Способ определения повреждения микроорганизмов Советский патент 1984 года по МПК C12Q1/02 C12N13/00 C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе и микробиологической промышленности для определения действия на микроорганизмы .поврежданлдих факторов. Известен способ определения микр организмов, способных к размножению после воздействия на них повреждающих факторов путем их посева на пи тательный агар и подсчета выросших колоний l , Недостатками известного способа являются большая длительность (от 1 до 14 сут), связанная с тем, что скорость роста микроорганизмов на агаре невелика и для образования заметной колонии требуется значител ное время. Кроме того, этот способ имеет недостаточную точность (погрешность измерений до 30% , что обу ловлено неустранимыми погрешностями при разведении исходного препарата и распределении посевного материала на питательном агаре. Наиболее близким по, технической сущности к предложенному является способ определения повреждения клеток хлореллы при воздействии на них повреждающих факторов по степени электроориентации при помещении суспензии клеток в переменное электри ческое поле, Согласно этому способу клетки помещают Б переменное электрическое поле и наблюдают с помощью микроско па за их поведением в поле. Повреждение микроорганизмов определяют по степени электроориентации, т.е. по потере ими способности образовывать цепочки вдоль силовых линий поля и по смещению частотных границ, на ко торых наблюдается вращение клеток вблизи электродов 2. Наиболее существенными недостатками этого способа, являются отсутствие количественной оценки процента поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце и наличие субъективной ошибки вследствие визуального определения повренодения клеток. Цель изобретения - повышение точ ности анализа, т.е. определение поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце. Указанная цель достигается спосо бом определения повреждения микроор ганизмов при внешних воздействиях по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, при.чем определяют степень элейтроориен тации образцов интактных и полность поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной супензии при частоте электрического оля (SlO -S-lo) и (11о5-1 10) Гц, ычисляют отношение степеней электрориентации для каждого образца на тих частотах, а повреждение микрорганизмов в исследуемом образце ценивают по соотношению поврежденых и неповрежденных микроорганизмов огласно формуле Р- PI --;г-7Г оо7о, сб - процент неповрежденных клеток микроорганизмов в исследуемом образце} |J - отношение степени электроориентации клеток микроорганизмов в исследуемом образце в электрическом поле указанных частот; ро - то же, для клеток интактных микроорганизмов PI - то же,для клеток полностью поврежденных микроорганизмов , причем определение степени ориентации клеток ведут при рН 4,5-7,5, удельной электропроводности суспензии микроорганизмов (Ю -10 ) Омм и напряженности электрического поля (2-15). На фиг.1 дана частотная зависимость степени электроориентации клеток Pseudomonas aeruginosa, инкубированных при разных температурах в течение 15 мин: 1-25, 2-44, 3-61°С, 6-810 на фиг, 2 - то же, клеток Escherichia co2i, инкубированных при различных температурах в течение 15 мин: 1-37, 2-49, , 6 16 Oмм рН 4,5; на фиг.З - то же, рН 7,5; на фиг,4 - то же, при разной электропроводности суспензии, Otf 1-10, 2--3-10,- 4-10 5 1,7±0, рН 6,5-, на фиг. 5 --зависимость степени электроориентации от напряжения на эдектродах ячейки для бактериальных клеток BeclSius thuringiensis (1) И Pseudomonas aeruglnosa (2) при частоте электрического поля 10 Гц,, электропроводности суспензии 10 OMM% рН 5,5;на Лиг.6 схема устройства, реализуюпего предлагаемый способ на фиг.7 - частотная зависимость степени электроориентации клеток Escherichia co2i, инкубированных при различных температурах в течение 15 , 2-47, 3-53, 4-61 С, рН 6, и lOoMVr ;, на фиг.8 - то же,, клеток Escherichia coii интактных (l) и подвергнутых однократному (2) и четырехкратному (3) замораживанию-оттаиванию,рН 6,5, 6 210 ОмV; на Лиг. 9 - то же, клеток Escherichia coli ьтнтактных Ц) и обработанных 0,5%-ой (2) 1%-ой (зУ и 3%-ой .(4) эмульсией толуола (.время обработки 20 мин) , рН 6,5,6 210 Ом мЧ на фиг. 10 то же, клеток Escherichia coli интактных (l) и обработанных 20%-м (2) и 30%-м (З) раствором этанола (время обработки 20 мин), рН 6,5, 6 2-10 Ом м. Согласно представленным графикам достаточно достоверное определение степени электроориентации клеток возможно при указанных параметрах электрического поля, так как именно в этих условиях имеют место характе ные изменения кривых частотной зависимости степени электроориентации что и позволяет использовать отноше ние эффектов, регистрируемых в поле мегагерцевой и килогерцевой частот для количественной оценки числа поврежденных клеток (по расчетной фор муле) . При указанных напряженности электрического поля,рН и удельной электропроводности суспензионной среды это отношение имеет максималь ную величину для интактных клеток, что также повышает точность иэмереИзмерения проводят при напряжени на измерительной ячейке, соответств ющем линейному участку ее амплитудной характеристики. Определение килогерцевого и мега герцевого диапазона частот. Килогерцевый диапазон частот включает частоты от 4-10 до 4-10 Г а мегагерцевый от 10 до 10 Гц. Указанные пределы определяются тем, что у клеток разных видов область минимума в килогерцевом диапазоне и максимума(в мегагерцевом диапазоне) частотной зависимости степени электроориентации несколько отличается (фиг. 1 и 2), а также тем, что в области максимума и минимума допустима регистрация эффекта на частотах, где имеет место 10%-ое изменение эффекта по отношению к экстремальной величине. Диапазон рН исследуемой суспензи определен в пределах 4,5-7,5, так как в этом случае обеспечиваются iнаилучшие условия регистрации повреждения клеток, особенно при низких рН (фиг.2 и 3), а также потому, что в этом диапазоне бактериальные клетки наименее подвержены слипанию ухудшающему наблюдение эффекта элек троориентации. Соответствунидими изм рениями установлено, что в случае Escherichia coli наблюдают слипание клеток при ,0 и рН 7,5. Диапазон удельной электропроводности исследуемой суспензии определен в пределах от 10 до 10 Ом м ,так как при этих значениях обеспечи вается наиболее надежная регистрация килогерцевого минимума и мега.герцевого максимума частотной зависимости степени электроориентации (фиг.4) . Увеличение электропровод ности свыше 10 нежелательно в связи с РОСТОМ мешающих факторов (разогревание суспензии, тепловая конвекция), снижающих точность измерения степени электроориентации. Диапазон напряженности электрического поля определен в пределах от 2-10 (и 6 В) до 15-10 В/м{и 45 В , так как он соответствует максимальному изменению эффекта электроориентации в зависимости от напряжения на электродах ячейки фиг.5), а именно эта область значений напряжений позволяет наиболее точно выявить и зарегистрировать Килогерцевый минимум и мегагерцевый максимум частотной завис.имости степени электроориентации клеток, что в конечном счете обеспечивает достаточно высокую точность при определении повреждения клеток согласно изобретению. Из фиг.5 видно, что область допустимых значений напряжения (заштрихованная) для более крупных кле(Ток (кривая 1) лежит при меньших, а в случае более мелких клеток (кривая 2) ПРИ больших значениях напряжения на электродах ячейки, (и, следовательно, напряженности поля в суспензии). Пример. Исследуют тепловое повреждение грамотрицательных бактерий Esoherichia coli НВ-1100. Клетки инкубируют при температуре от 37 до 61°С в течение 15 мин. Измерения электроориентации по пред лагаемому способу можно проводить в средах с удельной электропроводностью от Ом ми ниже и при рН 4-12. Однако опыты показали, что повреждения клеток выявляются лучше, если параметры суспензии выбирают следукадими: удельная электропроводность ниже, рН 7,5 и ниже. Поэтому параметры суспензии следующие: удельная электропроводность 2«10 Ом м, рН 6,0. Степень электроориентации микроорганизмов определяют на известном устройстве для контроля лиэкологического состояния клеток 3j . На фиг.б изображена блок-схема устройства, которое состоит из источника 1 света, измерительной ячейки 2 с.решетчатыми электродами 3 и 4 и окнами 5 из оптического стекла, фотоэлемента 6, самопишущего потенциометра 7, генератора 8 переменного напряжения и вольтметра 9. Устройство работает следующим образом. Световой поток от источника 1, пройдя диэлектрофоретическую ячейку 2, фотоэлементом 6 преобразуется в электрический сигнал, регистрируемый самописцем 7. Неоднородное элек трическое поле создается в заполняющей ячейку клеточной суспензии с помощью решетчатых электродов 3 и 4 При включении генератора 8 клетки ориентируются вдоль силовых линий поля и самописец регистрирует резко изменение проходящего через ячейку светового потока. Величина этого изменения характеризует степень электроориентации клеток. Меняя частоту генератора 8 при постоянном напряжении на электродах ячейки 2, получают степень ориентации клеток на разных частотах. Как показывают опыты, величина (3 для неповреж денных клеток значительно уменьшает ся, если выбрать напряжение на ячей ке соответствующим области насыщения эффекта электроориентации по амплитудной .характеристике ячейки. При этом точность измерений значительно уменьшается. В связи с вышеизложенным величину напряжения на электродах ячейки выбирают равной 20 В, так как для клеток кишечной палочки насыщение эффекта электроориентации наступает при напряжении свыше 35 В и напряжение 10-20 В соо ветствует линейному участку ампли:тудной характеристики. Определяют степень электроориентации клеток в поле мегагерцевой 4105 Гц) и килогерцевой (Ю Гц) частот и отношение степени электроориентации на этих частотах для сус пензии интактных (37°С), полностью поврежденных (61°С) клеток, а также клеток из суспензий, инкубировавших ся при промежуточных температурах. По выражению (1) рассчитывают процент неповрежденных микроорганизмов в анализируемых образцах. Полученные данные приведены в табл. 1. Таблица ТемпураРезультаты определения тура, С повреждения микроорганиз мов, % Из табл. 1 видно, что с увеличением температуры инкубации величины Р и ui уменьшаются, что связано с увеличением числа поврежденных клеток . Пример 2 .Исследуют тепловое повреждение грамположительных бактерий BaciJJus thuringiensis ШТ.26. Клетки инкубируют при температуре от 26 до 55°С в течение 20 мин. Удельная электропроводность суспензии 2 10 Ом м рН 6,0. Напряжение на электродах ячейки 15 В. Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1, Результаты приведены в табл.2. Таблица 2 Из табл.2 видно, что ив этом случае с увеличением температуры величины /3 и oi. уменьшаются, что свидетельствует о повреждении клеток при нагревании. Пример 3. Исследуют тепловое повреящение грамотрицательных бактерий Pseudomonas acruginosa. Клетки инкубируют при температуре от 37 до 61°С в, течение 20 мин. Удвльная электропроводность суспензии 10 Ом Ml, рН 6,0. Напряжение на электродах ячейки 15 В. Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1. Результаты представлены в табл.3. Таблица 3

И в этом примере повреждение кле ток ПРИ нагревании приводит к умень шению и (А .

Использование предложенного способа определения повреждения микроорганизмов обеспечивает в сравнении с известным количественную оценку числа жизнеспособных клеток, а значит, увеличение точности .

Следует также отметить, что при

анализе бактериальных клеток небольшого размера (менее 10 м) применение известного способа невозможно в связи с тем, что размер таких клеток находятся на пределе разрешения светового микроскопа и визуальный анализ их поведения в поле невозможен. Предложенный способ при-) меним для анализа и таких мелких клеток.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ при внешних воздействиях по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа, определяют степень электроориентации образцов интактных и полностью поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной суспензии при частоте электрического поля соответственно

, оС

SO

«

Фиг. ч

7 tfff г 3 ff 5 7 Фиг. 8 tgf