Способ определения повреждения клеток грамотрицательных бактерий Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/02 C12N13/00 

113

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в промышленности для определения повреждения клеток на различных стадиях биотехнологического процесса.

Цель изобретения - повышение точности определения повреждения грам- отрицательных бактерий.

Пример 1. В качестве модели клеток с поврежденной внешней и неповрежденной внутренней (цитоплазма- тической) мембранами берут клетки, обработанные трилоном К (Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кисло ты) в концентрации 10 М, Известно, что трилон Б в указанной концентрации вызывает повреждение внешней мембраны клеток E.coli, не нарушая б.арьерных свойств их цитоплазмати- ческой мембраны.

Для определения повреждения клето грамотрйцательнмх бактерий Escheri- I chia coli К-12 трилоном Б исходную суспензию клеток дважды отмывают в дистиллированной воде с последуюпщм центрифугированием, помеш,ают в трис- -НС1 буфер (, рН 8,0) и делят на две части. Одну из них используют в качестве интактных клеток с неповрежденной внешней мембраной, а к дру добавляют трилон Б до конечной концентрации 10 М. Обе части инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Затем интактные и обработанные, клетки дважды отмывают в дистиллированной воде с последующим центрифугированием и ресуспендируют в воде и задают следующие параметры суспензии: оптическая плотность 0,13 (длина световой волны 540 нм, толщина кюветы 1 см), удельная электропро

водность 2,4-10 Ом М , рН 5,0.

Затем каждый образец (интактные и обработанные клетки) делят на две части. Одну из них используют в качестве контроля, а к другой добавляют додецилсульфат натрия в концент рации от 10 до 2.-10 М.

Додецилсульфат натрия (ДСН) широко используется в бактериологии для растворения изолированных клеточных стенок и цитоплазматических мембран с целью их последующего фракциониро- вания. В предлагаемом способе введение ДСН в концентрации от 10 до 2-10 М позволяет обнаружить повреждение внешней мембраны грамотр1ща

тельных бактерий, без нарушения целостности клеток. Действительно, при обработке этих бактерий с неповрежденной внешней мембраной ДСП в концентрации 2-10 Ми ниже не наблюдается нарушения барьерных свойств внутренней цитоплазматической мембраны, так как неповрежденная внешняя мембрана является дополнительным барьером для ДСН и защищает цитоплаз- матическую мембрану от повреждающего действия этого поверхностно-активного вещества. Если же внешняя мембрана клеток повреждена, то ДСН нарушает барьерную функцию цитоплазматической мембраны и значительно уменьшает величину отношения ЭОЭ в поле мегагерцевых и килогерцевых частот.

Электроориентационный эффект клеток определяют на устройстве для контроля физиологического состояния клеток,

С целью оптимального выбора часто ты, при которой определяют электро- ориентационньш эффект (ЭОЭ) в мегагерцевом диапазоне, вычисляют значения относительного изменения величины отношения jb ЭОЭ клеток с неповрежденной внешней мембраной в мегагерцевом диапазоне к таковой в кило- герцевом (1-0 Гц) диапазоне для разных частот мегагерцевого диапазона. Полученные данные представленье в табл,1.

Из табл.1 видно, что максимальное изменение относительной величины йр/|5о при добавлении додецилсульфата натрия имеет место в случае, если частота поля задается в области высокочастотного спада ЭОЭ, т,е. в пределах 10 -10 Гц. В этом случае

5

0

обеспечивается максимальная чувствительность при определении повреждения внешней мембрань клеток, шается точность анализа.

У клеток с неповрежденной внешней мембраной величина относительного изменения в при добавлении додецилсульфата- натрия также изменяется из-за изменения электрических свойств клеток при адсорбции его на их поверхности. Однако у неповрежденных клеток не превышает 20%, в то время как у клеток с поврежденной внешней мембраной составляет при концентрации ДСН 2-10 Ми мегагерцевой частоте 10 - 10 Гц 39 - 76%.

П р и м е р 2, Определяют повреждение бактериальных клеток Escheri- chia coli К-12 трилоном Б, Процедура и условия обработки клеток трилоном Б такие же, как в примере 1. Параметры клеточной суспензии, установка для проведения измерений и последовательность операций аналогичны примеру 1, кроме концентраций додецилсульфата

натрия, которая в этом примере равна -Д

10

chia coli MRE-600. Процедура и условия обработки трилоном Б такие же, как в примере 1, Параметры анализируемых суспензий следую цие; оптическая плотность 0,26, удельная электро проводность , рН А, 7.

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1,

Результаты приведены в табл.2, В примере 4 повреждение внешней мембраны клеток вяявляется при добав лении додецилсульфата натрия и соп10 М. Результаты приведены в табл.1 В этом примере также повреждения внешней мембраны клеток выявляются при добавлении додецилсульфата натрия 15 рово дается уменьшением относитель- и сопровозкдается уменьшением относи- ной величины (3 более чем на 30%, тельной величины Ьв//3е, при мегагерце- а именно в области высокочастотного

о

ВОЙ частоте поля в диапазоне 10 - Ю Гц на 30-41%.

П р и м е р 3. Определяют повреж- 20 дение бактериальных клеток Escheri- chia coli К-12 трилоном Б. Процедура и условия обработки клеток трилоном Б, а также параметры суспензии, установка и последовательность операций такие же, как и в примере 1, кроме .

спада электроориентационного эффекта примерно на 60%,

Таким образом, использование пред лагаемого способа определения повреж дения клеток грамотрицательнык бактерий обеспечивает увеличение точнос ти анализа за счет выявления повреж- 25 дения внешней мембраны клеточной

оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мембраны. Кроме

концентрации додецилсульфата натрия, которая в этом случае равна 1,5.10 М.

оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мембраны. Кроме

того, дополнительное увеличение точ- Результаты измерений приведены в - ности анализа достигается путем уве- табл,1.30 личения чувствительности (примерно

Как видно из табл.1, в этом приме- в 2 раза) измерений за счет опти- ре также выявляется повреждение внешней мембраны клеток при добавлении додецилсульфата натрия и сопровождаФормула. изобретения

мального выбора частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот (в области высокочастотного спада электроори- ется уменьшением относительной вели- ентационного эффекта), ЧИНЫДВ/Р|О при кегаг ерцевой частоте поля в диапазоне 10 -10 Гц на 34,5- 58,5%.

Добавление додецилсульфата натрия Способ определения повреждения в концентрации свыше М приво- клеток грамотрицательных бактерий, дит. к недопустимо большому увеличе- включающий помещение исследуемых нига удельной электропроводности сус- и эталонных образцов клеточных суспензии (до 10 Ом м и выше), пензий в переменное электрическое диапазон концентраций, позволяющих поле, определение величин электронадежно обнаружить повреждение внеш- юриентационного эффекта в поле мега- ней мембраны клеток,составляет от герцёвых и килогерцевых частот с пос- 10 до 210 М. ледующей оценкой по отношению измеИз примеров 1-3 (см.табл.1) видно, ренных величин, отличающий- что изменение fip//3., при введении до- с я тем, что, с целью повышения точ- децилсульфа/г а натрия в концентрации ности определения, перед помещением от 10 до на величину свыше в пол . в образцы вводят додецклсуль- 30Z служит надежньм критерием опреде- ф натрия в концентрации 10 - ления повреждения внешней мембраны , причем величину злектроори- грамотрицательных бактерий.

ентационного эффекта в поле мегагерП р и м е р 4, Определяют поврежентационного эффекта в поле мегагер ГС цевых частот определяют на частоте, дение трилоисм Б штамма грамотрица- находящейся в диапазоне высокочастот- тельяых Пактарий, а именно Escheri- ного спада эффекта.

chia coli MRE-600. Процедура и условия обработки трилоном Б такие же, как в примере 1, Параметры анализируемых суспензий следую цие; оптическая плотность 0,26, удельная электропроводность , рН А, 7.

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1,

Результаты приведены в табл.2, В примере 4 повреждение внешней мембраны клеток вяявляется при добавлении додецилсульфата натрия и сопрово дается уменьшением относитель- ной величины (3 более чем на 30%, а именно в области высокочастотного

спада электроориентационного эффекта примерно на 60%,

Таким образом, использование предлагаемого способа определения повреж-. дения клеток грамотрицательнык бактерий обеспечивает увеличение точности анализа за счет выявления повреж- дения внешней мембраны клеточной

оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мембраны. Кроме

Формула. изобретения

мального выбора частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот (в области высокочастотного спада электроори- ентационного эффекта),

ренных величин, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точ- ности определения, перед помещением в пол . в образцы вводят додецклсуль- ф натрия в концентрации 10 - , причем величину злектроори-

ентационного эффекта в поле мегагерТаблица 1

Изобретение относится к микробиологии, а именно к технике анализа повренщения бактериальных клеток. Целью изобретения является повышение точности определения повреждения грамотрицательных бактерий. Для этого к клеточной суспензии добавляют додецилсульфат натрия в концентрации от 10 до . Затем на нее накладывают переменное электрическое поле. Определяют отношение величин электросриентационно го эффекта в поле мегагерцевых и килогерцевых частот в пробе и в контроле. Уменьшение этого отношения в пробе в сравнении с контролем более чем на 30% является критерием определения повреждения внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Определение величины элек- троориентационного эффекта в поле мегагерцевых частот проводят на час тоте, находящейся в диапазоне высокочастотного спада эффекта. Использование способа обеспечивает увеличение точности анализа за счет выявле-- ния повреждения внешней мембраны клеточной оболочки при отсутствии повреждения цитоплазматической мембраны. Кроме того, дополнительное увеличение точности анализа достигается за счет оптимального выбора частоты поля в мегагерцевом диапазоне частот, 2 табл. с S СО 00 00 .4; ел