Способ подбора донора при трансплантации трупных тканей опорно-двигательного аппарата Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

Oi СП Изобретение относится к медицине лреимущественно к трансплантационной иммунологии, и предназначено для селекции донора при трансппантации трупной, в частности костной тк,ни. Известен способ подбора донора по антигенам гистосовместимо ти при пересадке органов и тканей серолог ческое типирование при помощи типируемых моноспецифических сывороток Однако данный способ требует доро гостоящих моноспецифических сывороток. Известен способ подбора донора при трансплантации трупных тканей опорно-двигательного аппарата путем определения in vitro бластной транс формации лимфоцитов периферической крови реципиента, при этом используется однонаправленная смешанная куль тура лимфоцитов (СКЛ), где лимфоциты донора обрабатьшаются митомицином С или облучается, что делает их неспособньп ш трансформироваться в бласты С 2 . Однако известный способ менее точен, а кроме того, возможное получение результатов реакции достигается только на 7 сут. Цель изобретения - повышение точности способа и сокращение времени селекции. Указанная цель достигается тем, что согласно способу подбора донора при трансплантации трупньк тканей опорно-двигательного аппарата путем определения in- vitro бластной трансформации лимфоцитов периферической крови реципиента на трансплантационные антигены донора, дополнительно определяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров. Способ осуществляется следующим образом. ; Для селекции донора используется принцип однонаправленной С1Ш, где в качестве стимулирующего агента используется лизат лимфоцитов .донора трупа, полученный однократным замора живанием лимфоцитов при -25 - (-35) без протектора в течение 1-12 мес и однократным оттаиванием-при комнат ной температуре в течение 1 ч. Селек ция донора проводится на основании учета бластной и макрофагапьной тран формации лимфоцитов периферической крови реципиента. 08 Пример 1. Фибринолизнуга кровь берут из сердца трупа до забора костной ткани в асептических условиях. Для получения лимфодитарной суспензии из трупной крови эритроциты осаждают 5% раствором желатина (на среде 199), которую добавляют в соотношении 1:2, Пробирки помещают под углом 45° на 40 мин при комнатной температуре, надосадочный слой снимают. Для осаждения лимфоцитов надосадок центрифугируют при 180 q 10 мин, к осадку добавляют для лизиса эритроциты 0,84% раствора хлористого аммония, выдерживают при 5 мин, с последующим центрифугированием при 180 q 8 мин. К осадку добавляют 6 - 8 мл среды 199, повторно центрифугируют 180 q 10 минут, полученный осадок ресуспендируют в среде 199, проводят подсчет лимфецитарных клеток в 1 мл в световом микроскопе в камере Горячева при увеличении в 200 раз (для обеспечения в дальнейшем оптимального соотношения стимулирующего агента отвечающих клеток). Полученную суспензию помещают в холодильную камеру при температуре -25°С на срок 1 - 12 мес. до момента селекции донора и трансплантации костной ткани. Замораживание и хранение лимфоцитарной суспензии проводят в запаянных ампулах, все манипуляции - в стерильных условиях. Кровь реципиента берут из локтевой вены натощак, 20,0 мл на гепарине. В дальнейшем возможна постановка СКЛ с чистой лимфоцитарной суспензией реципиента, либо с его цельной кровью. В первом случае вьщелениё лимфоцитов проводят по описанной методике. Во втором случае - в пробирки помещают цельную кровь в количестве 0,2 0,3 мл с подсчетом содержащихся в этом количестве лимфоцитов. В пробирки с культуральной средой (среда 199, Мгла, Зенкса) и аллогенной АН (1У) или ксеногенной (бычьей, телячьей, лошадиной сывороткой) помещают лимфоциты (кровь) реципиента и лизат лимфоцитов донора в пересчете на клетки в соотношении 1:3, культивируют культуру 72 ч при температуре 37°С. Параллельно ставят контроль (содержаш;ий только клетки реципиента) и реакцию с фитогемагглютинином. Учет - морфологический - подсчитывается процент бластов и микрофагов в каждой культуре (окраска по Рома311невскому, считается 300 клеток). Реакция ставится одновременно с несколь кими донорскими образцами после того, как клиницист произвел отбор приемлемых трансплантатов от трупов - доноров из банка консервирования по рент-генрвскому снимку и группам крови. В предлагаемом способе культивируют лимфоциты 72 ч, а в аналогах 168 ч, что сокращает время исследования на 96 ч. Применение предлагаемо го способа не предусматривает сохране ние жизнеспособности лимфоцитов донор и поэтому не требует дорогостоящей ап паратуры для программного их замораживания, что удешевляет и упрощает . процесс селекции. Учет степени не только бластной трансформации клеток, но и макрофагальной трансформации вводит дополнительный показатель для оценки совместимости, что повышает точность селекции донора, так как микрофаги являются необходимым звеном в иммунном ответе. Способ пригоден при трансплантации трупной костной ткани, которая по существующему поПроцент трансформированных клеток в СКЛ 8 ложению пересаживается в замороженном состоянии не ранее, чем через один месяц с момента заготовки. Способ может быть использован для изучения трансплантационного иммунитета в динамике после аллотрансплантации, так как хранение донорских лИмфоцитарных лизатов не представляет трудности. Способ апробирован на 58 образцах крови, из них 50 доноров, 5 реципиентов, 3 клинически здоровых лица (контроль). Пример 2. Больной Щ., диагноз: хронический остеомиелит проксимального отдела правой бедренной кости в стадии ремиссии, сгибательная контрактура в тазобедренном суставе, история болезни № 327233, группа крови А (11), резус положительный. Определены клинические показания к трансплантации костной ткани. Проведена селекция донора для реципиента Щ. по предлагаемому способу, ре- зультаты которой представлены в таблице.

СПОСОБ ПОДБОРА ДОНОРА ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНЫХ ТКАНЕЙ ОПОРНОДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА путем определения in vitro властной трансформации лимфицитов периферической крови реципиента на трансплантационные антигены донора, отличающийс я .тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени селекции, дополнительно определяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров. (Л

Блас- МакроБлас- МакроВлас- Макроты фаги ты фаги ты фаги

49

11

При селекции рекомендовано использовать для трансплантации костную ткань от донора 1, с которым в СКЛ минимальная реакция, и не использовать ткани донора 2, давшего максимальную и макрофагальную реакцию.

Результаты учета.

В нестимулированной культуре лимфоцитов (без добавления донорского антигена) бластов 1%, макрофагов 11%). Эта реакция служит контролем при даль45

20

17

нейшей селекции донора, как начальная точка отсчета. При реакции с фитогемагглютинином бластов 49%, макрофагов 2%, реакция показывает, что реак-г тивность лимфоцитов больного по отношению к митогену снижена. При реакции с лизатом лимфоцитов донора 1, группы крови О (I), бластная реакция 1%, макрофагов 13%, отнимаем эти показатели от контрольных - результат указывает, что в этом случае бластной реакции Блас- Макро- Блас- Мак- Блас- Макты фаги ты рофа- ты роги фагинет, a макрофагов - 2%. При- реакции с донором 2, группа крови А(11), блас тов 5%, макрофагов 45%, отнимаем конт рольные значения, т.е. в нестимулированной донорскими антигенами культуре лимфоцитов, в результате; бластная реакция 4%, макрофагальная реакция 34%. При реакции с донором 3, группа крови А (Ц), бластов 5%, макрофагов 17%, после сопоставления с контролемг бластов 4%, макрофагов 6%. При реакции с донором 4, группа крови А(11), бластов 3%, макрофагов 20%, после сопоставления с контролем: бластов 2%, макрофагов 9%, Наименьшую властную и макрофагальную реакции дает донор 1, вследствие чего он и рекомендован для данного реципиента. Наибольшую макрофагальную реакцию дает донор № 2, почему он должен быть отклонен. Д случае, если бы проводился выбор между донорами 2 и 3,давшими одинаковую бластную реакцию 4%, то предпочтение имеет донор 3, с которым макрофагальная реакция меньшая - 6%, а не донор 2, с которым макрофагальная реакция 34%. Таким образом, учет макрофагальной реакции повышает в два раза точность селекции донора. Повышение точности селекции достигается тем,что среди доноров, давши одинаковую бластную-реакцию, по макро фагальной трансформации можно выбрать более совместимого на основе подсчета количества макрофагов. Тот донор, который при равной бластной дает наимен шую макрофагальную реакцию будет наиболее совместимым. Сокращение времени селекции достигается тем, что вместо 7 сут в известном способе культивирование клеток производился в предлагаемом способе 3 сут в связи с тем, что макрофаги из мононуклеаров трансформируются раньше, чем бласты |Из лимфоцитов и максимальная трансформация макрофагов наблюдается через 72 ч. Большое количество макрофагов по сравнению с ничтожно малым количеством бластов, например 45 макрофагов по сравнению С 7 бластами, подсчитывается значительно легче под микроскопом, а вариабельность колеблется в диапазоне 2-45 при макрофагальной трансформаций, в пределах 2-7 для бластной трансформации. Точность способа обеспечивается также и тем, что при бластной трансформации встречаются переходные формы клеток, имеющие признаки общие для большого лимфоцита и малого бласта, например большое ядро, но без ядрышек внутри него, небольшой ободок цитоплазмы и др., что затрудняет классификацию клеток. При оценке макрофагальной трансформаций эта трудность не возникает,так как макрофаг на любой стадии трансформации имеет признаки, характерные только для этого вида клеток: эксцентрично расположиТельное ядро, пенистую цитоплазму, в которой имеется вакуоли и . включения (фагоцитированные частицы) .