствора аминокислоты; и
обработку вышеуказанного водного раствора дитретбутилдикарбонатом с получением ВОС-защищенного амина формулы 3;
обработку ВОС-защищенного соединения мезилхлоридом и диизопропил-этиламином и соединением формулы J

и 1-гидроксибензотриазолом (НОВТ) с получением ВОС-защищенного промежуточного соединения структуры К

дегидратирование промежуточного К в присутствии пиридина и трифторуксусного ангидрида, последующий гидролиз продукта реакции в присутствии сильного основания с получением соединения L

и обработку соединения L соляной кислотой с получением соответствующей солянокислой соли L'

обработку соединения L' гидроксидом натрия с получением соединения М' в виде свободного основания.