Способ определения областной трансформации лимфоцитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 C12N5/02 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике иммунопатологических состояний, сопровождающихся нарушением бласттрансформации лимфоцитов периферической КрОЕИ.

Известен способ определения РБТЛ в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). Для этого готовили пул клеток-стимуляторов и пул отвечающих клеток. Клеточную (моно- нуклеарную) суспензию и в том, и в другом случаях получают стандартным способом седиментации разведенной гепаринизиро- ванной крови на градиенте Ficoll-Pogue(d 1,077 г/см3). После двукратного отмывания составляется клеточная суспензия в концентрации 1-106/мл. Далее возможны два варианта постановки реакции - сингенный и аллогенный. В случае сингенного варианта в качестве клеток-стимуляторов используются аутологичные лимфоциты, в случае ал- логенного варианта используются лимфоциты другого донора, либо смесь лимфоцитов, полученных от нес. менее чем 10 различных доноров.

Для блокады пролиферативного ответа клеток-стимуляторов по всех вариантах реакции их подвергают облучению в дозе 30 Гр, либо обрабатывают митомицином С в дозе 30-50 мкг/мл. После отмывания и ре- суспендирования в полной питательной среде в вышеуказанной концентрации ставят непосредственно СКЛ. Результат учитывается по уровню включения 3Н-тимидина в опыте в контроле 1.

Способ имеет следующие недостатки:

1.Ограниченная сфера применения способа, исчерпывающаяся в основном областью трансплантационной иммунологии.

2.Низкая точность способа, т.е. культивирование мононуклеаров на пластике без стимуляции в течение 7 дней индуцирует спонтанную бласт-трансформацию лимфоцитов и вследствие этого высокий уровень включения изотопа.

3.Длительность осуществления способа - 168 ч и необходимость создания условий для асептической работы.

4.Непригодность способа при проведении иммуноэпидемиологических исследований.

5.Отсутствие стандартизации исполнения способа.

(Л

Xi XI

XI

о

(Л

Н

Наиболее близок к предлагаемому способ определения РБТЛ периферической крови человека. Способ заключается в следующем: периферическую гиперанизиро- ванную кровь разводят питательной средой (199 или PPMJ--1640), либо в сбалансированном солевом растворе (р-р Хенкса без Са+ и , PBS) в соотношении 1:2 и наслаивают на плотностной градиент Ficoll-Pague (d- 1,077 г/см3).

После центрифугирования в режиме 250 д, 30 мин, 20°С собирают интерфазу, дважды отмывают и ресуспендируют в полной питательной среде (ППС) известного состава: среда PPMJ-1640+10% ЭТС + 2 мМ глютимина + буфер ГЭПЭС 2 мМ + гентами- цин 80 мкг/мл с концентрацией клеток 2х х106/мл. Суспензию мононуклеарных клеток в ППС раскапывают в лунки круглодон- ных планшет для иммунологических реакций, общий объем доводят до 0,2 мл. В лунках Контроль инкубируются чистые мо- нонуклеары, в лунках Опыт инкубируются мононуклеэры в смеси с митогенами - ФГА, Кон-А, МЛ в оптимальных митогенных концентрациях, подбираемых к каждой серии митогена индивидуально. Планшеты инкубируют в течение 72 ч при 37°С в присутствии 5%-ной С02. Работа проводится в стерильных условиях. За 4 ч до окончания инкубирования в лунки планшет добавляют 3Н-тимидин в дозе 1 мкк и в лунку, условия последующего инкубирования те же.

По окончании инкубирования содержимое лунок осаждается 12-канальным собирателем фракций - харвестером на стекловолоконыые фильтры с диаметром пор 2,5 мк Уровень остаточной радиоактивности на фильтрах, обусловленный включением 3Н-тимидииа в ядерные нуклеотидные последовательности трансформировавшихся лимфоцитов, просчитывается на счетчике / -излучения в толуольном сцинтиляторе (0,2 Г РОРОР, 5 мг РРО на 1 л толуола)

Результат реакции учитывается по трем параметрам: уровню включения изотопов в нестимулированные культуры (контроль), уровню включения изотопа в стимулированные мигогеном культуры (опыт) и индексу стимуляции (ИС)

,г ими/мин, опыт , по, .„,

ИС имп/мин . контроль х 10° 2

Способ имеет следующие недостатки:

1. Невысокая точность, так как использование искусственно полученных стимуляторов - митогенов дает мощный стимул к пролиферации и секреторной активности лимфоцитов, что в ситуации In vivo не наблюдается. Уже через 20-30 мин после добавления митогена в мононуклеарную суспензию образуются огромные конгломераты клеток, хорошо наблюдаемые в инвертированном микроскопе, обусловлен- 5 ные агглютинирующим действием митогенов, И, как следствие, значительный разброс данных, достигающий несколько десятков тысяч имп/мин.

2.Длительный срок постановки реак- 0 ции. С учетом получения окончательных результатов после 72 ч инкубирования - 96 ч.

3.Кроме того, получаемые результаты митоген-обусловленной пролиферации не всегда коррелируют с клиническим состоя5 нием больного. В этом случае информативность способа сводится к минимуму.

4.Механизм РБТЛ на митогены сводится к специфическому взаимодействию ФГА, либо Кон-А с соответствующими клеточны0 ми рецепторами и он не отражает той сферы межклеточных взаимодействий иммуноком- петентных клеток, которые обусловлены антигенами II класса гистосовместимости (HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ). Между тем по5 следнее обстоятельство имеет существенно большее значение при оценке иммунного статуса, нежели первое.

5.Практическая неприемлемость способа при проведении иммуноэпидемиологиче0 ских исследований, вследствие дороговизны способа, большой трудоемкости, полном отсутствии стандартизации и унификации его исполнения.

Цель изобретения - повышение точно5 сти и ускорение способа.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом, включающим в себя инку- бирование мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, причем в качест0 ве стимулятора используют культивируемую in vitro клеточную линию Rajl, предварительно обработанную 0,8-1,2% раствором параформальдегида при соотношении клетки Rajl: мононуклеарные клетки

5 равном 0,8-1,2:1, концентрации клеток 2-4х хЮ /мл и инкубацию проводят в течение 48-50 ч.

Клеточная линия Raji обычно применяется для определения количества циркули0 рующих иммунных комплексов с использованием радиоиммунологического метода 3.

Для тестирования РБТЛ на АГ клеток Rajl эта линия не использовалась.

5 Ниже приводится обоснование режимов способа.

Использование параформальдегида в диапазоне 0,8-1,2% обусловлено тем, что оптимальный эффект при обработке клеток

параформальдегидом с сохранением антигенных мембранных детерминант и клеточной структурированности достигается именно в этом диапазоне. Снижение концентрации ниже 0,8% сопровождается существенной потерей фиксирующих свойств параформальдегида, а увеличение этого процента выше 1,2% нежелательно, поскольку не повышает фиксирующего эффекта параформальдегида на клеточные мембраны.

Обработка клеток Raji параформальде- гидом в диапазонных концентрациях блокируют их способность к пролиферации как в процессе культивирования, так и при действии стимуляторов.

Это обстоятельство имеет большое значение, поскольку позволяет учитывать пролиферацию только мононуклеаров исследуемых лиц в предлагаемом способе.

Соотношением - клетки Rajl : мононук- меариые клетки является диапазон 0.8- 1,2:1. Отклонения в ту или иную сторону по количеству клеток Raji является нежелательным, поскольку нарушает сложившийся оптимум бластогенного ответа мононуклеаров периферической крови. Изменения указанного соотношения сопровождаются вариацией клеточной плотности на дне платика и, соответственно, изменением бласттранс- формации и пролиферации мононуклеаров, а также секреции ими цитокинов, что сказывается на точности предлагаемого способа. Использование в предлагаемом способе клеточной концентрации 2-4-10°/мл обусловлено следующими обстоятельствами. При постановке контролен, которыми сопровождается каждая реакция, раскапывание чистой мононуклеарной суспензии в объеме 100 мкл и с концентрацией ниже 2х х106/мл не создает достаточной плотности клеток в лунках плоскодонных пластин для иммунологических реакций и межклеточные контакты, таким образом, сводятся к минимуму.

В результате условия спонтанной РБТЛ становятся неоптимальными, что в свою очередь будет вносить существенную ошибку в конечный итог реакции

Увеличение же концентрации выше 4х хЮ /мл сопровождается пропорциональ- ным увеличением уровня включения Н-ти- мидина в сонтрольных лунках, что значительно изменяет результат реакции, вычисляемой по индексу стимуляции.

То же самое относится и ко времени инкубации - 48-50 ч: увеличивая это время, мы тем самым увеличиваем уровень включения изотопа в контроле, а уменьшение времени ниже 48 ч нежелательно, поскольку

оно будет недостаточным для запуска всех процессов РБТЛ в клеточной культуре,

Конкретные примеры осуществления способа.

Пример 1. Периферическую гепари- низированную кровь в стерильных условиях разводят в соотношении 1:2 питательной средой 199 и наслаивают на градиент Ficoll- Pague (d 1,077 г/см3). Центрифугируют в режиме 300 g в течение 30 мин при t 20°С). По окончании центрифугирования собирают интерфазное кольцо, трижды отливают в среде 199 и составляют клеточную суспензию в ППС известного состава: среда RPMJ-1640 + 10% ЭТС + 2 мм глютамина + буфер НЭПЭС 1 мл на 100 мл + гентамицин 80 мкг/мл в концентрации 2 10 /мл. Клетки Raji (Catalogue of Ceil Lihes, Hybridomas. 1985. ATCC, CC 86), культивируемые in vitro берут в реакции на 2-й день после пересева, когда они находятся в логарифмической фазе роста, отливают в ППС. составляют суспензию в концентрацией 2-10 /мл. Затем, после центрифугирования и удаления над- осадка, их помещают в 0,8%-ный раствор параформальдегида на PBS. Инкубируют 20 мин в холодильнике. По окончании инкубации трижды отмывают в PBS и ресуспен- дируют в ППС с тем, чтобы сохранилась упомянутая клеточная концентрация.

В лунки плоскодонных пластин для иммунологических реакций раскапывают по 100 мкл мононуклеаров исследуемых лиц и клетки Raji в смеси (опыт, соотношение 1:1), а также чистые мононуклеары без клеток Raji (контроль). Общий объем реакционной смеси составляет 200 мкл. Каждую реакцию проводят в трех параллельных лунках. Плашки инкубируют при 37°С в присутствии 5%-ной С02 в течение 48 ч. За 4,ч до окончания культивирования в лунки добавляют 0,5 мкКи Н-тимидина и затем содержимое лунок осаждается на фильтры 12-канальным собирателем фракций. Уровень остаточной радиоактивности на фильтрах фиксировали на счетчике/ -излучения (Mark-Ill) в толуоль- ном сцинтиляторе известного состава. Индекс стимуляции (ИС) просчитывали по формуле

ИС

имп/мин.опыт

имп/мин , контроль где и в числителе и,в знаменателе учитываются средние арифметические трех параллельных лунок для каждого измерения,

В габл.1 приведены данные, полученные на 11 здоровых донорах.

Обсчет результатов проводили стандартными методами вариационной статистики.

Пример 2. Способ проводили аналогично примеру 1 с той лишь разницей, что клетки Raji обрабатывали 1,2%-ным пара- формальдегидом, концентрация клеток составила 4-10 /мл, а инкубацию проводили 50ч.

Результаты представлены в табл.2. Как видно из таблиц, результаты незначительно отличаются один от другого, что позволяет сделать вывод о практической их идентичности,

Пример 3. Последовательность манипуляции соответствует приведенной в примере 1, при этом используют 0,8%-ный раствор параформальдегида, количество отвечающих мононуклеарных клеток - 2х х106/мл, время инкубации-48 ч, количество клеток Rajl 1,6 106/мл, т.е. соотношение клетки Raji : мононуклеарные клетки составляют 0,8:1.

Результаты представлены в табл.3. Пример 4. Способ осуществлялся аналогично приведенному в примере 1. Используют 1,2% параформальдегида. Количество отвечающих клеток - моно- нуклеаров 2 106/мл. время инкубации - 50ч.

Количество клеток Raji составило 2,4х х106/мл, т.е. соотношение Rajl: мононукле- ары имеет вид 1,2:1.

Результаты представлены в табл.4. Как видно из представленных таблицах данных, результаты определения РБТЛ на антигены клеток Raji варьируют в незначительных предепах при использовании соотношения клеток Raji: мононуклеары от 0,8:1 до 1,2:1. Ошибка опыта колеблется от 8 до 8,5% по ИС, что не вносит существенных изменений в -лочность способа и таким образом являет.я допустимой при практическом использовании способа.

Для сравнения способа по прототипу с предлагаемым для подтверждения большей точности последнего и сокращения времени проведения реакций были проведены параллельные эксперименты РБТЛ на антигены клеток Rajl и ФГА в митогенной дозе 30 мкг/мл.

Условия проведения реакций отражены в примере 1 и прототипе. Результаты представлены в .5.

В таблице представлены средняя арифметическая № ошибка средней арифметической т, а также ошибка опыта Р

-glOO%.

Как видно из приведенных данных, предлагаемый способ обладает большей точностью (в среднем в 7. р.эза) по сравнению с прототипом, я также сокращает время

проведения реакции на 24 ч. Причем повышение точности касается как абсолютного включения 3Н-тимидина в опытных лунках, так и вычисления индекса стимуляции.

Ошибка опыта для первого и второго случаев в РБТЛ на антигены клеток Rajl составляет, соответственно, 8,5 и 9,5%, а в РБТЛ на ФГА - 17,8 и 19,6%. Повышение точности предлагаемого способа достигает0 ся также за счет следующих элементов реакции.

Снижение времени инкубирования до 48 ч влечет за собой снижение уровня включения изотопа в контрольных лунках (спон5 танная бласттрансформация), этот уровень колеблется в пределах нескольких сот импульсов в мин, что в свою очередь уменьшает разброс этих данных и снижает ошибку при вычислении индекса стимуляции.

0 Использование строго стандартизированной клеточной культуры позволяет в опытных лунках свести к минимуму разброс данных, что также повышает точность способа, как при учете уровня абсолютного

5 включения изотопа в опыте, так и при вычислении индекса стимуляции.

Все приведенные аргументы теряют свою силу при проведении РБТЛ на ФГА, поскольку увеличение времени инкубирова0 ния до 72 часов пропорционально увеличивает уровень включения изотопа в спонтанной бласттрансформации, а также в опыте, когда клетки, получая мощный стимул в виде ФГА, включают изотоп в десятки

5 тысяч имп/мин, а это. в свою очередь, увеличивая разброс данных, резко снижает точность прототипа, как при учете абсолютного уровня включения-изотопа в опыте, так и при вычислении индекса стимуляции (табли0 ца Nfc 5).

Предлагаемый способ был апробирован в экспедиционных условиях при проведении иммуноэпидемиологических исследований на металлургическом комбинате в

5 Нижнем Тагиле. Проведенная работа показала полную пригодность способа в экспе- диционных условиях, результаты тестирования РБТЛ на антигены клеток Rajl 24 рабочих комбината дали индекс стимуля0 ции: ИС 8±0,74.

Проведены также исследования по определению возможности сохранения антигенных свойств клеток Rajl при длительном хранении. Для этого клетки извлекались из

5 культуры, обрабатывались 1%-ным пара- Формальдегидом и оставлялись на хранение в нем же при t 4°C. Результаты тестирования РБТЛ на антигены клеток Rajl. хранившихся 2 месяца в указанном режиме, показали полное сохранение ими антигенных свойств, индекс стимуляции при тестировании на 5 донорах составил 4;ГО,8. Этот факт открывает возможность, заготовки и длительного хранения стимуляторов при проведении иммуноэпидемиологических исследований.

Таким образом, предлагаемый способ определения РБТЛ на антигены клеток Rajl обладает, по сравнению с прототипом, большей точностью (в 2 раза), сокращением времени проведения реакции на 24 ч.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет строго стандартизировать условия проведения реакции, поскольку длительно пассируемая In vitro культура Rajl обладает моноклональными свойствами, экспрессия мембранных АГ, на которые идет ответ, достигает стабильного уровня и обработка па- раформальдегидом фиксирует этот стабильный уровень.

Полученные данные по длительному хранению клеток Raji открывают возможность выпуска стандартизированных препаратов Raji, что, у.читывая скудость советского рынка, является немаловажным фактором в обогащении методического арсенала учреждения иммунологического профиля.

Формула изобретения Способ определения бластной трансформации лимфоцитов, включающий инкубирование мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, отличэющий- с я тем. что. с целью повышения точности и ускорения способа, в качестве стимулятора используют клеточную линию Raji, обработанную предварительно 0,8-1,2%-ным раствором параформальдегида, при этом берут клетки Raji и мононуклеарные клетки в соотно- 0 шении 0,8-1,2:1 и концентрации клеток 2-4 106/мл, инкубацию проводят в течение 48-50 ч.

0

5

Изобретение относится к клинической иммунологии. Цель - повышение точности и ускорение способа. Способ определения бластной трансформации осуществляют путем инкубации мононуклеарных клеток в присутствии стимулятора, в качестве которого используют культивируемую in vitro клеточную линию Raji, обработанную предварительно 0,8-1,2% раствором парафор- мальдегида при соотношении клетки Raji: мононуклеарные клетки равном 0,8-1,2:1 и концентрации клеток 2-4-10 /м и инкубацию проводят в течение 48-50 часов. Предложенный способ определения РБТЛ сокращает время и увеличивает точность анализа. 5 табл.

М - средняя арифметическая, а - стандартное отклонение, m - ошибка

средней, Р - ошибка опыта.

. Таблица 2

Т а б л и ц а 1

Редактор

Техред М.Моргентал

Заказ 4120ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Продолжение табл. 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Корректор Н. Ревская