Устройство для флуоресцентного исследования биологических объектов Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 G01N21/64 

Изобретение относится к микробио логическим исследованиям, а именно к устройствам выделения и идентифи кации биологических объектов, и может быть использовано в онкологии (поиск опухолевых клеток ), в санитарно-эпидемиологической службе (по иск патогенных бактерий) , а также в службах контроля водоочистных сооружений. Известно устройство для флуоресцентного исследования биологических объектов, содержащее измерительную кювету открытого типа, соединенную гидравлическим: трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулировочный тубус, систему подачи и сток транспортной среды, оптическую сист му, включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и амплитудный дискриминат с регистратором. В известном устройстве непрерывное возбуждающее излучение проходит через фокусирузрщую линзу, светофиль дихроичное зеркало и направляется микрообъективом на микроотверстие,, которое связано с каналам подачи биообъектов. Ф1иооресцентное излучен биообъекта, проходящего через микроотверстие, собирается мйкрообъективо и через оптический фильт;р попадает на фотоприем1«ис. Сигнал с фотоприемника усиливается и подается на регистрирующее устройство Cll . Данное устройство, хотя и обладае повьааенной чувствительностью и точностью регистрации биообъектов, одща ко не может оперативно производить селекцию сигналов об обнаруживаемых биообъектах, находящихся в смеси с другими биообъектами. Такая задача является типичной при обнаружении малых концентраций опухолевых клеток в крови, а также и в некоторых други случаях, связанньк с обнаружением би объектов на фоне других, по различны флуоресцентным тестам.Регулировкой коэффициента ус 1пения усилителя мржно добиться лишь частичной селекции сигналов флуоресценцин, т.е. производить отсечку сигналов от слабофлуоресцирующих биообъектов, однако это уменьшает надежность и точность устройства вследствие рассогласования цепи усилитель - блок регистрации . Цель изобретения - сокращение времени анализа селекции малых концентраций исследуемых объектов на фоне концентрированных популяций биообъектов. Указанная дель достигается тем, что устройство для флуоресцентного исследования биологических объектов, содержащее измерительную кйвету открытого типа, сообщенную гидравли ческим трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулировочный тубус, систему подачи и стока транспортной среды, оптическую систему, включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и амплитудный дискриминатор с регистратором, имеет два канала подачи фоновых и обнаруживаемых биообъектов, каждый из которых вктлочает резервуары с объектами, электромеханический зажим н гидравлический тракт, последние соединены в общей точке между собой и с гидравлическим трактом канала подачи исследуемой среды, третий электромеханический зажим, установленный в гидравлическом тракте канала подачи исследуемой среды, три управляемых ключа, сигнальные входа которых объединены и соединены с выходом усилителя блок установки пороговых уровней, соединенный с амплитудным дискриминатором, выход которого соединен с регистратором, и управляемый кольцевой счетчик, вьЬсоды которого соединены с управлякяцими входами каждого из электромеханических зажимов и каждого управляемого ключа, причем выходы первого и второго управляемых ключей, управляющие входы которых соединены с электромеханическими зажимами каналов подачи фоновых и обнаруживаемых биообъекто)в, соединены с входами блока установки пороговых уровней, а выход третьего управляемого соединен с входом амплитудного дискриминатора. С целью повышения достоверности селекции исследуемых объектов селекции исследуемых биообъектов амплитудный дискриминатор выполнен двухпороговым. На фиг. 1 изображено предлагаеое устройство; на фиг. 2 - структурая схема блока установки пороговых уровней. Устройство содержит резервуар 1 с транспортной средой, канал 2 подачи транспортной среды, микроотверстие 3, измерительную кювету 4 открытого типа с канавкой, канал 5 стока, резервуар 6 для стока транспортной среды, канал 7 подачи биообъектов, резервуар 8с фоновыми биообъектами, резервуар 9с обнаруживаемыми биобъектами, резервуар 10 с исследуемыми биообъекта ми, микрообъектив П, дихроичное зеркало 12, источник 13 возбуждающего излучения, светофильтр 14, фотоприемник 15, усилитель 16, первый управляемый ключ I 7, второй управляе ый ключ 18, третий управляемый KJB04 19, двухпороговьй дискриминатор 20, блок 21 установки пороговых уровней кольцевой счетчик 22, первый электромеханический зажим 23, второй электромеханический зажим 24, третий электро механический зажим 25, регистратор 26, основание 27 канавки, канал 28 ..подачи фоновых биообъектов, канал 29 подачи обнаруживаемых биообъектов , герметичный регулировочный, тубус 30, прижимные винты 31, кольцевые пружины 32, герметизирующую прокладку 33, свето фильтр 34 и фокусирующую линзу 35Ф Измерительная кювета 4, состоящая из основания 27 и канавки, снабжена тубусом 30 с прижимными винтами 31, 1кольцевыми пружинами 32, герметизирующей прокладкой 33 и имеет отверстие, в котором размещен микроо0ъекти 11, на оптической оси которого после довательно расположены дихроичное зеркало 12, светофильтр 14 и фотопри емник 15j выход которого соединен с входом усилителя 16. Измерительная кювета 4 через микроотвёрстие 3 соединена с каналом 7 подачи биообъектов, через канал 2 подачи транспортной среды - с резервуаром 1 с транспортной средой, а через канал 5 стог ка - с резервуаром 6 для стока транспортной среды. Оптическая ось источника 13 возбуждающего излучения фокусирующей линзы 35 и светофильтра 34 перпендикулярна оптической оси микрообъектив П и пересекается с ней в месте расположения дихроичного зеркала 12. Три электрозажима 23, 24 и 25 рас положены снаружи на каналах подачи фоновьвс биообъектов 28, обнаруживаемых 29 и исследуемых 7 биообъектов соответственно.. , Перед началом работы оператор устанавливает величины верхнего и нижнего порогов двухпорогового дискриминатора. Выставление величин порогов осуществляется следующим образом. По команде оператора (нажатие кнопки Пуск первый раз) на первом выходе кольцевого счетчика 20 появляется электрический сигнал, который поступает одновременно на управляемый зажим 21, открывая его и разрешая доступ к фоновым биообъектам в кювету (в исходном положении все три клапана закрыты) , и на управляемый ключ 17, разрешая прохождение через него электрических импульсов (в исходном состоянии все три ключа разомкнуты). Популяция клеток фоновой культуры попадает в кювету. Сигналы от этих клеток через открытый ключ I7 попадают на первый вход блока 21 установки пороговых уровней. В этом блоке определяется математическое ож1едание т и дисперсия М распределения интенсивности флюоресценции клеток (фоновых биообъектов и по ним определяется нижний-порог для двухпорогового дискриминатора 20. Далее оператор нажимает второй раз кнопку Пуск, электрический сигнал появляется на втором выходе кольцевого счетчика 22 и пропадает на первом, после чего первый управляемый зажим 23 закрывается, первый управляемьй ключ 17 размыкается, второй управляемый клапан 24 открывается и второй управляемый ключ 18 замыкается. Таким образом, аналогично определяют математическое ожидание т и дисперсию М2 распределения интенсивности свечения обнару-, живаемой культуры биообъектов и по ним определяется верхний порог для двухпорогового дискриминатора 20. После выставления порогов оператор третий раз нажимает кнопку Пуск, в результате чего второй управляемый клапан 23 закрывается, второй управляемый ключ 18 размыкается, третий управляемый клапан 25 открывается и третий управляемый KIU04 19 замьвсается. Таким образом, устройство готово. . к обнаружению . искомых клеток а исследуемой популяции (например, обнаружение опухолевых клеток на фоне нормальных). Устройство работает в этом режиме следукмщим образом. Взвешенные в водной пробе исследуемые биообъекты из резервуара 10 с исследуемыми биообъектами поступают через открытый канал 7 подачи био объектов и микроотверстие 3 в иэмерительиую кювету 4 за счет разрежени которое создается смьшной жидкостью, проходящей через канал 2, кювету 4 и канал 5. Измерительная кювета выполнена открытой для погружения в нее микрообъектива 11 и снабжена установлен- с возможностью перемещения вдоль оптической оси герметичньм регулировочным тубусом 30 с отверстием, в котором размещен микрообъектив 11. Тубус 30 навинчивается на основание кюветы 27, выполненной из некорродирэтвдего материала, а для герметичнос ти между ними устанавливается кольце вая герметизирующая прокладка 33 из вакуумной.резины. Микрообъектив 1J крепится в отверстии тубуса 30 посредством кольце вых пружин 32 и прижимных винтов 31. Возбуждающее излучение от источника 13 через линзу 35 и светофильтр 34 попадает на дихроичное зеркало 12 и отраженное им собирается микрообъективом П в фокусе которого находится микроотверстие 3. Настройка фокуса микрообъектива I1 на микроотверстие 3 осуществляется перемещением вдоль оптической оси тубуса 30. Выде живание соосности микрообъектива 11 и микроотверстия 3 осуществляется прижимными винтами 31. Возбзгждающее излучение поглощается биологическим объектом, проходяищм через микроотверстие 3. Флуоресцентное излучение этого объекта собирается микрообъективом II, пропуск ется дихроичным зеркалом 12 и через светофильтр 14 попадает на фотоприем ник 15, где преобразуется в злектрические импульсы. Амплитуда этих импульсов, пропорциональная интенсивности импульса флуоресценции, через усилитель 16, третий yпpaвляe в й ключ 19 и двухпороговый дискриминатор 20 только тогд попадает в регистратор 26, когда амплитуда импульса превьщ1ает нижний fiopor дискриминатора. Если амплитуда импульса не соответствует величине окна дискриминатора, то сигнал на блок регистрации 26 не пропускается. Таким образом, регистратор показьшает число импульсов за определенный период времени, т.е. показьгоает концентрацию исследуемых биообъектов в опытной пробе (с заранее заданной вероятностью правильного обнаружения и ложной тревоги). Кроме того, окно из двух порогов позволяет отселектировать исследуемые биообъекты от других биообъектов,присутствующих в пробе,так как плотности вероятностей распределения амплитуд для разных биообъектов отдичаются друг от друга. Блок 21 установки пороговыхуровней может быть реализован несколькими способами. Одна из схем реализации показана на фиг. 2, где 36 и 37 -ключи, 38 и 39 -накопители,40 и 41 -счетчики, 42 -квадратор, 43 - вычитающее . устройство, 44 - дешифратор.. Рассматриваем подробнее релизацию блока 21 установки пороговых уровней. Математическое ожидание (среднее) амплитуды импульсов вычисляется следующим образом: I М 4ZVi/N , ,(Щ // где Vi - амплитуда i-oro импульса; N - число импульсов. Следовательно, для вьгчисления среднего необходимо накопить амплитуды пришедших N импульсов, а затем эту суммарна величину поделить на число пришедших импульсов N. Накопитель легко реализуется, например, на емкости с большой постоянной времени разряда или на накапливающем сумматоре. Делитель на заранее неизвестное число N реализовать сложнее. Поэтому используется схема деления на заранее известное число. Осуществляется это следующим образом. Счетчик считает заранее известное число импульсов (например. К) , после чего на его выходе появится сигнал, которьй закрывает ключ, бывщий до этого открытым. В накопителе, таким образом, накопятся амплитуды К иммульсов. Установив коэффициент передачй накопителя или ключа равным 1/К, получим напряжение на выходе накопителя, равное среднему значению амплитуд импульсов. Известно, что дисперсия M-(V) определяется следующим образом: M2(V) « m,,(V - ( m(V)2 . Имея схему вычисления среднего, нетрудно составить схему вычисления исперсии, используя также квадраторы и вычитающее устройство. Дешифра; тор по комбинации четырех входных игналов выдает два выходных пороговых сигнала и может быть регшизован на диодной матрице.

Двухпороговьй дискриминатор пропускает сигнал на выходе,только если амплитуда сигнала больше нижнего порога и меньше ерхнего, в других случаях выходной сигнал равен нулю.

В качестве источника возбуждающего излучения может использоваться оптический квантовый генератор с . излучением в Диапазоне 300-490 МК. В качестве фотоприемника могут использоваться фотоумножители ФЭУ-79 или ФЭУ-39А.

В кольцевом счетчике 22 йапряжение логической единицы (3,5-4 В) присутствует всегда только на выходе одного триггера, а на выходах остальных - ноль. При подаче на синхровходы управляющего сигнала (в данном случае при замыкании кнопки Пуск подается нулевой управля- ющий сигнал) логическая единица переходит на выход последующего в цепи триггера. Таким образом, при каждом нажатии кнопки Пуск логическая единица продвигается на один триггер

вперед и после четырех нажатий кнопки окажетог в исходном состоянии. Четвертый триггер необходим для хранения логической единицы в то время, пока устройство не работает. Периодичность нажатия кнопки рассчитывается заранее и обычно составляет несколько минут.

Транспортная среда представляет собой смывную жидкость, например воду Фоновые биоЪбъекты - это раствор той среды, в которой находятся атипичные биообъекты, (например, кровь), обнаруживаемые биообъекты - зто те атипичные биообъекты, наличие которых необходимо выявить в исследуемо пробе (например, раковые клетки ).

В качестве усилителя можно использовать любой стандартный импульсный усилитель напряжения. В качестве микрообъектива может быть использован микрообъектив водной иммерсии с увеличением 30 и числовой апертурой 0,9.

В качестве блока регистрации может использоваться любой цифровой счетчик импульсов АИ-256, АИ-1024.

иг. 1

н

JUSL,

1. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ, содержащее измерительную кювету открытого типа, сообщенную гадравлическим трактом с каналом подачи исследуемой среды, регулировочный тубус, систему подачи и стока °. транспортной среды, оптическую систему, включающую источник излучения и фотоприемник, соединенный через усилитель и амплитудный дискриминатор с регистратором, о т л и ч а ю е ее я тем, что, с целью сокра щения времени анализа,селекции малых концентраций исследуемых биообъектов на фоне концентрированных популяций биообъектов, оно имеет два канала подачи фоновых и обнаруживаемых биообъектов, каждый из которых включает резервуар с объектами, электромеханический зажим и гидравлический тракт, последние соединены в общей точке межДу собой и с гидравлическим трактом канала подачи исследуемой среды, третий электромеханический зажим, установгленный в гидравлическом тракте канала подачи исследуемой среды, три управляемых ключа, сигнальные входы которых объединены и соединены с выходом усилителя, блок установки пороговых уровней, соеднненный с амплитудным дискрииинатором, выход которого соединен с регистратором, i и управляемый кольцевой счетчик, выходы которого соединены с управ(Л ляющими входами каждого из электромеханических зажимов и каждого управляемого ключа, причем выходы первого и второго управляемых ключей, управлякодие входы которых соединены с электромеханическими зажимами каналов подачи фоновых и ;О обнаруткиваемых биообъектов, соединеО 00 ны с входами блока установк пороговых уровней, а выход третьего управСП ляемого ключа соединен с входом амплитУдного дискриминатора. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что, с целью повышения достоверности селекции исследуемых биообъектов, амплитудный дискриминатор выполнен двухпороговым,